日本沼虾卵黄蛋白原合成部位的初步研究_高祥刚

#研究报告#生物技术通报BI OTECHNOLOGY BULLETI N2006年增刊日本沼虾卵黄蛋白原合成部位的初步研究*高祥刚 刘红 徐佳念 蔡生力(上海水产大学生命科学与技术学院,农业部水产种质资源和养殖生态重点开放实验室,上海200090)摘 要: 十足目卵巢中卵黄的来源,在过去的几十年研究中一直存在争议,内源性合成和外源性合成均有报道。

以雌性日本沼虾为实验材料,根据外形观察和组织学研究确定其发育阶段,可以分为:卵原细胞增殖期;卵黄发生前期;初级卵黄发生期;次级卵黄发生期;成熟期和抱卵期(消退期)。

从处于不同发育期的卵巢和肝胰腺中提取总RNA,用RT-PCR 方法探讨不同发育期的日本沼虾卵巢和肝胰腺卵黄蛋白原mRNA 表达,确定是否有卵黄蛋白原的合成功能。

检测结果可以初步判定日本沼虾卵巢和肝胰腺都具有卵黄蛋白原mRNA 表达功能,都是卵黄蛋白原的合成部位,其合成的量与沼虾卵巢的发育阶段相关。

关键词: 日本沼虾 卵黄蛋白原 合成部位 卵巢 肝胰腺Study on Site of Vitellogenin Synthesis i n t he Fres hwaterPrawn M acrobrachi um N i p poneseG ao X ianggang L i u H ong Xu Jian ian Ca i Sheng li(The K ey Laboratory of A quatic Genetic Resources and A quac u ltural E cology (AGRA )Certifica te d by T heM i nistry of Agr iculture ,T he C olle ge of A qua-li fe Science &T ec hno logy,Shanghai F isheries Univers it y,Shanghai 200090)Abstrac:tIn crustaceans ,the source of yo l k pro te i ns has been the subject o f controversy for severa l decades .Bo thex tra -ova rian and i ntra -ovarian syn t heses have been i m plica ted .In the present study ,tota l RNA s w ere i so lated from ovary and hepatopancreas of t he fresh w ate r prawn M acrobrach i u m n i pponese ,at d ifferen t ovary deve l op m en tal stages i ncl uding mu lti p licati on oogon i u m stage ,pre -vite ll ogenesis stage ,pri m ary v ite llog enesis stage ,secondary v i te ll ogenesis stage ,m atura -ti on stage and spent stage (g rav i d period).Expressi on o f v ite llog en i n mRNA w as i den tified by m eans o fRT-PCR a m plifi ca -ti on .Successful a mp lificati on w as accomp lished usi ng both ovary and hepatopancreas .It could be conc l uded t hat bo t h ovary and hepatopancreas were the specific site o f vite ll ogen i n synthesis i n t he fresh w ater pra w n M acrobrach i u m n i pponese .T he expressi on of v ite llogen i n mRNA i ncreased i n bo th ovary and hepatopanc reas w it h t he ovary deve l ope i ng .Key words : M acrobrachiu m ni pponese V itell ogenin Synthesis site H epatopancreas O vary基金项目:教育部骨干教师资助项目(编号2000-02),上海市重点学科建设项目资助(编号:Y1101)作者简介:高祥刚(1980-),男,山东新泰人,上海水产大学2003级研究生,专业方向为水产动物繁殖与发育生物学通迅作者:蔡生力(1957-),教授,从事水产动物繁殖和发育生物学研究。

E -m ai:l slca@i shfu .edu .c n日本沼虾(M acrobrachiu m ni p ponenses )又名青虾,河虾。

隶属于十足目、长臂虾科、沼虾属。

广泛分布于日本,东南亚和我国南北各地的淡水江河湖泊中,也常出现于低盐度的河口或淡水水域,浅水草湖中数量较多。

其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富,深受广大消费者青眯。

虾类胚胎和开口前仔体发育都属于卵黄营养,其胚胎仔体发育、生长需要的能量和营养完全依赖卵黄,而卵黄的主要成分是卵黄蛋白,因此卵黄蛋白的数量和质量对于维持虾类早期的生命至关重要[1],卵黄磷蛋白(v ite llin ,Vn)又是卵黄蛋白的主要成分,所以研究卵黄蛋白的合成机理,卵黄磷蛋白是较为理想的指示物;卵黄蛋白原(v itellogen i n ,Vg)作为卵黄磷蛋白的前体,是研究卵2006年增刊高祥刚等:日本沼虾卵黄蛋白原合成部位的初步研究黄蛋白的主要对象。

近十几年来,十足目中卵黄蛋白的来源一直是一个争论不休的话题,而对日本沼虾关于卵黄蛋白来源的研究所见较少[2,3]。

利用RT-PCR的方法初步确定了日本沼虾卵黄蛋白原的合成部位,比较探讨了各个发育时期的合成情况。

1材料和方法1.1实验材料实验用雌性日本沼虾购自上海市图门路菜市场,从2005年9月2日至10月2日连续取样,活虾运至实验室后,观察外部特征,称量体重,测量体长,然后进行解剖,取性腺并称重,计算性腺指数。

每尾虾取肝胰腺,卵巢和肌肉各约0.2~0.4g,立即用液氮速冻,放入无RNA酶的eppendorf管中并贮存于-70e,该样品用于总RNA提取,其他的卵巢组织用福尔马林磷酸缓冲液固定(40mM Na2HPO4,30m M Na H2PO4,10%福尔马林),石蜡切片后进行组织学观察。

1.2实验方法1.2.1石蜡切片的制作(1)新鲜卵巢固定于福尔马林磷酸缓冲液中,次日更换固定液,7d后再更换一次(2)冲洗:用50%酒精冲洗5m i n,冲洗3次(3)脱水:(每步各15m i n)50%酒精)))60%酒精)))70%酒精)))85%酒精)))90%酒精))) 95%酒精)))100%酒精)))100%酒精(4)清洗:二甲苯酒精(1:1)10m i n)))二甲苯7m i n)))二甲苯8m in(5)透蜡:(每步30m i n)50%二甲苯+50%石蜡)))100%石蜡)))100%石蜡(6)包埋:石蜡快速冷却来防止形成大的结晶包埋温度:夏季58-60度;冬季54~56度)(7)切片:8um的厚度(8)H、E染色:脱蜡:二甲苯7m i n-二甲苯7m i n复水:(下行)100%酒精2m i n)))95%酒精2m i n)))70%酒精2m in)))50%酒精2m in))) 30%酒精2m in)))自来水冲2m in染色:Ehriich's苏木精15m in)))自来水冲2m i n)))酸酒精5s)))自来水冲1m i n)))氨水(0. 1%)2m in)))自来水冲1m i n)))脱水(上行:30%酒精2m i n)))50%酒精2m in)))70%酒精2m i n)))95%酒精2m i n))))0.5%曙红30s))) 95%乙醇中分色(时间尽可能短))))95%酒精清洗(时间尽可能短))))100%酒精2m i n)))100%酒精2m i n)))二甲苯:酒精(1:1)2m in)))二甲苯2m i n)))二甲苯2m i n(9)封胶:加拿大胶封片1.2.2RT-PCR使用Trizo l试剂盒(I nvitrogen)分别提取卵巢、肝胰腺不同发育期的总RNA,经1%甲醛变性琼脂糖凝胶检测RNA完整性后,利用紫外分光光度计(Phar m ac ia m B i o tech)确定浓度和纯度;以o li g o(dT)18为引物,加入1L g总RNA通过M-M uLV逆转录酶(上海生工生物工程技术服务有限公司)合成第一条链(反应体系为20L l)。

从GenBank(http://www.ncb.i n l m.n i )中查找虾类卵黄蛋白原的c DNA序列,得到真虾派的罗氏沼虾(accession:AB056458)和朝鲜长额虾(accessi o n:AB117524)两条卵黄蛋白原的c DNA序列,应用B ioEdit(version5.0.6)软件进行比对分析,可以看出卵黄蛋白原的c DNA序列相对比较保守。

用pre m er5.0软件,在卵黄蛋白原的保守区域进行引物设计,引物序列(预期产物379bp)如下:上游引物(19n,t Tm=55.7e):5c-TC AAT GGTGGC CAA ACT AG-3c下游引物(22n,t Tm=54.1e):5c-TCTG GAA ATT TTC AAA GAG AGG-3c,引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系(50L l):5L l10@Taq Bu ffer,4 L l2.5m M dNTP,上、下游引物(5L M)各1.2L,l2 L l c DNA,0.5L l Taq DNA Po l y m erase*(3U/L l) (Ta K a Ra)。

PCR反应条件为起始95e变性1m in,接着36个循环:95e变性35s,52.6e退火35s, 72e延伸45s。

最后再于72e延伸10m i n。

取10L lPCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上电泳,以Ta K a Ra公司的DL2000为标准参照。