DHPLC

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脊髓性肌萎缩症携带者产前筛查的几种实用技术

衰竭死亡。Ⅱ型为中度型，约占患者中２０％，Ⅱ型患者６～１８个月内患病，存活在２年以上；大约
１犛犕犃的遗传学机制
３０％患者为Ⅲ型，轻度型，１８岁内患病，预后良好，１９９５年，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ等［９］确定运动神经元存活基
可长期存活。Ⅱ、Ⅲ型ＳＭＡ几乎是由于犛犕犖１至因（犛犕犖）是ＳＭＡ的致病基因，犛犕犖位于染色体
首先通过ＰＣＲ扩增目标基因，再采用ＤＨＰＬＣ半定～３ｈ内完成实验，得到结果。
量方法检测。ＰＣＲＤＨＰＬＣ图形前２个峰是内参３．４微滴式数字ＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ，
峰，后２个峰是犛犕犖２、犛犕犖１，待测样本犛犕犖１、ｄｄＰＣＲ）数字ＰＣＲ（ｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ，ｄＰＣＲ）是新型分
序列唯一的突变，携带该突变的犛犕犖２只能产生野ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｂｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＬＰＡห้องสมุดไป่ตู้ ＭＬＰＡ是
生型水平的约１０％的完整蛋白，且稳定性较差，功Ｓｃｈｏｕｔｅｎ等于２００２年发明的一项基因诊断新技
能下调，而犛犕犖１是产生犛犕犖完整功能蛋白的主术，主要用于基因片段缺失／重复、染色体非整倍体
因发生突变的“２＋１ｍ”型；“１＋０”型携带者最常见，犛犕犖１基因外显子７和８的缺失，很好地证实了
约占９５％，其他约占５％［２０］。因而对犛犕犖１拷贝数ＭＬＰＡ对ＳＭＡ携带者的筛查作用。
进行检测，就可以筛查出大部分犛犕犖１拷贝数为１但ＭＬＰＡ对杂质污染极其敏感，在制备样品和
的携带者和拷贝数为２以上的健康人。因而通过检操作该技术时需要非常小心，虽然最低２０ｎｇＤＮＡ
关联，犖犃犐犘基因拷贝数变化可以影响ＳＭＡ病情进行扩增，根据扩增产物和参照序列的比值，评价
严重程度［１４］。

sop_dhplc

样本准备注意事项1. 样品制备和预处理DHPLC突变检测原理是依据DNA同源双链和杂合双链从色谱柱上的洗脱时间不一进行分离。

纯合突变产物与野生型PCR产物的DHPLC色谱图峰型相似，不易被识别鉴定，只有杂合双链DNA分子（即DNA分子一条单链含突变碱基，另一条单链为野生型），才能被灵敏地检出。

DHPLC分析样品是未经纯化的PCR扩增产物，杂合突变样品可直接用于分析，含纯合突变的样品需与野生型样品等量混合，以形成杂合双链。

样品的处理：PCR产物经过95℃变性5min，然后，大约以每分钟降1℃的速度将温至45℃以下，以充分形成杂合双链。

2. DHPLC检测所需要的PCR产物最低进样量DHPLC是一种灵敏的突变检测技术，对PCR扩增的严谨性、特异性要求较高。

PCR产量不足，且特异性差时，DHPLC的色谱图常不易判断；PCR过度扩增时，一方面增加碱基错误掺入的可能性，导致假阳性；另一方面，非特异性扩增产物含量增加，往往导致DHPLC分辨能力的下降，或形成异常峰型，容易导致检测失败。

DHPLC仪器的峰吸收值大于3mV。

在能满足检测所需量的前提下，减少扩增循环数，比如30个循环。

3.PCR产物的大小虽然DHPLC分析的DNA分子的大小为150-800bp，但最合适的片段大小为300bp左右。

为了保证筛查的灵敏度，我们建议您的扩增产物最好为300bp左右。

4.PCR引物设计PCR引物设计遵循一般引物设计原则。

在条件许可下：1 尽量使扩增产物的GC分布比较均匀；2 尽量使GC含量高的区域在扩增片段的两端；3 在检测高GC含量区域的突变时，有时可能需要在引物的5’端加GC夹。

在设计引物时，最好使您感兴趣的区域距扩增片段两端约30-50bp以上。

5.阳性结果的判断由于不含突变位点的PCR产物（野生型PCR产物）只有单一成分（即同源双链DNA分子），DHPLC图谱上呈现为单一峰型（同源双链峰，Homoduplex peak）。

SNPs检测方法比较

一、定义单核苷酸多态性( single nucleotide olymorphisms ,SNPs)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性。

二、SNPs的研究意义遗传标记具有已知性、可遗传性、可检测性，用于疾病基因的定位、克隆和鉴定。

基因多态与疾病相关性研究SNPs 本身对机体的影响，尤其是疾病的易感性、个性化医疗。

三、SNPs检测方法的分类1、测序方法：常规测序，Pyrosequencing（焦磷酸测序），微测序(SNaPshot)2、基于杂交的方法：Taqman 探针法，Microarray 芯片法，3、引物延伸：MALDI-Tof，dHPLC（变性高效液相色谱技术）4、以构象为基础的方法：RFLP，SSCP，DGGE5、溶解曲线：HRM(高分辨率溶解曲线分析技术)四、各方法概述与比较测序方法1、测序方法------ 一般测序和焦磷酸测序步骤：序列比对-- 引物设计-- DNA 提取-- PCR - 割胶纯化-- 直接测序或装克隆测序。

优点：SNP 分析金标准，能发现已知SNP，也能发现未知SNP。

缺点：每个样本的每个位点均需要经PCR 扩增，跑胶，然后切胶纯化，再测序。

步骤多而分散，成本较高，工作量大，周期长，价格昂贵，不适合大样本多位点检测。

2、测序方法------微测序方法（SNaPshot）微测序流程：1）.设计PCR 扩增含SNPs 位点的一段DNA2）.对PCR 产物进行纯化（去除引物和dNTP)3）.引物延伸4）.延伸产物检测（放射性同位素标记法、发光检测法、凝胶为基础的荧光检测法、质谱分析法、变性高压液相色谱法等）优势：类似普通测序，但10 个位点PCR 产物同时引物延伸，通量增加。

劣势：前处理等同普通测序：每个样品的每个位通过点都需要PCR预先扩增，跑胶，割胶，DNA 纯化。

不同是10 个位点可以同时测序，提高了测序效率，但对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6 个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。

DHPLC

变性高效液相（DHPLC）在基因研究方面的应用变性高效液相色谱（Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）是一种新的高通量筛选DNA序列变异的新技术，这一技术最先由美国Stanford大学Oefner 及Underhill等于1995年报道，美国Transgenomic公司采用该原理制造专利化仪器，专利产品为WAVE® Maker片段分析系统。

1、仪器主要组成部分硬件部分：变性高效液相色谱仪（WAVE 3500HT）：WAVE L7100 型四元梯度溶液注入系统（含四元梯度泵），WAVE L7250 型Peltier可冷却、加热自动进样器，WAVE L73100 型高精度Peltier 柱箱，WAVE L73100型紫外/可见光检测器，WAVE L700在线去气装置：四通道，样品池（可容纳4个96 孔PCR 板，以便进行大规模分析筛查），WAVE® Maker 数据工作站系统（硬件）等。

软件部分：Microsoft windows NT 操作系统，SHMD-7000数据工作站控制接口软件，WAVE® Maker核苷酸片段分析系统专用软件包。

2、DHPLC基本原理用离子对反向高效液相色谱法：⑴ 在不变性的温度条件下，检测并分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段，类似RFLP分析，也可进行定量RT—PCR 及微卫星不稳定性测定（MSI）；⑵ 在充分变性温度条件下，可以区分单链DNA或RNA分子，适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制；⑶ 在部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物经过变性复性过程，不仅分别形成同源双链，同时也错配形成异源双链，根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离，从而识别变异型。

根据这一原理，可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析SNPs等方面的研究。

变性高效液相色谱结合多重PCR技术快速检测杜兴肌营养不良携带(精)

变性高效液相色谱结合多重PCR技术快速检测杜兴肌营养不良携带者大片段缺失Denaturing HPLC Coupled with Multiplex PCR for Rapid Detection of Large Deletions in Duchenne Muscular Dystrophy Carriers,Clinical Chemistry51, No. 7，1252-1256, 2005杜兴肌营养不良（DMD）和贝克肌营养不良（BMD）在新生男婴中的发病率为1/3500。

DMA和BMD都是X染色体连锁的隐性遗传病，源于Xp21.1处的dystropin基因突变。

其中约2/3的病例由女性携带者遗传，其余的病例由个体新发生的突变引起，无肌营养不良的家族史。

约60%的DMD病例的发病与基因内一个或多个外显子的大片段缺失相关，涉及基因近端和中间两个热点区域（外显子3-7和外显子44-55）。

约6%的DMD病例的基因变异与基因内大片段重复相关。

剩下的病例源于基因的点突变，小片段的缺失和插入。

正如Chamberlain 和 Beggs 等介绍的方法，受累的男性病例很容易通过多重PCR反应中特定扩增产物的缺乏进行诊断，不同频率的缺失的检出率高达98%。

但是对于携带者，由于未发生缺失的一条X染色体的妨碍，使得诊断DMD携带者较困难。

现在已经报道了多种进行DMD携带者诊断的策略，如定量Southern杂交，荧光原位杂交，连锁分析，基于荧光分析的技术，微芯片电泳，毛细管电泳，多重扩增的探针杂交，多重连接依赖的探针扩增等。

变性高效液相色谱技术（DHPLC）是一种简单，快速，非凝胶，非荧光依赖的方法，应用离子对反相液相色谱原理进行DNA变异检测，该技术灵敏度和特异性非常高。

我们将DHPLC 技术和多重PCR技术相结合，介绍了它在有效和精确诊断DMD家系中DMD携带者和非携带者的新应用。

多重PCR/高效液相色谱技术检测RB1基因重组Multiplex PCR/liquid chromatography assay for detection of gene rearrangements: application to RB1 geneNucleic Acids Research, 2004, Vol.32,No.18, 139摘要：大片段基因重组的筛查技术作为分子医学的重要组成部分已经建立，但仍然面临挑战。

DHPLC原理

DHPLC变性高效液相色谱(DHPLC)技术是一种能用于快速，自动和高通量检测基因的技术平台。

在分子生物学研究和临床基因诊断领域中，DHPLC技术可应用于DNA 的绝大部分检测，在很多领域已建立了快速、自动化核酸分析新方法和新标准。

利用该技术可以对单链和双链核酸进行快速、准确、自动化的分离、分析和定量；可用于单碱基替换（或单核苷酸多态性），小片段缺失或插入等多种已知和未知基因突变的检测；DNA/RNA片段大小判定；寡核苷酸分析及纯化；基因表达定量（Q-RT-PCR）和基因型分析（Genotyping）；基因表达差异分析；微卫星（MSI、STR）和杂和性丢失（LOH）分析；基因或染色体的部分缺失和多倍体的半定量分析等等；该技术可在生殖细胞系和体细胞系中筛查基因变异，它的应用范围包括：癌症基础研究、癌症放疗基因监控、癌症治疗药物基因组学监控、遗传性肿瘤早期诊断、肿瘤表观遗传学研究及诊断、各类遗传疾病的基因诊断、流行病学基因研究、临床微生物基因检测、法医鉴定、动植物遗传育种研究等。

原理DHPLC技术是利用液相色谱技术（HPLC），既在高压闭合液相流路中，将DNA 样品自动注入并在缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测或荧光检测被分离的DNA样品，自动DNA片段收集器可根据需要自动收集被分离后的DNA样品，整个分析过程都是在计算机通过专用软件包NAVIGATOR完成的，专利的DNA分离柱具有很好的温度稳定性和酸碱稳定性，具有很长的有效寿命（大于6000次进样）和极好的分析稳定性（99%）。

DHPLC DNA色谱分离柱工作原理DNA分离柱，是使用无孔多苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物微球体作为稳定基质。

因为这些微球体都与含有18个碳原子的烷基长碳链相连，所以色谱柱的基质是疏水，电中性的，不会与核酸分子直接发生反应。

三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相上碳-18链的疏水基团发生反应。

运用DHPLC技术检测PINK1基因突变

堡±兰堡丝塞笙二童萱宣（图片来源于美国ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司网站：ｈｔｐ：／／ｗｗ．ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍ—ｉｃ．ｃｏｍ．ｃｎ．）图卜１同源和异源双链的形成及ＤＨＰＬＣ检测结果３图３－ｌ待测样品ＰＩＮＫｌ基因外显子ＩＡＰＣＲ产物（４５２ｂｐ｝Ｍ：１００ｂｐＤＮ＾Ｌａｄｄｅｒ卜２０：待测样品臣３－２待鹊样品ＰＩ豫ｉ基日外显亍ＩＢＰＣＲ产物（３３０ｂＯＭ：１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－３待剥样品ＰＩＮＫｌ基因外显子２ＰＣＲ产物（５２２ｂｐ）Ｍ：１００ｂｐＤＮ＾Ｌａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－４待测样品Ｐｆ＃Ｋ１基因外显孚＿ｊＰＣＲ产物（ｊ五品）Ｍ：１００ｂｐ蹦＾Ｌａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－５待测样品ＦＩＮＫＩ基因外显子４ＰＣＲ产物（４２９ｂｐ）Ｍ：１００ｂｐＤｌｔＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－６待测样品ＰＩＮＫｌ基因外显子５ＰＣＲ产物（３００ｂｐ）Ｍ：１００ｂｐＤＮ＾Ｌａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－７待测样品ＰＩＮＫｌ基因外显子６ＰＣＲ产物（３０９６９｝Ｍ：ＩＯＯｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３，８待测样品ＰｔＮＫｌ基因外显子７ＰＣＲ产物（４１６ｂｐ）Ｍ：ＩＯＯｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品图３－９待测样品Ｐｌｌｆｆ（１基因外显子８ＰＣＲ产物（Ｓ２０ｂｐ）Ｍ：１ＯＯｂｐＤＩＶＡＬａｄｄｅｒ１－２０：待测样品３．２．２ＤＨＰＬＣ检测结果３．２．２．１ＤＨＰＬＣ检测正常图谱经ＰＡＧＥ胶检测后ＰＣＲ产物产量及特异性良好的待检样品与野生型样品的ＰＣＲ产物按ｌ：１混合，以２．３２．２条件进行变性后用ＤＨＰＬＣ检测。

待检样品的峰型与野生型样品的峰型相比较，峰型一致者考虑为正常，以下是ＤＨＰＬＣ检测的ＰＩＮＫｌ基因各外显子正常峰型（图３．１０一３．１８）。

图３－１０ＤＨＰＬＣ检测ＰＩＮＫｌ基因外显子ｌＡ的正常图谱（温度６８．ｔ℃），“＿．”样品峰，ＩＤ：４８７６，１１０５为待检样品，ＩＤ：１ＡＮ为野生型样品，待测样品峰型与野生型样品峰型一致图３－１１ＮｔＰＬＣ检测ＰＩＮＫｌ基因外显子１Ｂ的正常图谱（温度６７．８℃），。

高效液相色谱的应用研究进展

高效液相色谱的应用研究进展【摘要】从1903年，色谱的开始使用，各种色谱技术应运而生，其中高效液相色谱由于其分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，作为物质分离的重要工具，在各个方面都取得了很大的发展，并且出现了许多的新型色谱。

本文综述了变性高效液相色谱在生物遗传方面的应用，及高效液相色谱在医学方面的应用。

【关键字】HPLC（高效液相色谱） DHPLC（变性高效液相色谱）1.高效液相色谱概要色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。

根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。

在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成。

这种色谱称为高效液相色谱(1iighperformance liquid chromatography，HPLC)。

由于高效液相色谱法有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物学与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛。

另外，在高效液相色谱法的基础上不断发展，变性高效液相色谱法(DHPLC)随之兴起，广泛用于生物学、遗传学等领域。

2.高效液相色谱在生物学的应用变性高效液相色谱法(DHPLC)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。

DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下，由荧光检测被分离的DNA样品，从而实现对DNA不同的分析它因使用的温度不同而有不同的应用价值：①在非变性温度(40℃～5O℃ )条件下对不同长度的双链DNA进行分离，用于定量反相PCR、长度多态性分析以及杂合性缺失(LOH)分析等；②在部分变性温度(51℃～75℃)条件下进行基因突变，单核苷酸多态性和CpG甲基化的检测；③在完全变性温度(70℃～8O℃)条件下对寡核苷[1]酸进行质量控制和纯化，RNA分离及已知位点基因型的分析等。

各突变检测方法比较

1、RNA酶A切割法（RNase A cleavage）在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA 切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。

当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。

故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。

该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。

于这些优越性，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。

电泳法（不能确定突变位点，都要通过测序等解决）2、变性梯度凝胶电泳（DGGE）双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。

一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain, MD)和解链行为(melting behavior) 。

一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。

当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。

当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时，这些区域也依次发生解链。

直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。

如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（GC 夹子，一般30-50 个碱基对）可以解决这个问题。

地中海贫血诊治进展与我国现状

结论总的来说，地中海贫血的诊治进展为患者带来了新的希望和选择。然而，在实际应用中仍需不断完善和提高。我们呼吁广大医务工作者、科研人员、政策制定者和公众共同地中海贫血这一疾病，加强协作与交流，共同推进地中海贫血诊治事业的发展。展望未来，随着科技的进步和研究的深入，我们有理由相信，地中海贫血的治疗效果将越来越好，患者的生命质量也将得到显著提高。
研究不足
尽管中国南方地区地中海贫血的研究取得了一定的进展，但仍存在一些不足之处。首先，在治疗方法方面，尽管基因治疗为地中海贫血的治疗提供了新的思路，但其临床应用前景仍需进一步探索。目前，基因治疗仍存在安全性、有效性等问题需要解决。此外，现有的治疗方法如输血和去铁治疗也面临着一些问题，如铁过载等。
临床应用思考在实际应用中，地中海贫血的诊治仍面临诸多问题和挑战。首先，由于地中海贫血的遗传特性，患者在出生时可能无法立即确诊，往往需要依靠家族史和临床表现进行推断。其次，治疗方法的选择和疗效的评估需要综合考虑患者的病情、年龄、性别、经济状况等多方面因素。针对这些问题，我们提出以下解决方案：
3、优化治疗方案：对于地中海贫血患者，应根据其具体情况制定个体化的治疗方案。例如，对于轻型患者，可采用补铁、祛铁等保守治疗；对于重型患者，在条件允许的情况下，可考虑采用基因治疗、干细胞移植等先进治疗方法。
4、加强社会支持和心理辅导：地中海贫血是一种长期甚至终身性疾病，患者需要长期治疗和。因此，社会各界应给予患者及其家庭更多的支持和关爱，同时提供专业的心理辅导，帮助他们更好地应对疾病带来的心理压力。
广东省在防控地贫方面做了很多工作，首先就是婚前检查和产前诊断。通过对准备结婚的男女进行地贫筛查，以及在怀孕期间进行基因检测，可以有效地预防重型地贫患儿的出生。目前，广东省的婚前检查和产前诊断覆盖率已经达到了95%以上。

DHPLC变性高效液相色谱原理

DHPLC变性高效液相色谱原理DHPLC变性高效液相色谱技术是近年来发展起来的一项新的分析技术，它是分离核苷酸片段及分析检测已知未知基因突变和SNP的最佳技术平台，其核心技术采用Transgenomic公司专利技术的DNA SepCartridge分离柱。

DHPLC能够分析检测已知未知突变和SNP，技术关键是依靠这样专利技术的分离系统，在专利技术的DNA SepCartridge分离柱中的基质为聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）交联聚合物微球体，固定相为碳-18烷烃链，PS-DVB微球体与碳-18烷烃链之间形成碳碳共价键共同组成柱填料，填料是电中性、疏水性的，不易与核酸发生反应。

三乙基铵醋酸盐（TEAA）是一种离子对试剂，离子对试剂既是疏水性的又带正电荷，既能与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应，同时TEAA的疏水基团又与固定相碳-18链的疏水基团发生反应。

这种离子对试剂是连接核酸和柱基质之间的桥梁，因此，它作为“桥分子”使DNA片段吸附在固定相上面。

通过改变流动相中乙氰及离子对试剂的浓度实现DNA片段的分离。

WAVE® DHPLC分离系统的三种操作模式：WAVE®系统是一套经济、高效及多用途的仪器。

标准WAVE系统提供可选择的冷却设备、双板自动进样器、柱箱、紫外检测器和分离柱组成。

这套系统可在同一分析标准下实现三种模式的运行。

将标准WAVE系统加工和升级可以进一步提升系统的可用性。

执行模式温度应用分离基础非变性 50℃测量双螺旋DNA的大小（小于2000bp）依赖大小 PCR质量检测及纯化依赖序列定量分析部分变性 52-75℃变性检测依赖大小（平均范围）单核酸多态性检测依赖序列完全变性 75-80℃测量双螺旋DNA大小（小于2000bp）依赖大小（平均范围） DNA分析（DNA SepR柱）依赖序列寡核苷酸质量（DNA SepR柱和OLIGO SepR柱）和纯度分析（片段收集器）大量纯化需要OLIGOSepPrep TM HC柱非变性条件：依赖分子量的分离WAVEMAKER TM软件能根据DNA片段分子量大小最大限度完善分离条件。

DHPLC内容简介

DHPLC内容简介用以检测T2DM的众多候选基因突变所需要的技术，既要求能够自动化、高通量进行，也要求除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理；而目前已有的许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性 (single-st rand conformation polymorphism，SSCP) 、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gr adient gel electrophoresis，DGGE)等均不能满足此要求。

近年来建立并迅速发展的DHPLC是一种新型基因突变筛查技术，符合上述的要求，可用于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，小片段缺失或插入等多种基因突变的检测。

DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。

与传统的SSCP 、DGGE等方法相比，DHPLC 有较多的优点。

SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。

而DH PLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。

DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。

当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。

其原理是：在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。

异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。

用DHPLC筛查突变的时候，要注意以下几个方面：（1）PCR产物要有高度特异性，以免用DHPLC检测时产生假阳性结果。

应用DHPLC技术检测PINK1基因突变的开题报告

应用DHPLC技术检测PINK1基因突变的开题报告一、研究背景和意义帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经系统退行性疾病，其发病率随着人口老龄化的加剧而逐年上升，已经成为全球范围内的重要公共卫生问题。

该病的临床特征为肌肉僵硬、震颤、步态不稳、姿势不良以及自主运动缺乏等，严重影响患者的生活质量与预期寿命。

PD的病因尚不清楚，但已经发现与该病相关的遗传学因素。

过去的研究发现，PINK1基因的突变是PD的一个遗传形式。

该基因位于人类第一号染色体上，属于蛋白激酶基因家族，编码的蛋白在线粒体的质量控制过程中发挥重要作用。

同时，突变还与罕见的儿童帕金森患者有关。

因此，检测PINK1基因突变对PD的早期诊断、治疗和遗传咨询具有重要的临床价值。

DNA测序是检测基因突变的常用方法，但其操作过程繁琐、费时费力、成本较高。

随着DHPLC（Denaturing High-performance Liquid Chromatography）技术的发展，其被广泛应用于基因突变检测中。

DHPLC技术可以快速地检测样品中的DNA序列中的突变，具有操作简便、灵敏度高、成本低等优点，逐渐取代了传统的DNA测序技术，成为目前基因突变检测的主要方法之一。

二、研究目的和内容本文旨在应用DHPLC技术检测PINK1基因突变，并探讨该技术在PD遗传检测中的应用价值。

具体内容包括以下几个方面：1. PINK1基因突变与PD遗传相关性的回顾研究；2. DHPLC技术的原理、优点和不足；3. 基于DHPLC技术的PINK1基因突变检测方法的建立和优化；4. 通过不同样本的检测结果比对，评价检测方法的精确度、准确度和可重复性；5. 结论和展望。

三、研究方法1. 样本采集和DNA提取：采用外周血分离法提取样本中的DNA，并通过NanoDrop光谱仪检测DNA的纯度和浓度。

2. DHPLC条件的筛选和优化：优化温度、梯度和缓冲液浓度，建立PINK1基因突变检测的专用检测方法。