沙门氏菌X4062染色体-质粒平衡致死系统的构建毕业论文

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作者签名：日期：摘要鉴于临床多种耐药性菌株不断产生和迅速水平传播扩散，FDA ( Food and Drμg Administration食品与药物管理机构)已禁止在重组菌生产中使用抗生素和含抗药性基因作为筛选标志的载体质粒。

染色体-质粒平衡致死系统是近年来发展起来的一类以非抗生素作为筛选标记的载体表达系统，它的宿主菌通常是一类染色体管家基因的突变体，该缺陷型菌株不能在基本培养基上生长，当导入带有其完整基因的互补质粒后，质粒与缺陷型菌株即以遗传互补的方式构成染色体-质粒平衡致死系统，此时互补质粒对其宿主菌的生长起到功能性互补的作用，一旦质粒丢失，细菌则由于不能合成必需物质而死亡。

基于减毒沙门氏菌染色体上asd基因的已知序列，利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建沙门氏菌X4062的asd基因缺失突变株X4062 △asd::cat，在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶基因的质粒pCP20介导二次同源重组，以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。

结合PCR扩增和测序结果，证明沙门氏菌X4062Δasd 缺失突变株的正确构建。

另外，从沙门氏菌X4062基因组中扩增出asd基因片段，将该片段整合到带有表达荧光蛋白基因的质粒pEGFP中，命名为pMD-asd。

缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力，只有添加DAP或导入含有asd基因的质粒（pMD-asd）才能在LB培养基上生长，与原型沙门氏菌X4062比较，其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致，基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的沙门氏菌染色体-质粒平衡致死系统。

关键词：FDA 沙门氏菌受体菌Red重组系统asd基因缩略语及英汉对照Amp ampicilin 氨苄青霉素Cm chloroamphenicol 氯霉素FDA Food and Drμg Administration 食品和药物管理局DAP diaminopimelic acid 二氨基庚二酸asd aspartate semialdehyde dehydrogenase asd基因ddH2O double distilled water 双蒸水dNTPs deoxyribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷LB Luria-Bertani细菌基础培养基h hour 小时min m inutes 分钟mL milliliter 毫升mmol millimolar 毫摩尔mol molar 摩尔PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应rpm round per minute 每分钟转数s seconds 秒RNA ribonucleic acid 核糖核酸μL micro litre 微升μmol micro molar 微摩尔Structure of Salmonella X4062 Chromosome-plasmid Balance to DeathSystemLiu Yongwei(College of Life Science, South China AgricμL tural University, Guangzhou 510642, China) Abstract：In view of a variety of resistant strains of clinical continuously producing and quickly spreading, the FDA ( Food and Drμg Administration ) has banned recombinant strains used in production and contain antibiotics resistance genes as the carrier of screening mark plasmid.Chromosome-plasmid balance to death system is developed in recent years to class with the antibiotic selection markers as the carrier of expression system. It usually is a kind of host bacterium chromosome steward of the mutant gene.The defects type strains can't grow in basic medium and while the complementary plasmid with complete genetic is imported in it, the plasmid and the defect type strains will structure a chromosome-plasmid balance to death system as genetic complementary. At this time, the complementary plasmid plays a functional complementary role which host the growth of the host bacterium. Once the plasmid lost, the host bacterium woμLdn’t be able to synthesis necessary material and death.Based on the known sequences of the gene asd on the chromosome of reduction poison salmonella, structure the salmonella X4062’s mutation without gene asd, X4062 △asd::cat. In the second restructuring, make the plasmid pCP20 carrying the gene which can express FLP site specificity restructuring enzyme use of mediating the second homologous restructuring to remove the Chloramphenicol resistance screening gene of the lack mutation in the above. Combined with the resμL t of PCR amplification and sequencing, prove that the salmonella X4062’s lack mutation is structured correctly. Moreover, copy the gene asd fragment from the genome of salmonella X4062 and combine it in the plasmid pEGFP with the gene express fluorescent protein, named pMD-asd. the lack mutations lost aren’t able to grow in the ordinary LB medium until adding DAP or importing the plasmid with gene asd(pMD-asd). Compared with salmonella X4062 prototype, their growth speed, growth logarithm period and the transformation efficiency of accepting the plasmid in different number of copies are nearly consistent. Based on the lack mutations construct the salmonella chromosome-plasmidbalance to death system with asd nutrition gene as sign.Key words:FDA Salmonella Receptor bacteria Red reorganization system Gene目录1 前言 (1)1.1 减毒沙门氏菌载体系统的研究进展 (1)1.1.1 减毒细菌活载体疫苗 (1)1.1.2 减毒沙门氏菌活载体疫苗的应用 (1)1.1.3 减毒沙门氏菌进入机体免疫系统的机制 (2)1.1.4 沙门氏菌的减毒 (2)1.2 研究意义与目的 (6)1.3 研究内容 (6)1.4 技术路线 (6)2 材料与方法 (7)2.1 实验材料、试剂和仪器 (7)2.1.1 毒株、细胞、菌株及质粒 (7)2.1.3 培养基、试剂的配制 (7)2.1.4 仪器和器材 (9)2.2方法 (9)2.2. 减毒鼠伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建 (9)2.2.1 菌株与质粒 (9)2.2.2 引物设计 (10)2.2.3 asd基因的制备 (10)2.2.4 含FRT位点和cat基因的同源重组片段的制备和纯化 (11)2.2.5 沙门氏菌电转感受态细胞的制备 (12)2.2.6 重组酶质粒pKD46的转化和诱导表达 (12)2.2.7 asd基因的敲除 (13)2.2.8 沙门氏菌△asd::cat的鉴定 (13)2.2.9 氯霉素抗性基因的去除 (13)2.3 含EGFP的双启动子互补表达载体pCLA-EGFP的构建 (14)2.3.1 表达载体pCLA-EGFP的构建策略 (14)2.3.2 载体构建所用引物 (14)2.3.3 重组质粒pCLA-EGFP的构建 (16)2.3.4 pCLA-EGFP质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4062（Δasd）中的表达 (19)2.3.5 pCLA-EGFP质粒在X4062（Δasd）中的体外遗传稳定性实验 (19)3 结果与分析 (19)3.1 减毒鼠伤寒沙门氏菌△asd缺失株的构建 (19)3.1.1 asd基因的制备 (19)3.1.2 含FRT位点和cat基因的同源重组片段的制备 (20)3.1.3同源重组菌(△asd::cat)的PCR鉴定 (21)3.1.4重组菌沙门氏菌△asd的鉴定 (22)3.2重组质粒pCLA-EGFP的构建及鉴定 (23)3.2.1 pCL-EGFP片段的扩增 (23)3.2.2asd基因的扩增 (23)3.2.3 重组质粒pCLA-EGFP的鉴定 (24)3.3重组质粒pCLA-EGFP在鼠伤寒沙门氏菌X4062Δasd中的表达 (24)3.4 pCLA-EGFP质粒在X4062（Δasd）中的体外遗传稳定性 (25)3.5重组菌X4062Δasd（pCLA-EGFP）表达产物的SDS-PAGE分析 (25)4 讨论 (26)参考文献 (28)致谢 (32)附录 (33)华南农业大学本科专业毕业论文成绩评定表 (34)1 前言1.1 减毒沙门氏菌载体系统的研究进展1.1.1 减毒细菌活载体疫苗载体疫苗是将所需的编码病原特异性抗原的DNA片段插入减毒的活细菌或病毒载体，以提呈表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的作用。