副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5基因的克隆和表达

合集下载

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用

均在 98.2%～99%。表明建立的方法灵敏度高、特异性强，可以应用于副猪嗜血杆菌的实验室诊断。
关键词：副猪嗜血杆菌；聚合酶链反应；建立
中图分类号：S858.28
文献标识码：B
文章编号：1672-9692(2018)09-0010-04
Establishment and Preliminary Application of PCR for Detecting Haemophilus parasuis
收稿日期：2018-06-09 作者简介：梁乔（1991-），女，汉族，本科，硕士学位，研究方向：动物疫病检测。
2018 年第 9 期
modern journal of animal husbandry and veterinary medicine
11
因 infB 序列设计引物，建立了该病原菌的 PCR 检测方法，为该病的防控和研究提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品副猪嗜血杆菌由沈阳农业大学惠赠，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、奇异变性杆菌、猪链球菌由辽宁省动物疫病预防控制中心保存。 1.1.2 主要试剂 DNAzol 购自 invitrogen 公司；EX Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L)、溴化乙锭、DL 2000 DNA Marker、三羟甲基氨基甲烷乙酸电泳缓冲液购自宝生物工程（大连）有限公司；犊牛血清购自澳洲 Gibico；TSA 购自北京奥博星公司；辅酶 I（NAD 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）购自北京索莱宝科技有限公司。 1.1.3 引物根据副猪嗜血杆菌 infB 基因序列设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，根据 GenBenk 公布的国内外副猪嗜血杆菌 infB 基因的参考序列合成 1 对引物分别为：DQ781933、 EF396317、HM243068、KT740926，引物序列见表 1。

一例副猪嗜血杆菌的分离培养及药敏试验

一例副猪嗜血杆菌的分离培养及药敏试验作者：申识川宋果王冠杰来源：《湖北畜牧兽医》2017年第10期摘要：副猪嗜血杆菌（HPS）主要危害保育猪群，引发以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，猪群一旦发病，病死率较高，给养猪业造成重大经济损失。

从疑似发生副猪嗜血杆菌病的河南濮阳某猪场无菌采集病料，并进行触片镜检、分离培养、生化试验。

结果成功分离到了副猪嗜血杆菌，药敏试验显示，分离菌株对氟苯尼考、泰妙菌素、氟甲砜霉素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟高敏，对红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素低敏。

根据药敏试验结果，对发病猪群进行治疗，取得了良好的治疗效果。

关键词：猪；副猪嗜血杆菌；分离培养；药敏试验中图分类号：S858.28 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）010-0013-02副猪嗜血杆菌（HPS）是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。

副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后保育舍阶段发病，感染高峰通常见于保育期的4～6周，发病率一般在10%～15%，严重时病死率可达 50%[1]。

该菌在特定的条件下，可以侵入猪机体，引发一种以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，又称为猪革拉斯氏病（Glasser′s disease）[2]，主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等[3]。

目前，根据免疫扩散试验，确定该菌有15个血清型，全国各地流行的血清型不完全相同。

由于副猪嗜血杆菌血清型多、产生耐药性快，致使临床疫苗免疫和用药效果不理想，给该病的预防和治疗带来很大的困难[4]。

相对于传统用药，分离鉴定该菌并进行药敏试验分析是比较有效的治疗方法。

2016年4月11日，濮阳地区某中小规模猪场出现25头47日龄的猪发病，根据患病猪流行病学调查情况、临床症状和剖检变化，疑似副猪嗜血杆菌病。

副猪嗜血杆菌与Glasser氏病研究进展

副猪嗜血杆菌与Glasser氏病研究进展2009-06-06 22:17:32 来源：阳光畜牧网浏览：2761次目前，副猪嗜血杆菌感染已成为全球性的问题。

在近几年内，我国已从北京、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖北等地区的一些猪群中分离出副猪嗜血杆菌。

副猪嗜血杆菌感染可呈现多种临床类型，典型经过的者称作Glasser氏病（Glasser＇s Di sease），以纤维素性多发性浆膜炎、多发性关节炎和脑膜炎为其临床特征。

有的无多发性浆膜炎变化但呈急性肺炎经过，也有呈急性败血症经过的。

发病年龄从2周龄至4月龄，通常多见于5～8周龄的仔猪。

卫生状况良好的猪群，一旦遭遇到应激因素，往往更易爆发本病，感染过程往往也更为严重，发病率和病死率都会很高，如发病率可达到10%～15%，病死率可达到50%。

副猪嗜血杆菌是上呼吸道的常在微生物，是一种机会致病菌，可以并发或继发于蓝耳病、伪狂犬病、细小病毒病、圆环病毒病、猪瘟等疫病，使疫情复杂化，经济损失加重。

副猪嗜血杆菌感染与猪胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌等病原体一起已经共同成为当今现代化集约猪场新的麻烦问题之一。

1 副猪嗜血杆菌Glasser（1910）首次报道，他在患有浆液性纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎的病猪的渗出液中发现了这种革兰氏阴性细菌，但分离培养成功的人可能是Scher mer 和Ehrlich（1922）。

在研究早期，曾把需要Ⅹ（铁卟啉）和Ⅴ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD）两种生长因子的猪嗜血杆菌（Haemophilus suis）视为Gl?sser氏病的致病菌。

后来，Biberstein和Whit e（1969）证明来自Gl?sser氏病的病原菌只需要NAD。

因此，他们提议把不需要补给X因子的嗜血杆菌在命名时加前缀“para（副）”以示区别，从而提出一个新种——副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）。

1.1形态副猪嗜血杆菌是巴氏杆菌科嗜血杆菌属中一种小杆菌。

副猪嗜血杆菌主要外膜蛋白基因研究进展

动物医学进展。２０１３，３４（１）：９１ — ９６
ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
副猪嗜血杆菌主要外膜蛋白基因研究进展
张斌，汤承，岳华
等Ｌ６利用蛋白组学方法在Ｈ．ｐａｒａｓｕｉｓＳＨ０１６５菌
株的ＯＭＰ中寻找能诱导小鼠产生免疫保护的蛋
白，结果发现ＯｍｐＰ２、Ｄ１５、ＰａｌＡ和ＨＰＳ－０６２５７能
产生相对高的保护力，这就暗示这４个蛋白能作为
呼吸道的一种共栖菌，可在特定条件下侵入机体引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征。副猪嗜血杆菌病在世界上许多养猪国家广泛存在，已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病Ｌ１］。外膜是革兰阴性菌细胞壁中的特有结构，它位于细菌胞浆膜和肽聚糖层的外侧，包围整个细菌，具有典型的非对称性的磷脂双层结构。位于外膜上的蛋白总称为外膜蛋白（ｏｕｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＯＭＰ）＿２］。在革兰阴性菌中，ＯＭＰ在细菌致病和免疫具有一定的联系。在Ｈ．ｐａｒａｓｕｉｓ中，ＯＭＰ是潜在的毒力因子也具有良好的免疫源性。ＲｕｉｚＡ等＿３］比较了从发病猪的实质器官和健康动物的上呼吸道分离的不同Ｈ．ｐａｒａｓｕｉｓ的ＯＭＰ型，发现ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图谱上有６个～７个分子质量不同外膜蛋白。发现３６．３ｋｕ～３８．５而在健康动物的上呼吸道分离

副猪嗜血杆菌外膜蛋白表型分析

膜蛋白（ＯＭＰ，）比较了不同临床背景分离株的ＯＭＰ表型差异，据外膜蛋白的电泳迁移率Ｒ值和蛋白含量对根ｆＯＭＰ与毒力菌株的相关性和ＰＥ分型进行了聚类分析。图谱表型分析结果表明，２分离株分成以分子量３ＡＧ８个６
１２副猪嗜血杆菌ＯＭＰ的制备．主要参照Ｃｒｎａｌｅ等（９６Ｓｒｏｙ法方法制ｏ１８）ａｋｓｌ备ＯＭＰ如。Ｌ］
１３Ｏ．ＭＰ的ＳＳＰＥＤ — ＡＧ参考Ｒｏｎｒ和Ｋｅｔｉ１９）的方法进ｓｅｉｌｅｎ（９２ｓ行。
９１。其中，部分来自健康猪的分离株的ＯＭＰ、１大
４、７、０、２、４。５、ｌ１１
根据以上分析，实验所涉及的８本２个野外分离
株的ＯＭＰ表型变异程度根据菌株临床背景不同而
异。患病猪场中分离的ＨＰＳ表型差异较大，可分为
Ｉ Ⅱ Ⅲ
图３基于ＯＭＰＲ值的聚类分析ｆ
从聚类图上可见，Ｉ类包含３５个野外分离株，包括分离自健康猪的ＨＰ的所有菌株（号为Ｓ编ＱＹ）１和６株分离自患病猪的菌株，以及标准血清型
１４聚类分析．根据所有供试菌株ＯＭＰ的ＳＳＰＧＥ电泳Ｄ —Ａ
不同毒力分离株的外膜蛋白表型进行研究，图揭试示ＨＰＳ外膜蛋白组分的差异，以及这些差异与毒力

副猪嗜血杆菌病的防治技术研究

副猪嗜血杆菌病的防治技术研究摘要:副猪嗜血杆菌病是流行于猪群的接触性呼吸道传染病,该病可以影响养猪生产的各个阶段,临床上以猪的纤维素性多发性浆膜炎､心包炎､关节炎､脑膜炎为特征｡对副猪嗜血杆菌病的临床研究应该包括菌株的分离鉴定､血清和基因分型､药物和疫苗的防治研究等｡关键词:副猪嗜血杆菌病;菌株分离鉴定;分型;免疫及防治副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是正常猪群呼吸道上的一种常在菌｡临床上以猪的纤维素性多发性浆膜炎､关节炎､心包炎､脑膜炎为特征,该病又被称为革拉泽氏病[1]｡该病目前在规模化养殖场感染率很高,且危害严重,主要引起哺乳仔猪､保育猪(30~50日龄)的关节肿胀､喘气､进行性消瘦､生长速度变缓､急性或慢性死亡等｡副猪嗜血杆菌病的临床发病率一般在10%~15%,严重时病死率可达50%,给养猪生产造成严重经济损失｡不同血清型菌株之间存在毒力差异｡国外特别是养猪发达国家对副猪嗜血杆菌做了流行病学调查,临床发病猪中分离率高达20%,且流行的血清型多为副猪嗜血杆菌中毒力较强的4､5､13型等｡蔡旭旺等[2]首次鉴定了副猪嗜血杆菌分离菌株的血清型,进而建立了快速分离鉴定､培养和保存该菌的方法,并筛选出TSA(胰蛋白大豆琼脂)固体培养基和TSB液体培养基作为最适合该菌的培养基｡同时对2004年12月以前分离鉴定的281株副猪嗜血杆菌进行了血清分型,表明中国目前流行的菌株是血清4型(24.2%)和5型(19.2%),其次是13型(12.5%)､14型(7.1%)和12型(6.8%),另有12.1%的分离菌株不能进行血清学分型｡副猪嗜血杆菌病是造成猪场保育猪死亡的主要原因,在特定条件下如断奶､气候应激等因素才可侵入机体并引起严重的全身性疾病｡近年来,由于免疫抑制性疾病如蓝耳病(PRRS)､圆环病毒2型(PCV-2)等的存在和持续性感染加剧了副猪嗜血杆菌的感染程度｡1 病原学1910年,Glasser首次报道了一种革兰氏阴性短小杆菌与猪的纤维素性浆膜炎和多发性关节炎之间的联系｡1922年,Schermer和Ehrlich首次分离出了这种微生物,其分离培养困难｡在显微镜下观察,副猪嗜血杆菌短小､无运动､多种形态,从单个的球杆菌到长的､细长的以至丝状的菌体｡通常可见荚膜,但体外培养时不受影响｡该菌生长只需要V因子或NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸),不需要X因子,属巴斯德菌科｡在鲜血琼脂平板与葡萄球菌共划线培养时,呈现典型的“卫星现象”,即越靠近葡萄球菌其生长越好,远离葡萄球菌的地方不生长,并且在鲜血琼脂平板上的副猪嗜血杆菌菌落周围不出现溶血现象｡HPS具有荚膜多糖抗原和菌体结构抗原｡荚膜多糖抗原成分主要是多糖和磷酸壁,具有型特异性;菌体结构抗原包括外膜蛋白(OMP)和脂多糖(LPS)｡HPS已知的毒力因子及潜在的毒力因子主要有荚膜､菌毛､外膜蛋白､LPS､转铁蛋白､神经氨酸酶等｡应用SDS-PAGE技术可把副猪嗜血杆菌的OMP分为两个完全不同的生物型,即生物1型和生物2型｡李静怡等[3]在HPS中发现了2个与流感嗜血杆菌具有同源性的外膜蛋白P2和P5,该蛋白与细菌黏附有关,在毒力株和非毒力株中P2的分子质量分别为48 ku和55 ku,因此可通过P2蛋白来区分毒力株和非毒力株｡HPS的OMP具有较好的免疫原性,Miniats等研究发现,用含有OMP和LPS抗原的菌苗免疫动物,有OMP抗体的猪才能抵抗强毒菌株的感染｡副猪嗜血杆菌的LPS具有与其他革兰氏阴性菌内毒素相似的活性,而LPS可诱导PCV-2在体外培养的猪肺泡巨噬细胞中的复制,增加PCV-2在细胞核内的抗原和核酸信号[4]｡Yue等[5]以国内分离的优势血清5型菌株SH0165为亲本株完成了全基因组测序,分析鉴定出了2个潜在区分强弱毒力菌株的分子靶标——OMP2和sodA基因｡利用8株已测序完成的菌株全基因组序列,总结出18个主要的毒力相关基因或操纵子基因｡全基因组分析结果表明,SH0165菌株的基因组由2 269 156个核苷酸组成一个环状染色体,G+C含量高达39.99%,编码2 299个基因｡基因组同源性方面,副猪嗜血杆菌与胸膜肺炎放线杆菌遗传进化上最接近,分类上独立于嗜血杆菌属外形成一个相对独特的进化分支｡1.1 血清型分型法基于免疫扩散试验的15种血清型已被确定｡型特异性抗原为对热稳定的多糖,据推测,其可能是荚膜或脂多糖(LPS)｡副猪嗜血杆菌流行存在明显地域差异,在日本､德国､澳大利亚､美国､加拿大､西班牙和丹麦分离的血清型中显示,血清型4､5和13最为常见｡间接血凝(IHA)试验也可用来鉴定副猪嗜血杆菌的血清型,用于弥补免疫扩散试验分型的局限性,只有63%的菌株可以通过琼脂扩散试验鉴定血清型,相对而言IHA可达90%以上｡目前国内建立了基于微量玻片凝集的血清学定型方法(NY/SY 541-2005),其基本原理是用超波破碎细菌菌体细胞后再与标准血清进行凝集反应｡1.2 基因分型法为克服副猪嗜血杆菌血清学分型的局限性,常用基因分型法对其分型,由于不同菌株具有不同的DNA指纹图谱,基因分型主要用于鉴别菌株间的差异,其优点在于敏感性和特异性都较高,可将血清学方法不能分型的细菌进行归类｡常用的基因分型有限制性内切酶指纹图谱(REF)､多位点酶切电泳(MEE)､肠杆菌科基因间重复序列(ERIC-PCR)､限制性酶切片段多态性分析(RFLP-PCR)等｡目前国内对副猪嗜血杆菌基因分型研究较多的主要是ERIC-PCR法和RFLP-PCR法,贾爱卿等[6]应用ERIC-PCR法将广东地区48株HPS分离株分为31个基因亚型,归类为8个群｡另36.1%不能进行血清分型(KRG琼脂扩散法)的菌株也得到充分分型,未发现血清分型与基因分型之间有明显的相关性,证实ERIC-PCR法比传统血清分型有更高的识别力,可用于场内及场间病原菌的追溯｡PCR-RFLP分型法主要针对HPS的转铁蛋白A(tbpA)基因和aroA基因进行鉴定和分类,通过PCR-RFLP法分析编码转铁结合蛋白基因tbpA对副猪嗜血杆菌进行分型,15种副猪嗜血杆菌标准菌株可产生12种不同的图谱,其中血清型5､12､14和15具有共同的酶切图谱｡HPS相同的血清型菌株内具有遗传多样性,且血清型与RFLP群之间没有相关性｡李军星等[7]用基于tbpA基因的PCR-RFLP的分型方法对中国6省市57株分离菌株及15个参考菌株进行PCR-RFLP分析,15个血清型参考菌株分为9种基因型,57个流行分离株可分为15种基因型,其中在中国最为流行的基因型分别为DBN(38%),ABN(18%)与DBP(12%)｡目前ERIC-PCR和RFLP-PCR基因分型法都是建立在菌株分离培养的基础上｡2 流行病学猪是副猪嗜血杆菌的天然宿主,通常可从健康猪的鼻分泌物和气管黏液中分离出细菌｡还可以从患肺炎猪的肺脏中分离出来,正常猪肺脏是分离不出来的｡全身组织器官中HPS分离率明显高于呼吸系统组织中的HPS分离率,临床分离HPS 时应多选择从全身性组织器官中分离｡HPS可以影响养猪生产的各个阶段,断奶前后和保育阶段发病率较高,高达40%~50%｡咳嗽､呼吸困难､消瘦､跛行和背毛粗乱是主要的临床症状｡不同血清型菌株毒力存在差异,其中1､5､10､12､13､14为高毒力菌株;2､4､15为中等毒力菌株;其他血清型菌株毒力较弱或没有毒力｡临床上可依据发病症状､剖检病变和细菌分离鉴定对HPS作出常规诊断,进一步可根据16 S rRNA引物序列建立的PCR诊断方法提高检测病原的灵敏度,扩增的特异性片断为821 bp｡该方法检测的最小细菌浓度为102 CFU/mL,适合于从全身部位采集的病料[8]｡副猪嗜血杆菌可作为猪呼吸道疾病的病原体,也可作为一种预先影响的因素,引起肺炎的次要或主要病原体｡在肺炎中,该菌只在与其他病毒或细菌协同时才引发疾病｡这些病原包括支原体､猪蓝耳病病毒､猪流感病毒､呼吸道冠状病毒｡PRRSV感染的猪群中,有51.2%的肺脏可分离到副猪嗜血杆菌和猪鼻支原体｡目前临床上PCV-2与HPS的混合感染也较为普遍｡通常早期断奶的仔猪在母源抗体不存在的情况下,副猪嗜血杆菌的晚期感染可能会导致严重后果｡目前在不同群体中混养猪,或引入新种猪,副猪嗜血杆菌的存在是严重问题｡3 免疫与防治3.1 疫苗免疫通过接种商业化疫苗和特异性灭活疫苗可以有效地控制该病的发生｡也有使用灭活苗预防失败的事例,这可能是因为病程中出现的菌株血清型不同或疫苗接种时间控制不当缺乏交叉保护｡不同菌株的免疫原性不同并且细菌的毒力可能与其免疫保护力呈正相关[8]｡已证实疫苗免疫可以对相同血清型不同菌株的感染产生免疫效力｡全菌灭活疫苗主要针对菌株的低脂聚糖产生同种血清型抗体,而菌体蛋白产生的体液抗体能提供高效的免疫保护,在预防HPS感染和疾病发生中可发挥重要作用｡不同血清型菌株之间的交叉保护没有一定的相关性｡国内王金合等[9]､宋凤香等[10]报道用临床分离株制备自家疫苗对控制副猪嗜血杆菌有效;Miniats等[11]比较了SPF猪场中商品疫苗和自家疫苗的应用,结果表明临床分离株的自家疫苗可有效减少该猪场的发病率｡对母猪和仔猪的免疫可以防止仔猪发生多发性浆膜炎和关节炎,并且母源抗体并不干扰1周龄和3周龄仔猪的免疫｡免疫母猪所产的仔猪很少患肺炎和关节炎,仔猪平均日增重高于非免疫母猪所产的仔猪,也不受额外免疫的影响｡蔡旭旺等[2]用国内临床分离株筛选出高毒力4､5型菌株,制备商品疫苗对母猪及14日龄仔猪进行免疫后,具有较高的保护率,研究结果还表明母猪抗体对仔猪用灭活疫苗免疫后建立主动免疫反应的过程没有影响,这与国外研究结果一致｡目前国内应用的商品苗免疫失败的还一个原因可能就是疫苗菌株与临床典型菌株血清型虽然相同,但两者基因型却不同｡由于菌株致病力的差异,以及目前对保护性抗原的毒性因子缺乏深入的认识,还不可能产生一种对猪所有的致病菌株同时产生交叉免疫力的灭活苗｡在基因工程疫苗方面,副猪嗜血杆菌的4个蛋白(PalA､OMP2､D15和HPS06257)可用于HPS疫苗的候选靶蛋白[12]｡对副猪嗜血杆菌的防控还应加强圆环病毒疫苗(目前主要流行的是PCV2b基因亚型)的免疫,特别是免疫断奶前仔猪(2~4周龄),对提高哺乳期仔猪的成活率､提高生长日增重和整齐度､降低PMWS的发生率和继发HPS感染更有效｡3.2 药物治疗抗生素或口服药物治疗对严重的副猪嗜血杆菌病暴发效果不大｡一旦出现临床症状,应对整个猪群注射大剂量抗生素治疗｡药敏及临床试验证明大多数菌株对泰拉菌素､头孢菌素､氨苄青霉素敏感,对氟喹诺酮类､增效磺胺类药物低度敏感｡对副猪嗜血杆菌病的控制方案应当包括免疫疫苗接种和抗菌素处理,但也应当加强饲养管理,如断奶仔猪饲料中添加支原净､替米考星､氟苯尼考､多西环素､电解多维､抗病毒中成药等药物;减少或根除其他呼吸道病原(多杀性巴氏杆菌､猪肺炎支原体等);减少猪群流动,降低寒冷､潮湿､阉割等因素造成的应激反应,杜绝生产各阶段的混养状况｡4 展望副猪嗜血杆菌病是近年来危害养猪业较大的疾病,其本身的致病机理较为复杂,为寻找对副猪嗜血杆菌病的快速诊断及有效预防和治疗方法,国内外学者对其致病机理等方面做了较深入的研究,发现了多种与副猪嗜血杆菌致病性有关的毒力因子｡但其血清型众多,不同血清型的副猪嗜血杆菌毒力差异很大,各毒力因子间的相互作用､毒力因子与疾病的发展关系､以及在新型疫苗研制和协同感染机制方面需做进一步的研究｡特别是目前副猪嗜血杆菌常常涉及到与其他传染性疾病的混合感染,使猪的呼吸道传染病更为严重和复杂,给临床诊断和防控带来了很大的困扰｡参考文献:[1] OLIVEIRA S,PIJOAN C. Haemophilus parasuis:New trends on diagnosis,epidemiology and control[J]. Vet Microbiol,2004,99(1):1-12.[2] 蔡旭旺,刘正飞,陈焕春,等.副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J].华中农业大学学报,2005,24(1):55-58.[3] 李静怡,张建民,徐成刚,等.副猪嗜血杆菌主要毒力因子和致病机理的研究进展[J].中国畜牧兽医,2010,37(12):173-176.[4] 韦平,秦爱建.重要动物病毒分子生物学[M].北京:科学出版社,2008.[5] YUE M,YANG F,YANG J,et al. Complete genome sequence of Haemophilus parasuis SH0165[J]. Bacteriol, 2009, 191(4):1359-1360.[6] 贾爱卿,李春玲,王贵平,等.广东地区副猪嗜血杆菌KRG血清分型及基因分型多态性分析[J].农业生物技术学报,2010,18(1):103-107.[7] 李军星,姜平,王艳,等.副猪嗜血杆菌tbpA基因PCR-RFLP分型[J].中国动物传染病学报,2009,17(1):45-50.[8] OLIVERIA S,GALINA L,PIJOAN C. Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections[J]. J Vet Digeon Invest,2001,2009,13(6):495-501.[9] 王金合,石冬梅,郭素琴,等.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及自家灭活苗的研制[J].中国畜牧兽医,36(8):144-146.[10] 宋凤香,陆桂英,肖丽辉,等.副猪嗜血杆菌灭活疫苗对仔猪免疫保护效力的研究[J].山东畜牧兽医,31(6):8-9.[11] MINIATS O P,SMART N L,EWERT E.Vaccination of gnotobiotic primyary specific pathogen-free pigs against Haemophilus parasuis[J]. Can J Vet Res,1991,55(1):33-36.[12] 周明光,赵建平,张强,等.基于蛋白质组学的副猪嗜血杆菌5型反向疫苗学研究[A].中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C].2009.124-125.。

副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法综述

54猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2017年34卷第05期主题策划F E A T U R E副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法综述魏凤1，张文通2，李峰1，沈志强1,2（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600）副猪嗜血杆菌病（HPS）是猪的一种传染性病症，以呼吸困难、多发性浆膜炎和关节炎为主要特征。

该病主要影响2周龄到4月龄的青年猪。

感染猪群主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率达20%～30%，严重时死亡率可达50%以上。

该病随着养猪集约化发展，再加上免疫抑制病（如猪圆环病毒2型病毒病、猪繁殖与呼吸综合征等），目前在我国流行日趋严重[1-3]。

预防该病所用的疫苗由于血清型之间的差异，交叉保护率低，给养猪业带来严重的损失，已成为影响养猪业最重要细菌性疾病之一。

防治该病的关键措施之一是对该病病原的确诊。

依靠对发病猪群的病史、临床症状、剖检病变这些传统诊断方法可以进行初步诊断，但弄清病原乃至病原的血清型必须依靠实验室诊断。

自1922年Schermer 和Ehrlich 分离出该病原以来，科研工作者对该病确诊进行了大量的研究，取得了显著成绩。

本文就该病实验室诊断方法的研究进展进行了如下综述。

1 细菌分离鉴定细菌的分离培养对确诊是十分有必要的，但往往因杂菌的干扰而不能分离成功。

细菌分离鉴定时应当采集处于疾病急性期的猪并且没有使用抗生素的病料，无菌操作条件下采集病猪肺脏、关节液、淋巴结等组织，通常在接种于含摘要：副猪嗜血杆菌病是引起呼吸系统疾病的重要传染病之一，严重危害养猪业健康发展。

正确诊断副猪嗜血杆菌病对防治该病极为关键。

本文就该病病原分离鉴定、血清学诊断、分子生物学诊断三方面展开阐述，以期弄清该病诊断方面的研究进展。

关键词：副猪嗜血杆菌；诊断方法；综述NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的巧克力琼脂平板。

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

73
Copyright©博看网 . All Rights Reserved.
兽医实验室 2017 年第 12 期

5. 小鼠毒力试验。用已灭菌的注射器吸取 1 ml 生理盐水，喷洒在可疑菌 Hps 生长良好的 NAD 的鲜血培养基上，将可疑菌落洗刮下来制成细菌悬液，分别于腹部皮下接种 5 只健康成年小白鼠，每只 0.2 ml，观察小白鼠的生长情况。
图 1 分离菌镜检结果（革兰氏染色 1000×） 3. 卫星试验结果卫星试验结果表明，在金黄色葡萄球菌的两侧有针
尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，距金黄色葡萄球菌愈近，菌落愈大，愈远则菌落愈小，呈现出明显的“卫星现象”；而在未接种金黄色葡萄球菌的另一个巧克力平皿上则生长不良，菌落稀少，无“卫星现象”出现。
生物实验室。（二）方法 1. 直接涂片镜检。无菌采集病猪的肺脏、心血、胸
腹腔积水、心包积液、关节积液直接涂片，干燥固定后分别进行革兰氏染色，镜检。
2. 分离培养及培养特性观察。将疑似 HPS 感染的猪肺脏、关节液分别接种于含 NAD 的鲜血培养基上，置于体积分数为 5％的 CO2 培养箱中，37℃培养 24 ～ 48 h 后，挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。接着将可疑菌落分别接种于麦康凯培养基、普通琼脂培养基、巧克力培养基、普通血平板、含 NAD 的鲜血培养基上，置于 CO2 培养箱 37℃培养 24 h，观察可疑菌株的生长特性。为尽可能排除杂菌干扰，此时可采用格盘法，挑取在巧克力培养基和含 NAD 的鲜血培养基上生长良好的可疑菌落，在同样的位置分别接种于含 NAD 的鲜血培养基、巧克力培养基和麦康凯培养基、普通琼脂培养基、普通血平板上，置于体积分数为 5％的 CO2 培养箱中，37℃培养 24 h 后再次观察分离菌株的生长特性。

副猪嗜血杆菌血清型和外膜蛋白P5基因型多样性的研究

副猪嗜血杆菌血清型和外膜蛋白P5基因型多样性的研究陈小飞;张斌;郭定乾;汤承;岳华【摘要】Haemophilus parasuis had complicated diversities of serovars and genotypes. In this study, the H. parasuis isolated from the same farm were investigated the serovars by indirect hemagglutination test, and the outer membrane protein P5 genes were cloned, sequenced and analyzed with the neighbor-joining dendrogram from some strains. The results showed that the 42 H. parasuis strains were isolated and identified from the 21 diseased or died pigs. The serotyping results showed that there were 17 of serovar 5 (17/42, 40.7%), 12 of serovar 14 (12/42,28. 5%), 1 of serovar 4 (1/42,2.3%) and non-typable (12/42,28.5%). Interestingly, we found that two different serovars simultaneously isolated in the same pig. Based on the difference of ompP5 gene sequences, the five different sequence types (STs, A to E) were identified from 21 isolates, in which STA was the predominant type in isolates. Furthermore, we also found that the isolates of the same serovar had different ompP5 STs, and even the isolates from the same pig also had different serovars and ompP5 STs. The above results exhibited that the serovar and genotype of H. parasuis isolated from the same pig farm possessed the obvious diversity, and serovars and genotypes infected the same pig also existed the diversities. Hence, this study further revealed the infectious complication of H. parasuis in pig farm, and provided valuable information for the study of infection and epidemiology in H. parasuis.%副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)的血清型及基因型具有复杂多样性.本研究用间接血凝试验对某一猪场分离的Hps进行血清分型鉴定,并对部分菌株的外膜蛋白P5基因进行克隆测序和进化发育分析.试验结果显示,在21头病死猪不同部位共分离了42株Hps,其中Hps血清5型17株(40.7％)、血清14型12株(28.5％)、血清4型1株(2.3％)和未定型12株(28.5％).本试验中有5头猪同时感染2种不同血清型的Hps.21株Hps临床分离株分属5个不同基因序列型(STA～STE),其中STA有12株(12/21)为优势基因型；相同血清型的Hps分离株具有不同的STs型,来自同一头猪的Hps血清型和STs型也不相同.以上结果表明,同一猪群感染的Hps血清型和基因型存在明显的多样性,同一头猪感染Hps的血清型和基因型也存在多样性.本研究为进一步揭示猪群感染Hps的复杂性,研究该病的感染与流行机制提供了有价值的参考.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)002【总页数】4页(P143-146)【关键词】副猪嗜血杆菌;血清型;外膜蛋白P5;基因型;多样性【作者】陈小飞;张斌;郭定乾;汤承;岳华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎和高死亡率为主要特征的猪格拉泽氏病（Glasser’s disease），主要侵害仔猪和青年猪，在世界上的许多养猪国家广泛存在，已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病（Oliveira等，2004）。

副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定

副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定耿屹;曹荣峰;高晓宇;李守军;张桂红【摘要】为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定.本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒.通过EcoRV和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.经SDS-PAGE电泳分析,获得了59.5ku的表达产物,与预期大小的黏附素蛋白分子量一致.经western blot检测,表达产物与HPS阳性血清反应,证明表达产物具有一定的免疫活性.提示本研究所表达的蛋白将有助于HPS的血清学诊断和疫苗的研发.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)005【总页数】3页(P398-400)【关键词】副猪嗜血杆菌;黏附素基因;表达;免疫原性鉴定【作者】耿屹;曹荣峰;高晓宇;李守军;张桂红【作者单位】山西农业大学动物科技学院,山西,太谷,030801;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在的条件性致病菌，可引起猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的革拉瑟氏病(GIasser's disease)[1-2]。

HPS是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)。

该菌多与其他病原，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康[3]。

近年来由于该病的频繁发生，给养猪业造成严重的损失，因此倍受人们的关注。

副猪嗜血杆菌血清5型与4型菌株的差异表达蛋白分析

副猪嗜血杆菌血清5型与4型菌株的差异表达蛋白分析李军;谢宇舟;彭昊;禤雄标;潘艳;杨威;胡帅;马春霞;许力干【摘要】为分析副猪嗜血杆菌血清5型与4型菌株的差异表达蛋白,本研究利用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合质谱分析,经过菌体蛋白提取、蛋白质酶解、iTRAQ标记、标记肽段的SCX分离、质谱分析、蛋白鉴定和生物信息学分析,共获得45 540张肽段谱图,含6 830个肽段,其中6 783个为特有肽段,分属于874个蛋白.对所获得的蛋白进行分析结果显示,副猪嗜血杆菌血清5型菌株与4型菌株相比,有99个蛋白的表达发生2倍以上的变化,其中表达上调的蛋白有86个,表达下调的蛋白有13个.根据COGs数据库将99个表达差异蛋白进行功能分类,分为能量产生和转化、离子转运、氨基酸转运和代谢、辅酶转运和代谢、糖转运和代谢、DNA复制和损伤修复、RNA加工和修饰、细胞外结构、细胞膜/壁形成、细胞运动性、转录后加工/分子伴侣、转录、翻译/核糖体结构及功能未知14类.本研究结果为副猪嗜血杆菌的后续研究奠定基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2015(037)012【总页数】5页(P917-921)【关键词】副猪嗜血杆菌;血清型;同位素标记相对和绝对定量技术;表达差异蛋白【作者】李军;谢宇舟;彭昊;禤雄标;潘艳;杨威;胡帅;马春霞;许力干【作者单位】广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001;广西兽药监察所,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，可以引起断奶仔猪纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节炎，是当前导致断奶仔猪死亡的主要病原[1]。

副猪嗜血杆菌oppA基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立

副猪嗜血杆菌oppA基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立车勇良;陈如敬;江斌;王隆柏;魏宏;吴学敏;庄向生;周伦江【摘要】采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(OppA)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体pGEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白OppA作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0 μg·孔-1,于37℃包被1h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(044)003【总页数】7页(P282-288)【关键词】副猪嗜血杆菌;寡肽结合蛋白基因;克隆;表达;间接ELISA【作者】车勇良;陈如敬;江斌;王隆柏;魏宏;吴学敏;庄向生;周伦江【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌病又称革拉泽氏病［1］，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一种条件性细菌病，主要表现为仔猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等［2－3］.副猪嗜血杆菌病多为继发［4］，通常是由猪圆环病毒病、猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪瘟和猪伪狂犬病引起仔猪免疫力下降而导致的，其发病率为10% －15%，死亡率可达50%以上，给我国甚至全世界的养猪业造成了巨大的经济损失.通过琼脂扩散试验，可将Hps分为15个血清型［2］，但还有20% －30%的菌株不能通过此方法定型，我国目前流行的主要血清型为血清4、5和13型.细菌寡肽透过酶（oligopeptide permease，Opp）输送系统的主要功能是从环境中摄取和运送寡肽营养物质进入细菌内［5］.Opp存在于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中，opp基因是由oppA、oppB、oppC、oppD和oppF 5个基因构成的基因簇，其编码产物形成跨膜通道，主要功能是输送由3－5个氨基酸组成的小肽，属于ABC输送器家族［5］.而寡肽结合蛋白（OppA）是一种底物结合蛋白，位于革兰氏阴性菌的细胞质中［5］，主要功能是捕获寡肽或作为细胞膜表面受体，是非常保守的一种蛋白质，可以作为该细菌的一种诊断抗原. 目前已有多种方法用于Hps病原和抗体的检测，其中用于病原检测的有PCR方法［6］、Southern杂交技术［7］、补体结合试验［8］和环介导等温扩增方法（LAMP）［9］;用于抗体检测的有间接血凝试验［10］和间接ELISA方法［11］.间接血凝试验的稳定性较差，而间接ELISA方法的稳定性较好.因此，本试验通过扩增出Hps oppA基因序列，转化原核表达载体pGEX-6P-1进行原核表达，纯化表达蛋白，包被酶标板，建立Hps抗体检测试剂，旨在为副猪嗜血杆菌病的预防和控制提供依据.Hps由本实验室分离保存;胰酶大豆琼脂培养基（TSA）、胰酶大豆肉汤培养基（TSB）、胰蛋白胨和酵母提取物均购自BD Difco公司;小牛血清从杭州四季青公司购得;NAD和辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗购自Roche公司;pMD18-T simple载体、Taq酶和限制性内切酶等分子生物学试剂购自TaKaRa公司.1.2.1 Hps DNA的提取将冻存的细菌划线接种于含5%小牛血清和0.005%NAD的TSA琼脂平板中，于37℃培养过夜.挑取单个菌落接种于含5%小牛血清和0.005%NAD的TSB液体培养液中，于37℃振摇培养过夜.离心沉淀后加入PBS重悬，按照CTAB/NaCl方法［12］提取细菌基因组DNA，自然干燥后溶于TE中置－20℃保存备用.1.2.2 oppA基因的PCR扩增根据SH0165株的oppA基因，用生物软件Primier 5.0设计1对特异性引物，扩增Hps oppA的全基因.上游引物OP1的序列:5'－CAGGATCCATGCAAACAACCTTTACC－3'（下划线部分为Bam HⅠ酶切位点）;下游引物OP2的序列:5'－CGCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA －3'（下划线部分为XhoⅠ酶切位点）.以Hps DNA为模板，采用特异性引物OP1/OP2进行PCR扩增.反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、50℃复性1 min、72℃延伸1 min，共35个循环;72℃延伸10 min.4℃保存.于80 V、1%琼脂糖凝胶电泳40 min，采用凝胶成像系统观察结果.1.2.3 oppA基因的克隆与测序将回收的PCR产物和T载体于16℃连接1 h，转化感受态DH5α，并接种于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板中，于37℃培养箱倒置培养12－19 h.挑取菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，并放置在摇床于37℃振摇12 h左右，用质粒提取试剂盒提取质粒.将PCR鉴定为阳性的质粒命名为pMD18-T-OppA，阳性质粒的序列送TaKaRa公司测序.1.2.4 重组表达载体的构建及阳性重组菌的筛选、鉴定将阳性质粒pMD18-T-OPPA和pGEX-6P-1载体均用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的片段和载体的酶切产物，按常规方法建立10μL的连接体系，于16℃连接过夜以构建重组表达质粒pGEX-OPPA.取连接产物按常规方法转化感受态细菌BL21（DE3），于37℃培养过夜.挑取单菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，并用质粒试剂盒提取质粒，采用PCR方法筛选阳性质粒.1.2.5 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE分析阳性重组菌在2 mL LB培养基（含60μg·mL－1氨苄青霉素）中于37 ℃、250 r·min－1摇床振摇培养至 D600nm 约为 0.6，分别加入终浓度为 1、2 和4 mmol·L－1的IPTG后继续在相同条件下分别诱导3和6 h，同时设不加IPTG的培养管作为阴性对照，设PGEX空载体培养管作为平行对照.1.2.6 包涵体的提取及纯化收获的阳性重组菌菌液经离心后用PBS重悬菌体，超声波破碎后，于12000 r·min－1、4 ℃离心10 min，弃掉上清，沉淀用洗涤液（含10 mmol·L－1 Tris-HCl、1 mmol·L－1 EDTA 和2 mol·L－1尿素）洗涤20 次，然后用溶解变性液（含10 mmol·L－1 Tris-HCl、1 mmol·L－1 EDTA 和8 mol·L－1尿素）溶解包涵体，以10倍于原体积的PBS稀释溶解后的包涵体进行透析复性，用蛋白纯化柱纯化蛋白.1.2.7 抗原最适包被浓度和HRP-羊抗猪二抗浓度的确定按照方阵滴定法优化ELISA反应条件.原核表达蛋白抗原分别以 2.0、1.5、1.0 和0.5 μg·孔－1包被于酶标板中，HRP 标记二抗按1∶20000、1∶30000和1∶40000稀释，并设阴性血清作对照，组成方阵，按间接ELISA方法操作.比较阴、阳性血清的D450nm和P/N（P为阳性血清的D450nm，N为阴性血清的D450nm），确定抗原的最佳包被浓度，相对应的HRP标记的二抗稀释度为最佳二抗稀释度.1.2.8 待检血清稀释度的确定以最佳浓度的抗原包被酶标板，洗涤后，用封闭液封闭.接着将待检血清作1∶25，1∶50，1∶100 3个稀释度，同样的稀释度共设两孔，按间接ELISA方法操作，在酶标仪上读出D450nm.通过比较阴、阳性血清的P/N来确定最佳的待检血清稀释度.1.2.9 阴、阳性临界值的确定用已建立的间接ELISA方法检测临床采集的30份无Hps病原感染的阴性猪血清，计算阴性血清的平均D450nm（）和标准方差（SD）+2SD为阴、阳性临界值，凡超过临界值的判为阳性，否则判为阴性.1.2.10 间接ELISA特异性试验应用建立的间接ELISA方法检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪圆环病毒2型和猪蓝耳病病毒的阳性血清，并设Hps阴、阳性血清作为对照，以检测其特异性. 1.2.11 间接ELISA方法重复性的测定取阴、阳性标准血清，采用建立的间接ELISA方法进行4次重复性试验，每次6孔.应用Excel软件对试验数据进行多因素方差分析，根据P的大小确定差异显著性，进而证明建立的间接ELISA方法的稳定性.1.2.12 临床血清样品的检测检测2010－2012年本研究室收集的来自福州、泉州和厦门等8个地区猪场共194份血清，了解福建省Hps的流行情况.PCR扩增结果（图1）显示，扩增出的目的基因片段大小为1654 bp，与预期目的片段大小相符.挑取测序结果与预期一致的阳性质粒，与pGEX-6P-1同时双酶切并进行连接，转化DH5α，凃于LB琼脂平板，待生长后挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，提取质粒，进行PCR鉴定.鉴定结果（图2）表明，阳性重组质粒能扩增出与预期一致的条带.SDS-PAGE分析结果（图3）显示，重组菌经2 mmol·L－1 IPTG诱导6 h后，出现一条大小为87 ku的条带，与预期大小一致.按照方阵滴定法优化ELISA反应条件并进行间接ELISA操作.结果（表1）显示，随着抗原浓度的降低，阴、阳性血清的D450nm相应地下降.当抗原浓度为1.0μg·孔－1，二抗稀释度达1∶30000时，其P/N最高，为3.028.因此，选择抗原最适的包被浓度为1.0μg·孔－1，HRP标记的二抗稀释度为1∶30000.表2表明，血清稀释度为1∶50时，其P/N最高，故确定血清最佳稀释度为1∶50.表3表明，30份阴性血清 D450nm的平均值为 0.514，标准方差为0.06473，临界值为0.643.因此，当D450nm大于0.643时，可以判定Hps抗体为阳性，反之，即为阴性.表4显示:包被抗原与抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪圆环病毒2型和猪蓝耳病病毒的标准阳性血清不反应，呈阴性反应;抗原与抗Hps的标准阳性血清呈阳性反应，与抗Hps标准阴性血清不反应.表明本试验建立的间接ELISA方法特异性好.方差分析结果显示:阳性血清的P大于0.05，差异不显著（表5）;阴性血清的P也大于0.05，差异也不显著（表6）.表明建立的间接ELISA方法具有良好的稳定性. 检测2010－2012年本研究室收集的来自福州、泉州和厦门等8个地区猪场共194份血清，了解福建省Hps的流行情况;同时应用海博莱Hps血清抗体检测试剂盒和建立的间接ELISA方法对收集的194份血清进行Hps抗体检测.海博莱检测试剂盒的阳性检出率为36.78%，而建立的间接ELISA方法的阳性检出率为51.32%，两者的阳性检出率的符合率为71.67%，符合率较低（表7）.近年来，猪场呼吸道疾病日益严重，而Hps作为一种条件性致病菌引起的危害也日趋严重.由于培养条件苛刻，Hps的分离率较低;很多用于病原菌检测的方法必须以分离的病原菌DNA为模板，这样就导致了很多副猪嗜血杆菌病不能被确诊.因此，急需一种诊断方法用来确诊该病，而用于抗体检测的血清学方法有利于该病的大规模普查和快速诊断.间接ELISA方法是血清学检测方法中一种较为简便、敏感、特异的方法，比间接血凝试验更准确和敏感［13－14］.选择一种合适的包被抗原是建立间接ELISA检测方法的关键.国内石碧等［15］和王艳等［16］分别选用荚膜多糖和全菌体作为包被抗原建立了检测Hps抗体的间接ELISA方法，取得了较好的试验效果;陈善真等［17］使用原核表达载体pET32a（+）表达了外膜蛋白P5，并用该蛋白包被酶标板建立了间接ELISA方法，该方法特异性好、重复性好，检出率与Hps的临床分离率接近，可用于Hps的临床检测、流行病学调查和免疫监控;贾爱卿等［18］和李鹏等［19］也使用原核表达载体表达了外膜蛋白P2，并把该蛋白作为包被抗原建立了检测Hps抗体的间接ELISA方法，该方法的敏感性和特异性也较好.而Opp属于ABC输送系统家族成员，ABC输送系统是细菌中最大的旁系同源蛋白家族之一，占细菌基因组的5%，控制着必需营养物质进出细菌［20］，并且具有其他多种生物功能［21－22］. OppA作为Opp的成员之一，是非常保守的.因此，本试验选用原核表达载体pGEX-6P-1表达OppA，并把该蛋白作为包被抗原，通过优化确定包被抗原浓度，酶标二抗浓度，待检血清稀释度和阴、阳性临界值，建立了Hps抗体检测的间接ELISA方法，并对该方法的特异性、重复性进行了测定，通过对血清样品的检测证实该间接ELISA方法具有简便、敏感、特异性和稳定性好的特点，可用于Hps抗体的检测.【相关文献】［1］GLASSER K.Untersuchungen uber die schweineseuchemit besonderer berucksichtigung ihrer aetiologic und pathologie［J］.Deutsche Tierarztliche Wochenschrift，1910，18:729 －733.［2］KIELSTEIN P，RAPP-GABRIELSON V J.Designation of15 srovars of Haemophilu parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts［J］.Clin Microbiol，1992，30:826 －865.［3］AMANO H，SHIBATA M，KAJIO N，et al.Pathologic observations of pigsintranasally inoculated with serovar 1，4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidasemethod［J］.JVetMed Sci，1994，56:639 －644.［4］CAIX，CHEN H，BLACKALL P J，et al.Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from China［J］.Vet Microbiol，2005，111（3 －4）:231 －236.［5］DETMERSF JM，LANFERMEIJER F C，POOLMAN B.Peptides and ATP binding cassette peptide transporters［J］.Res Microbiol，2001，152（3）:245 －258.［6］ANGENA O，OLIVEIRA S，AHRENSP.Development of an improved species specific PCR test for detection of Haemophilus parasuis［J］.VetMicrobiol，2007，119（2/4）:266 －276.［7］LANCASHIRE JF，TURNIC，BLACKHALLP J.Rapid and efficient screening ofa representational difference analysis library using reverse southernhybridisation:identification ofgenetic differences between Haemophilus parasuis isolates ［J］.JMicrobiol Methods，2007，68（2）:326 －330.［8］NIELSIN R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis serovars ［J］.Acta Vet Scand，1993，34（2）:193 －198.［9］车勇良，陈如敬，王隆柏，等.副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版，2012，41（12）:61 －66.［10］魏子贡，蔡旭旺，金梅林.副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用［J］.中国兽医科学，2006，36（9）:713－718.［11］MINIATSO P，SMART N L，EWERT E.Vaccination of gnotobiotie primary specific pathogen free pigs against Haemophilus parasuis［J］.Can JVet Res，1991，55（1）:33 －36.［12］萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南［M］.2版.金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.北京:科学出版社，1999:125－126.［13］OLIVEIRA S.Haemophilus parasuis:diagnosis，epidemiology and control［D］.Minnesota:University of Minnesota，2003:129－134.［14］尹秀凤，姜平，邓雨修，等.副猪嗜血杆菌的分离与鉴定［J］.畜牧与兽医，2004，36（7）:6－8.［15］石碧，崔耀文，贾凡，等.副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2007，37（11）:964 －968.［16］王艳，夏万田，姜平，等.副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立［J］.畜牧与兽医，2006，38（3）:5－6.［17］陈善真，李春玲，贾爱卿，等.副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立［J］.中国农业科学，2011，44（14）:3036 －3044.［18］贾爱卿，李春玲，王贵平，等.副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2011，31（9）:1266 －1269.［19］李鹏，姜平，李军星，等.副猪嗜血杆菌重组P2蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立［J］.中国兽医学报，2011，31（4）:480－484.［20］HIGGINSC F.ABC transporters:physiology，structure andmechanism-an overview ［J］.Res Microbiol，2001，152（3 －4）:205－210.［21］GOMINETM，SLAMTIL，GILOISN，etal.Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcRregulon and for virulence［J］.Mol Microbiol，2001，40（4）:963 －975.［22］SOLOMON J，SU L，SHYN S，et al.Isolation and characterization ofmutants of the Bacillus subtilis oligopeptide permease with altered specificity of oligopeptide transport ［J］.JBacteriol，2003，185（21）:6425 －6433.。

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹

新疆农业大学学报 2008,31(4):83~86Journal of Xinj iang Agricultural U niversity文章编号:1007 8614(2008)04 0083 04猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹刘焕1,2,冉多良1,王一成2,袁秀芳2,徐丽华2(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830025; 2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州 320021)摘要: 将猪繁殖与呼吸综合征病毒O RF5基因克隆入原核表达载体pET 28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET O RF5,将此重组质粒分别转化到受体菌E.coli BL21(DE3)中,并用诱导剂I PT G进行诱导表达, 2h后表达达到高峰。

经15%SDS P AG E电泳检测,表达得到的蛋白大小约为13.75kD。

经W est ern Blott ing分析,表达蛋白能与P RRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,具有较好的免疫原性,为研究PRRSV亚单位疫苗奠定了基础。

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒;OR F5;克隆;表达中图分类号:Q786 文献标识码:ACloning,Expression and Immunity Blot of ORF5of PRRSV LIU H uan1,2,RAN Duo liang1,WAN G Yi cheng2,YU AN Xiu fang2,XU Li hua2(1.Co lleg e of Animal M edicine,Xinjiang Agricultural University,U rumqi830025;2.Zhejiang Academy of Ag ricultural Sciences,H angzho u320021)Abstract: T he ORF5g ene of PRRSV w as amplified by PCR w ith a size of375bp.The amplified DNA frag ment w as cloned into pM D18 T,and sequenced.T he result of sequencing show ed that the consistency w as98%compared w ith that of standard strains.Inserted in pET 28a(+),and transform ed in Escher ichia coli BL21(DE3),the frag ment w as ex pressed after induced w ith IPT G.The results of SDS PA GE and Wester n Blotting show ed that the protein w as13.75kD in size and specifically reacted w ith PRRSV posi tive sera from pigs,not neg ative sera.T hese r esults become the base o f researching and producing no vel vaccine and developing effectiv e diagnostic method.Key words: PRRSV;ORF5;cloning;ex pr ession猪繁殖与呼吸综合征(Por cine r eproductive and respiratory sy ndrome,PRRS)以母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征,特别是感染本病后容易导致免疫抑制而继发其他疾病[1,2]。

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立的开题报告

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立的开题报告题目：副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆表达及间接ELISA检测方法的建立一、研究背景和意义副猪嗜血杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）是猪流行性脓毒病的主要病原菌之一，它造成的疾病给全球养猪业造成了极大的经济损失。

目前，针对副猪嗜血杆菌的疫苗和诊断方法已经得到了广泛的研究。

研究表明，制备的体外细胞外蛋白（OMP）可以用作副猪嗜血杆菌的疫苗成分和抗原检测。

其中OMP5是一种高度保守的蛋白质，广泛存在于各个血清型的副猪嗜血杆菌菌株中。

因此，将其应用于副猪嗜血杆菌的诊断中具有很好的前景。

本研究旨在构建副猪嗜血杆菌OMP5基因的表达载体，通过重组蛋白的表达和纯化，建立一种间接ELISA检测方法来检测副猪嗜血杆菌感染的血清标本，为养猪业的预防和控制提供有力的技术支持。

二、研究内容和方法1.克隆目的基因OMP5并将其插入表达载体中进行重组表达。

首先，通过PCR扩增OMP5基因，并克隆到表达载体中。

然后，将载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，在诱导过程中表达重组蛋白。

2.重组蛋白的纯化和鉴定。

采用亲和层析纯化技术，将重组蛋白从菌落中纯化得到，然后利用Western blot和SDS-PAGE方法验证重组蛋白的纯度和鉴定其免疫原性。

3.建立间接ELISA检测方法。

利用纯化的重组蛋白制备包被抗原，然后将其用于间接ELISA检测副猪嗜血杆菌感染的血清标本。

通过对阳性和阴性血清标本的比较，确定最佳的检测条件和阈值。

4.检测临床样本。

利用已建立的间接ELISA检测方法检测采集到的副猪嗜血杆菌感染的临床血清标本，分析检测结果的准确性和可靠性。

三、预期结果1.成功克隆表达了副猪嗜血杆菌OMP5基因并获得纯度较高的重组蛋白。

2.建立了一种间接ELISA检测方法来检测副猪嗜血杆菌感染的血清标本，具有较高的准确性和可靠性。

副猪嗜血杆菌病 PPT课件

临床上应注意和SS、PCP、 PM等细菌性疾病及PRRS、 PMWS等病毒性疾病鉴别。
HPSD呼吸困难与关节炎
HPSD脑膜炎
HPSD病猪消瘦呼吸困难
HPSD体表大面积出血
四、剖检
①浆膜如腹膜、心包膜、胸膜、脑膜、关节膜发生浆液性、纤维素性、化脓性炎症。 ②腹腔、胸腔、关节腔、心包腔有多量渗出液，可混有血液、纤维素，严重时可造成粘连，如 “绒毛心”等病变。 ③多数猪关节肿大。 ④体表淋巴结如下颌、肩前、腹股沟淋巴结肿大，灰白；内脏淋巴结肿大、出血。 ⑤肝脾轻度肿大，表面有纤维素性渗出物。
（三）、按时免疫HPSD疫苗。由于HPS血清型较多，血清型之间没有交叉保护性，实际应用时要选用多价苗。
西班牙海博来、德国勃林格、国内武汉科前等生产的HPSD疫苗可供选用。使用本场本地未使用过抗菌素治疗临床症状明显的病例制作自家苗确是一种较好的控制HPSD的措施。
免疫程序为： A.母猪妊娠70天免一次，90天再加强一次。 B.仔猪28天免一次，42天时再加强一次。 C.公猪每半年免一次。免疫后14天产生免疫力，免疫期6月。
HPSD腹膜炎HPSD纤维素胸膜心胞炎
HPSD纤维素性胸膜肺炎
HPSD绒毛心
五、防治
（一）预防： 1、加强饲养管理，首先要创造不同日龄猪生理需要的环境条件，即合适的温度、湿度、光照、密度、清洁度和空气质量。特别是温度和昼夜温差。 2、根据猪的不同生长时期选用优质名牌饲料。特别注意不可使用发霉变质的饲料，尤其是亚发霉状态的饲料。
3、防止各种应激，特别是断奶前后注意环境条件、饲料营养等不可突然变换，不可断奶期间作任何疫苗。 4、给猪提供清洁、卫生的温水。 5、必须实行自繁自养、全进全出制度。 6、有条件的最好实行同窝保育、同窝肥育。