第三章 固定化酶催化反应动力学1
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第3章 固定化酶催化反应过程动力学
此时，对此微分方程需要根据不同酶动力学特征进行求解。 当酶反应动力学方程为一级反应动力学时， rS =
r ) R ，其中φ＝ R 3 r sinh(3φ )
rmax CS ，可解得： Km
CS = CS 0
R sinh(3φ
rmax 。 Km iD
当酶反应动力学方程为零级反应动力学时， rS = rmax ，可解得：
φ1
，其中φ1＝L
rmax Km iD
当酶反应动力学方程为零级反应动力学时，可解得：
对于球形固定化酶，η0＝1 − （
Rc 3 ） ， R L 对于膜片状固定化酶，η0 = 1 − c 。 L
当酶反应动力学方程符合 M－M 方程时，无解析解，仅有数值解。 15、梯勒模数φ（Thiele modulus）是表示固定化酶内扩散影响的重要无因次模 型参数，其物理意义为 φ＝ 表面浓度下的反应速率 。φ值越大，表明内扩散速率 内扩散速率
游离酶 空间效应 本征速率和动力学参数 改变的本征速率和动力学参数 分配效应 固有速率和动力学参数 扩散效应 宏观速率和动力学参数 固定化酶
4、固定化酶催化反应外扩散效应。固定化酶与溶液中底物反应过程包括三步： （1）底物从液相主体扩散到固定化酶表面； （2）底物在固定化酶表面进行反应； （3）产物从固定化酶表面扩散到液相主体。其中酶催化反应速率可由 M－M 方 程 表 示 RSi =
CSi Km r ，＝ K ，定义Da= max CS 0 CS 0 k L aCS 0
2 CS ⇒ CS +（K＋Da-1） CS − K＝0 K + CS
1 − CS＝Da 可得：
−a ± a 2 + 4 K 解一元二次方程可得： CS＝ ，其中a = K＋Da-1 2 当 a>0 时，取“＋”号，当 a<0 时，取“-”号。 （2）有效因子η E 求解。 由定义可知：ηE = 因此， RSi = RS 0ηE
酶催化反应动力学
适pH.
在不同pH条件下进行某种酶促化学反应， 然后将所测得的酶促反应速度相对于pH 来作图，即可得到钟罩形曲线。
图 pH对酶活力的影响
• 各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH， 因此最适pH是酶的特性之一。 • 但是酶的最适pH并不是一个常数，它受诸 如底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等 众多因素的影响，因此只有在一定条件下 最适pH才有意义。
这是由于温度升高，虽然可加速酶的催化反应速率， 同时也加快了酶的热失活速率。
• 只有在某一温度条件下， 酶促化学反应速度达到 最大值，通常把这个温 度称为酶促化学反应的 最适温度(optimum temperature)。
• 在一定条件下每种酶都 有其催化反应的最适温 度。 图 温度对酶促反应速度的影响
• 如，蛋白酶只能催化蛋白质的水解，酯酶只催化 酯类的水解，而淀粉酶只能催化淀粉的水解。若 用一般催化剂，对作用物的要求就不那么严格， 以上三类物质都可以在酸或碱的催化下水解。
绝对专一性
酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一 的反应，生成一种特定结构的产物 。
如：
NH2 O C NH2 尿素 NH CH3 O C NH2 甲基尿素 + H2O 脲酶 + H2O 脲酶 2NH3 + CO2
酶催化反应动力学
1. 酶催化作用特性
酶和一般催化剂的共性
• 用量少而催化效率高；在反应中其本身不被消耗， 极少量就可大大加速化学反应的进行。
• 它能够改变化学反应的速度，但不能改变化学反 应平衡。缩短平衡到达的时间，而不改变反应的 平衡点。它对化学反应正逆两个方向的催化作用 是相同的。
• 酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活 化能，从而加速反应的进行。
酶催化反应机理与动力学分析
酶催化反应机理与动力学分析酶是一种生物催化剂，其存在速度远快于非酶催化的化学反应，而且能够高度选择性地催化特定反应。
酶催化反应机理和动力学分析是当前生物技术与医药学领域的热门研究方向之一。
一、酶催化反应机理酶催化反应的机理可以分为两个阶段：反应前期和反应后期。
反应前期包括酶与底物结合、酶底物复合物的构成、酶底物复合物向过渡态的转化等，在此期间，酶的底物亲和力是至关重要的。
底物在进入酶分子内部前，需要先经过酶的活性位点，同时酶通过某些氨基酸残基与底物形成的亚结构使得中间产物更有利于进一步反应。
反应后期是逐步分离酶与产物、催化过程的结束。
在酶催化反应过程中，有关酶和底物结合的问题是最基本的。
酶和底物的结合解决了基本的反应前期问题。
酶的活性结构上的微细构造可以使酶和底物发生拟吸附，从而加速活性物质的靶向作用，而底物分子的局部作用，也可以促使中间产物更趋于产生。
化学反应的速度还会受到其他条件的影响。
二、酶催化反应动力学酶催化反应的动力学是对反应速率的研究。
酶催化反应速度受到各种因素的影响，包括温度、pH值、底物浓度和酶浓度等。
底物浓度是影响酶催化动力学的关键因素。
在低浓度条件下，酶过程的速率与底物浓度的关系呈指数关系；而在高浓度条件下，速率与底物浓度的关系则将趋于平稳。
反应的速率也跟温度有着密切的关系。
在常温下，酶美中心的活性结构是在水分子中拥有最佳亲和力的，因此当温度过低时，酶的活性会下降。
同时，过高的温度则会造成酶分子氨基酸残基的变性而导致酶失去催化活性。
除了温度和底物浓度外，pH值也会直接影响到酶催化反应的速率。
不同酶的最适pH值范围不相同，某些酶在低pH值下尤其活跃。
三、总结酶催化反应机理和动力学分析是当今生物技术和医药学领域的热门研究方向之一。
酶催化的反应机理研究对于揭示生物化学过程奠定了基础；而酶催化反应动力学则为生命科学研究提供基本方法和技术工具，同时也为药物研发和生物工程开发提供了指引。
第三章 固定化酶催化反应过程(wfw)
界面内侧的底物浓 度为Csg，界面外侧的 底物浓度为Csi,则分配 系数K为： K=Csg／Csi
Cso—液相主体的浓度， Csi——外扩散造成的界 面外侧浓度。 Csg—由分配效应造成 的微环境的底物浓度。
静电效应的影响表现在对Km值的影响。 通常酶可能被固定在带电荷的酶膜上或载体上。底物 在溶液中也会离子化，这样在固定载体上的电荷和移动 的离子之间，常会发生静电交互作用，产生分配效应。 使底物或产物浓度之间出现不均匀分布。
(生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统, 可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质 )
• 固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种, 将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试 纸上,只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检 测出尿样的葡萄糖是否超标,从而断定该妇女是有血糖、 尿糖还是妊娠。 • 生化分析中最常用的H电极也绝大多数是固定化酶产品:固 定化青霉素酶电极 • 重组海洛因酯酶传感器检测违禁药品 • 用聚丙烯酰胺凝胶包埋细菌电极可快速测定污水中的BOD。
微囊型
特点:固定化酶颗粒一般为直径 是几微米到几百微米的球状体，比 网格型颗粒小得多,有利于底物和 产物扩散;半透膜能阻止蛋白质分 子渗漏和进入，注入体内既可避免 引起免疫过敏反应，也可使酶免遭 蛋白水解酶的降解，具有较大的医 学价值.但反应条件要求高，制备成 本也高。
制备方法:界面沉淀法、界 面聚合法、二级乳化法和脂质 体包埋法等.
根据Boltzman分配定律，分配系数K为
ZFU K exp( ) RT
Z--底物分子所带电荷；F--法拉第常数；U--静电电势。 当载体与底物所带电荷相反时，即Z为正、 U为负 时，K大于1; 当两者带有相同电荷时，则K小于1。
第三章固定化酶
活
化 载
辅基
体
连接臂
载体的选择
没有特异性吸附 具有多孔性 有适合引入配基的官能团 化学稳定性 具有适当的机械强度等。
目前使用的载体主要是琼脂糖，此外还有纤维素、玻 璃珠及合成高分子材料等。
4、化学结合法－共价结合法
原理: 酶蛋白分子上的功能基
团（酶的非活性必需侧 链基团）和固相支持物
表面上的反应基团之间 形成共价键，因而将酶 固定在支持物上。
最常用的偶联基团： -NH2、COOH、-SH、-OH、酚 基、咪唑基
两种固定方式
1. 将载体有关基团 活化，然 后此活泼基团再与酶分子上 某一基团反应形成共价键。
第三章
酶的固定化
第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学
对于现代工业来说，酶不是一种理想的 催化剂
绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏 感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进 行分批生产。
交联法常与吸附法结合使用，或者与 包埋法配合，目的是使酶紧紧地结合 于载体上。
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。
固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液pH和离 子强度、温度和反应时间之间的平衡。
例：木瓜蛋白酶在0.2％酶蛋白浓度、2.3％戊 二醛、pH5.2-7.2、0℃下交联24h，可形成固 定化酶。
定向固定化方法
① 酶和抗体的亲和连接 ② 酶通过糖基部分固定化 ③ 酶和金属离子连接 ④ 分子生物学方法 基因融合法
翻译后修饰法 特定位点基因突变法
第二节 辅酶的固定方法
原因
第三章 酶催化反应动力学
32
33
二、影响酶催化作用的因素
34
2.1 底物浓度的影响
底物浓度是决定酶催化反应速度的主要因素。在其他条件不变的情况下， 酶催化反应速度与底物浓度的关系如图。
35
2.2 酶浓度的影响
在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度 成正比，它们之间的关系可以用下式表示：
36
2.3 温度对反应速度的影响
When [S] << KM, the enzyme is largely unbound and [E]≈[E]T
27
S+E
kcat/KM
E+P
When [S] << KM, kcat/KM is the rate constant for the interaction of E and S. kcat/KM can be used as a measure of catalytic efficiency.
24
25
（3）. Kcat/Km
Kcat:反映的是一种酶被底物饱和时的 酶性质。在低[S]下， Kcat则失去了意义。 当[s]<<km， Kcat/Km是一个比较酶催 化效率较好的一个动力学参数。
26
（3）酶的催化效率:kcat/KM 评价
kcat/KM通常被看做酶的效率，Kcat越大或是Km越小，都使得Kcat/Km越 大 在生理条件下，大多数的酶不被底物所饱和，且底物浓度与Km相比要小 的多 。
酶工程与蛋白质工程
第三章 酶催化反应动力学
1
本节主要内容
一、酶催化反应动力学 二、影响酶催化作用的因素 三、酶活测定
2
动力学研究的主要目的
酶催化反应动力学概况课件
非竞争性抑制剂
与酶的活性中心以外的位点结合，影响酶与底物的结合。
反竞争性抑制剂
既不与底物也不与酶直接结合，而是通过改变酶的构象来影响其 催化活性。
酶促反应的激活剂
01
02
有机小分子
金属离子
03 蛋白质
抑制剂与激活剂的应用
药物研发 生物工程 化学工业
05
酶催化反应的动力学应 用
CHAPTER
酶催化反应在生物工程中的应用
影响因素
速率常数受到多种因素的影响， 包括温度、pH值、离子强度、底 物浓度、酶浓度等。
酶的活性单位与测定方法
活性单位定义
1
常用活性单位
2
测定方法
3
酶促反应的速率常数与底物浓度关系
米氏方程
Km值的意义
04
酶促反应的抑制剂与激 活剂
CHAPTER
酶促反应的抑制剂
竞争性抑制剂
与底物竞争酶的活性中心，从而降低酶的催化效率。
02
酶催化反应的速率方程
CHAPTER
米氏方程
米氏方程是描述酶催化反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为v=Vmax[S]/ （Km+[S]），其中v代表反应速率，Vmax代表最大反应速率，[S]代表底物浓度， Km代表米氏常数。
米氏方程是酶动力学中的基本方程之一，通过它可以研究酶催化反应的特性，如 最大反应速率、底物浓度等对反应速率的影响。
初始速率法
初始速率法可以避免产物抑制和底物 抑制等效应对实验结果的影响，因此 被广泛应用于酶促反应的动力学研究。
酶促反应的速率曲线
03
酶促反应的速率常数与 酶活性
CHAPTER
酶促反应的速率常数
定义
与酶的活性中心以外的位点结合，影响酶与底物的结合。
反竞争性抑制剂
既不与底物也不与酶直接结合，而是通过改变酶的构象来影响其 催化活性。
酶促反应的激活剂
01
02
有机小分子
金属离子
03 蛋白质
抑制剂与激活剂的应用
药物研发 生物工程 化学工业
05
酶催化反应的动力学应 用
CHAPTER
酶催化反应在生物工程中的应用
影响因素
速率常数受到多种因素的影响， 包括温度、pH值、离子强度、底 物浓度、酶浓度等。
酶的活性单位与测定方法
活性单位定义
1
常用活性单位
2
测定方法
3
酶促反应的速率常数与底物浓度关系
米氏方程
Km值的意义
04
酶促反应的抑制剂与激 活剂
CHAPTER
酶促反应的抑制剂
竞争性抑制剂
与底物竞争酶的活性中心，从而降低酶的催化效率。
02
酶催化反应的速率方程
CHAPTER
米氏方程
米氏方程是描述酶催化反应速率与底物浓度关系的方程，其形式为v=Vmax[S]/ （Km+[S]），其中v代表反应速率，Vmax代表最大反应速率，[S]代表底物浓度， Km代表米氏常数。
米氏方程是酶动力学中的基本方程之一，通过它可以研究酶催化反应的特性，如 最大反应速率、底物浓度等对反应速率的影响。
初始速率法
初始速率法可以避免产物抑制和底物 抑制等效应对实验结果的影响，因此 被广泛应用于酶促反应的动力学研究。
酶促反应的速率曲线
03
酶促反应的速率常数与 酶活性
CHAPTER
酶促反应的速率常数
定义
第3章 固定化酶催化反应动力学
3.1 固定化酶的制备方法
交联法
交联法：它是用双功能试剂使酶与酶之间交联的固定化方 法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，不同 的是它不使用载体。
交联剂有：戊二醛（形成希夫碱） 异氰酸脂（形成肽键） 双重氮联苯胺（发生重氮偶合反应） 此法反应条件比较激烈，酶活回收率低。
3.1 固定化酶的制备方法
Rsi，可采用两种方法求出：
3.3 外扩散限制效应
3.3.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
( 1 )由 C si值确定 Rsi。因为根据式（ 3－8），可得出下式： rmax Csi Cs 0 − Csi = ⋅ k L a Km + Csi ( 3−13 ) 引入 C s＝ C si / C s 0， = K m / Cs 0 K 并定义 Da = r max ( 3 − 14 ) k L ⋅ a ⋅ C s0 Cs K + C s ( 3−15 )
3.3 外扩散限制效应
3.3.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
假定对一非带电的固定化酶，其外表面上的反应速率符合 M-M方程，即：
r max⋅ Csi (3 − 6) Rsi = Km + Csi 式中：Rsi — 底物在固定化酶外表面 上的消耗速率，又称 宏观反应速率， mol /( L ⋅ s ) Csi — 底物在固定化酶外表面 上的浓度，mol / L。
3.3 外扩散限制效应
3.3.1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
定态条件下，应存在Rsi=Rsd，即
r max⋅ Csi ( 3 − 8) kLa ⋅ (Cs 0 − Csi) = Km + Csi
该式表示了在定态条件下，外扩散传质速率等于在固定化酶外表面上底物反应 速率。 (1) 当外扩散传质速率很快，而固定化酶外表面反应速率相对较慢时, 并成为该反应过程速率的控制步骤时，酶的外表面上底物浓度应为 液相主 体溶液的浓度，即为CS0，此时的反应速率应为：
酶促反应动力学
1、米氏方程 2、操作参数对酶促反应的影响 3、抑制剂对酶促反应速率的影响 三、多底物酶促反应动力学
均相酶催化反应:
指酶与反应物系同处液相的酶催化 反应. 因此不存在相间的物质传递.
均相酶催化反应动力学所描述的反应 速率与反应物系的基本关系,反映了该 反应过程的本征动力学关系,而且酶与 反应物的反应是分子水平上的反应.
1925年，Briggs和Haldane对米氏方程的推导作了 一项很重要的修正。他们认为，当k+2＞k-1时米氏 假设中的快速平衡（ripid equilibrium）不一定能够 成立，所以，不能用上述“平衡学说”推导。即当 从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物 的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。 他们提出了“拟稳态”假设，认为由于反应体系中 底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时 所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系 中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随 时间而变化。
第三章 酶促反应动力学
学习目的： 1、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。 2、掌握0、1级和米氏酶促反应动力学及应用原理； 3、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征； 4、具备固定化酶反应中的过程分析能力和内外不同
阶段的固定化酶动力学的应用能力； 5、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学
CS
CS Km
复合态酶浓度 游离态酶浓度
⑤动力学参数的求取
将米氏方程线性化，用作图法求取动力 学参数rmax（或k+2）和Km值。
k1, k2 ——各步反应的速率常数；
（3-5） （3-6） （3-7）
如果A的初始浓度为a0， B和C的初始浓度为0，
并且a+b+c=a0，则可求得：
均相酶催化反应:
指酶与反应物系同处液相的酶催化 反应. 因此不存在相间的物质传递.
均相酶催化反应动力学所描述的反应 速率与反应物系的基本关系,反映了该 反应过程的本征动力学关系,而且酶与 反应物的反应是分子水平上的反应.
1925年，Briggs和Haldane对米氏方程的推导作了 一项很重要的修正。他们认为，当k+2＞k-1时米氏 假设中的快速平衡（ripid equilibrium）不一定能够 成立，所以，不能用上述“平衡学说”推导。即当 从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物 的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。 他们提出了“拟稳态”假设，认为由于反应体系中 底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时 所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系 中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随 时间而变化。
第三章 酶促反应动力学
学习目的： 1、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。 2、掌握0、1级和米氏酶促反应动力学及应用原理； 3、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征； 4、具备固定化酶反应中的过程分析能力和内外不同
阶段的固定化酶动力学的应用能力； 5、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学
CS
CS Km
复合态酶浓度 游离态酶浓度
⑤动力学参数的求取
将米氏方程线性化，用作图法求取动力 学参数rmax（或k+2）和Km值。
k1, k2 ——各步反应的速率常数；
（3-5） （3-6） （3-7）
如果A的初始浓度为a0， B和C的初始浓度为0，
并且a+b+c=a0，则可求得：
第三章 酶促反应动力学(简)-2
内扩散阻力发生在多孔性固定化酶载体的 内部，它是底物传递到固定化酶内部的酶 部位时的一种扩散限制效应。内扩散限制 效应往往与酶催化的化学反应同时进行。 由于微环境内的化学反应造成底物的消耗 和产物的积累，形成浓度的不均匀性。而 在微环境内底物的消耗和产物的积累程度， 也常和这些物质的分子量大小有关。
二、固定化酶促反应中的过程分析
固定化酶促反应过程中，需考虑扩散传质 与催化反应的相互影响，注意外部与内部 扩散的不同传质方式。 内部扩散与催化反应有时是同时进行的， 两者相互影响。外扩散通常先于反应。应 区别对待。
为集中研究外扩散限制效应，常选择液体不能渗透的无 电活性的固定化酶膜或固定化酶颗粒作为研究的模型。
rmax [ S ] Rsi = = rs 0 (2 − 4 − 4) K m + [S ]
1 外扩散速率对酶催化反应速率的限制
(2) 当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应速率很快，此时外扩散速率 成为反应的控制步骤。固定化酶外表面上底物浓度趋于零。 故：
扩散最大速率
Rsi = k L a[ S ] = rd (2 − 4 − 5)
3.3 固定化酶促反应动力学
一、 固定化酶催化的动力学特征
1 影响固定化酶动力学的因素 2 固定化酶反应动力学
二、固定化酶促反应中的过程分析
1 外扩散限制对酶催化反应速率的限制 2 内扩散限制效应
酶的固定化，不仅使酶的活性发生了变 化，而且由于固定化酶的引入，反应体系 变为多相体系，例如液-固体系、气-液-固 体系等。因此在研究固定化酶催化反应动 力学时，不仅要考虑酶催化反应的本征动 力学规律，更要研究反应物的质量传递规 律，研究物质的质量传递对酶催化反应过 程的影响。建立起同时包括物质传质速率 和催化反应速率的动力学方程；这种方程 一般称为宏观动力学方程。它是设计固定 化酶催化反应器和确定其操作条件的理论 基础。
酶催化反应机理与动力学
酶催化反应机理与动力学酶是一种生物催化剂，可以加速生物体内大量的反应。
其作用原理是更改反应活化能，从而改变反应速度。
酶催化反应机理和动力学的研究，对于理解生命现象和开发生物制品具有重要意义。
酶催化反应机理酶和它所催化的反应之间具有高度特异性。
酶能够选择性地与它的底物或反应物结合，形成酶-底物复合物。
在这种状态下，酶能够更改底物的电子云密度和空间结构，从而改变反应速率。
在酶-底物复合物形成之后，发生了酶活化。
酶活化机制通常与这个复合物的结构和构象变化有关。
酶的结构和构象可以在空间中调整，以适应底物的分子大小和构象。
这样，酶可以保持复合物的相对稳定性，并在反应结束后解离复合物，释放产品。
酶催化可以通过两种基本的机制实现。
一种是物理催化机制，另一种是化学催化机制。
通过物理催化机制，酶可以影响底物分子之间的相互作用，以增加它们之间发生反应的可能性。
通过化学催化机制，酶可以调整底物分子的电子结构，从而使它们更容易发生反应。
酶催化反应动力学酶催化反应动力学是研究酶催化作用的动力学参数，例如反应速率和物质浓度的变化。
酶反应速率是酶作用强度和催化反应条件（如底物激活能、温度和pH）的函数。
酶催化反应动力学可以通过酶反应速率方程来描述。
酶反应速率方程基于酶和底物的浓度，以及温度和pH等因素。
通常情况下，酶反应速率方程可以表示为：v = k [E][S]其中，v 是反应速率，[E] 是酶的浓度，[S] 是底物的浓度，k是反应常数。
酶反应速率方程表明，酶催化速率与酶和底物的浓度有关。
当酶的浓度增加或者底物的浓度降低时，酶反应速率也会增加。
除浓度外，反应条件对酶反应动力学也有重要影响。
例如，温度影响酶和底物之间的自由能变化和复合物的构型。
pH可以影响酶的电荷状态和酶催化剂的亲和力等特性。
这些因素都是在开发新的药物和生物工艺制品时需要考虑的关键因素。
结论酶催化反应机理和动力学是生物化学和工业生命科学中的重要领域。
对酶催化反应的深入研究，可以为药物开发和生物制品制造提供基本知识。
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Covalent bond
Cross linkage
2020/8/15
Investme nt
Microcapsul e
◆ ◆
（四）酶的固定化方法
１、吸附法(Adsorption)
◆吸附法有物理吸附、离子吸附及螯合或金属结合法。 常用的载体如淀粉、谷蛋白等有机类载体，活性炭、多孔玻璃、 硅胶等无机类载体，大孔型的合成树脂，陶瓷以及纤维素衍生 物类。阴、阳离子交换剂 影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素
Enzyme
Synthesis of IMER using glutaraldehyde method
Ye, M. L. et al. Electrophoresis, 2005, 25:1319-1326
（四）酶的固定化方法 常用的共价键合方法
2、二琥珀酰亚胺碳酸酯法(DSC)
2020/8/15
（四）酶的固定化方法 常用的共价键合方法
3、β-羟胺形式 (β-hydroxylamine formation)
O
(CH3O)3SiOCH2CH CH2 Matrix OH
Matrix
O Si
O O CH2CH CH2
Enzyme
NH2
Matrix
OH H
O Si O CH2CH N
Enzyme
The synthesis of the IMER through β-hydroxylamine Marle I. , et al. fJo. rCmhraotmioantogra. 1992, A, 604:185-196
生化工程电子教案
化学与生命科学学院
（一）固定化酶的应用 1、食品工业
影响：出汁率低；果汁浊， 黏度高，易出现沉淀。
■果汁生产，果胶存在，提产及去浊澄清问题？
固定化果胶酶
■啤酒、果蔬汁等 贮藏 浑浊或沉淀现象？
原因:酚类与蛋白质生成大分子物质
方法:漆酶
漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶
silica O Si (CH2)3 NH2 Enzyme
O O
NOC
O ON
O
O
silica
O Si
O
(CH2)3
H NCON
O O
NH2
silica
O Si
(CH2)3
H
H
NCN
O
Enzyme
D-Glucosamine NH2
silica
O Si
(CH2)3
H
H
NCN
O
Enzyme
H
H
O Si (CH2)3 N C N D-Glucosamine
pH，影响载体和酶的电荷变化,影响酶吸附；离子强度，一般认为盐阻止吸附； 蛋白质浓度，蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和；温度，蛋白质往往 是随温度上升而减少吸附；吸附速度，蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小 分子慢得多；载体，对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
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（四）酶的固定化方法 ２、包埋法(Entrapment)
包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防 止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶 接触。
包埋类型可有：网格型、微囊型及脂质体液膜型。
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（四）酶的固定化方法
３、共价键合法(Covalent bonds)
交联法和肽键键合法 氨基：赖氨酸的氨基和多肽链的末端氨基； 羧基：天冬氨酸的羧基，谷氨酸的羧基和末端羧基； 酚基：酪氨酸的酚环； 巯基：半胱氨酸、蛋氨酸的巯基； 羟基：丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基； 咪唑基：组氨酸的咪唑基； 吲哚基：色氨酸的吲哚基。
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（二）固定化酶与游离酶
◆自由酶 (Free Enzyme) 酶直接加入至溶液中，酶自身的空间
结构不发生改变，保持自己的生物特性
◆固定化酶 (Immobilized Enzyme) 通过物理或化学的手段，将酶固载在某种基体上。
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水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
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淀粉糖/高果糖 浆
（一）固定化酶的应用 2、燃料工业（生物柴油）
主要酸碱催化。
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固定化脂酶
（一）固定化酶的应用 3、医药工业
◆固定化青霉素酰化酶 合成头孢羟氨苄（代替青霉素） ◆固定化脂肪酶 合成VC棕榈酸酯 ◆固定化酶药物
蛋白类口酶口服易分解，固定后有助于保持活性
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（四）酶的固定化方法 4、交联法
利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或 酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。最 常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联 苯胺-2，2’二磺酸、1，5—二氟—2，4—二硝苯、己二酰 二胺甲脂等。
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（三）固定化酶反应器的特点 2、固定化酶的缺点 ◆但由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一 定损失； ◆而底物则要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应； ◆也不适宜于需要辅助因子的反应。
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（四）酶的固定化方法
Ionic bond
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（四）酶的固定化方法 常用的共价键合方法
1.戊二醛法
matrix O Si (CH2)3 NH2
OHCCH2CH2CH2CHO
Enzyme
NH2
matrix O Si (CH2)3 N CH (CH2)3CHO
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matrix O Si (CH2)3 N CH (CH2)3 CH N
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（三）固定化酶反应器的特点 1、自由酶反应器 优点：酶解效率高、使用比较方便，特别是在大批量样品处理时。 缺点：不能重复使用、寿命短、产物分离难度大
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（三）固定化酶反应器的特点 2、固定化酶的优点 ◆易于将酶与底物及产物分离，产物相对容易提纯； ◆酶能够重复利用，使用效率提高，成本低； ◆大多数情况下可以提高酶的稳定性； ◆可以增加产物的收率，提高产物质量； ◆有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于与各种分离手段联用。
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Synthesis of the IMER using DSC method
Rawale, S., et al. J. Med. Chem., 2002, 45: 937-43 Calleri, E., et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2003,32:715-24