细胞周期的检测方法

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2014-5-6 PI法细胞周期检测

细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。

S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。

G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。

一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。

因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。

通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。

流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。

在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。

通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。

PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。

PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是细胞分裂和增殖的过程，通常可以通过PI（propidium iodide）染色来检测。

PI是一种DNA结合染料，能够与DNA结合形成荧光化合物，通过检测荧光信号的强度可以推断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

以下是PI染色检测细胞周期的实验步骤：材料和试剂：1.培养皿：可容纳细胞的培养皿。

2.培养基：细胞所需的培养基。

3. Propidium iodide（PI）：DNA结合染料。

4. RNase A：消化RNA的酶，可用于将RNA从细胞样品中降解。

5.细胞刮板：用于收集细胞。

6.离心管：用于离心细胞样品。

7.显微镜幻灯片：用于观察染色后的细胞。

步骤：1.准备培养皿：在培养皿中加入适量的培养基，使其能够完全覆盖细胞。

2.培养细胞：将需要检测细胞周期的细胞加入培养皿中，按照细胞的培养要求进行培养，培养至细胞密度适合进行实验。

3.收集细胞：用细胞刮板或其他方法，将细胞从培养皿中收集到离心管中。

4.细胞固定：将收集到的细胞进行固定，可以使用70%乙醇或其他细胞固定剂进行处理，固定时间通常为30分钟。

5.细胞孵育：将固定的细胞在4℃下孵育过夜，以保证细胞完全固定。

6. 细胞溶解：在离心管中加入RNase A（最终浓度一般为1mg/ml），以降解细胞中的RNA，避免对细胞周期分析结果的干扰。

7. 细胞染色：在离心管中加入适量的PI溶液（一般最终浓度为50μg/ml），将PI与DNA结合，产生荧光信号。

8.染色孵育：将含有PI的细胞溶液在4℃下孵育30分钟至1小时，使PI完全结合到DNA上。

9.细胞分析：将染色后的细胞用离心机离心，去除上清液，保留细胞沉淀。

10.流式细胞仪分析：将细胞沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中，使用流式细胞仪进行细胞周期分析，记录和分析PI的荧光信号的强度。

11.显微镜观察：将细胞沉淀取出，在显微镜幻灯片上制备细胞悬液，并使用荧光显微镜观察细胞的DNA染色情况。

PI染色法检测细胞周期

PI染色法检测细胞周期一．实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。

乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。

2.试剂配制RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。

PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。

二．实验步骤1.细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。

2.细胞的固定：将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。

（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）3.RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500μL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。

PI染色法测细胞周期

PI染料与DNA结合
PI染料能够选择性地结合DNA，通过荧光显微镜可以观察到染色后的细胞核。
数据分析
通过特定的软件对数据进行处理和分析，可以获得细胞周期的分布情况。
细胞周期分析
通过对染色后的细胞核进行荧光强度和面积的测量，可以分析细胞的细胞周期状态。
PI染色法的应用
肿瘤研究
通过PI染色法可以研究肿瘤细胞的细胞周期变化，为肿瘤的诊断和治疗提供依据。
05
注意事项
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中进行，以减少有毒气体的吸入。
02
实验过程中应佩戴实验服和化学防护眼镜，以防止试剂溅到皮
肤或眼睛。
实验后应将废液倒入指定的废液收集容器中，不要随意倾倒。
03
实验操作注意事项
确保细胞浓度适中，以保证计数准确性。
在洗涤过程中要彻底去除多余的染料，以免影响计数结果。
02
PI染色法原理
PI染料的特性
01
02
03
高荧光强度
PI染料具有高荧光强度，能够有效地与DNA结合，发出强烈的荧光信号。
专一性
PI染料只与DNA结合，不与其他细胞成分结合，具有专一性。
细胞膜通透性
PI染料能够透过细胞膜，与细胞核中的DNA结合，实现对细胞核的染色。
PI染色法的原理
干燥细胞
让涂片自然干燥，以便更好地观察染色效果。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察涂片，记录不同时期细胞的染色情况。
04
结果分析
细胞周期各期的划分
G1期
细胞开始生长，DNA合成前期，细胞体积逐渐增大。
S期
DNA复制期，细胞核内DNA含量加倍。

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法

组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。

主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。

2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。

3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。

4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。

5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。

注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。

如组织难以消化，可加入适量胶原酶。

另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。

2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。

3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。

4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。

其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。

在此不赘述。

yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。

应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。

细胞周期测定实验

细胞周期测定实验细胞计数法：实验方法原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。

它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

实验材料细胞试剂、试剂盒胰酶甲醇培养液冰醋酸Giemsa染液仪器、耗材CO2培养箱普通显微镜培养皿盖玻片吸管实验步骤一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

三、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

五、计算分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%展开注意事项1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。

其他一、Giemsa染液配制称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。

56℃中保温90-120分钟。

加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。

使用时按要求用PBS稀释。

一般稀释10倍。

BrdU参入法实验方法原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。

从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。

细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。

如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。

细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。

计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

实验材料细胞试剂、试剂盒BrdU 甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC 柠檬酸三钠NaCl仪器、耗材冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜实验步骤一、试剂配制1. BrdU配制BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

细胞周期检测方法

细胞周期检测方法细胞周期检测是指利用特定的实验方法和技术来研究和分析细胞的生命周期和不同阶段的变化。

细胞周期是指细胞从一个时间点开始进行DNA复制，到下一个DNA复制结束之间的时间段。

细胞周期检测方法可以帮助我们了解细胞的增殖、分化和死亡过程，并在生物医学研究中发挥重要作用。

本文将介绍几种常用的细胞周期检测方法。

一、流式细胞术流式细胞术是一种常见的细胞周期检测方法，通过利用细胞在流式细胞仪中流动时吸收和散射光的不同特性来分析细胞的周期。

在流式细胞术中，可以使用DNA 染料（如普罗津红或荧光素）将细胞的DNA染成不同浓度的颜色，根据DNA 含量的不同来分析细胞处于不同的细胞周期阶段。

此外，流式细胞术还可以利用蛋白标记和单克隆抗体来检测特定细胞周期蛋白的表达水平。

流式细胞术准确、快速、灵敏，可以同时检测大量的细胞，因此被广泛应用于细胞周期的研究和生物医学领域。

二、免疫荧光染色法免疫荧光染色法是一种利用免疫学技术和荧光探针对特定蛋白进行定位和分析的方法。

在细胞周期检测中，可以利用特定蛋白的表达来反映细胞处于不同的细胞周期阶段。

例如，细胞周期蛋白D（Cyclin D）在G1期表达增加，在细胞周期的S期和G2期表达较低。

通过使用与Cyclin D特异性结合的荧光探针，可以在细胞中观察和分析Cyclin D的表达情况，从而判断细胞处于细胞周期的哪个阶段。

三、细胞核酸染色法细胞核酸染色法主要利用染色剂（如乙锭、Hoechst33342等）染色DNA分子，观察和分析细胞核的形态和DNA含量的变化来判断细胞的细胞周期阶段。

在染色前后使用不同颜色的荧光染料来观察和分析细胞核的变化。

通过测量细胞核中DNA含量的变化，可以确定细胞处于细胞周期的哪个阶段。

此外，细胞核酸染色法还可以与流式细胞术或免疫荧光染色法相结合使用，进一步提高细胞周期的检测准确性和灵敏度。

四、蛋白质组学方法蛋白质组学方法是一种通过比较和分析细胞中蛋白质的表达、修饰和互作来研究细胞功能和生命周期的方法。

流式检测细胞周期protocol

PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。

试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。

5 6 PI法细胞周期检测

货号
PBS
自配
2. 试剂配制 10XPBS 液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以 1L 量为例： NaCl 80g Na2HPO4·12H2O 32.3g NaH2PO4·2H2O 4.5g （十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水 900mL 左右，用 HCl/NaOH 调 pH 至 7.4，最后定容为 1000mL。使用时用去离子水稀释成 1XPBS 3.仪器设备
注意事项
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，通系电1，力过根保管据护线生高0不产中仅工资2艺料22高试2可中卷以资配解料置决试技吊卷术顶要是层求指配，机置对组不电在规气进范设行高备继中进电资行保料空护试载高卷与中问带资题负料2荷试2，下卷而高总且中体可资配保料置障试时2卷，32调需3各控要类试在管验最路；大习对限题设度到备内位进来。行确在调保管整机路使组敷其高设在中过正资程常料1工试中况卷，下安要与全加过，强度并看工且25作尽52下可22都能护可地1关以缩于正小管常故路工障高作高中；中资对资料于料试继试卷电卷连保破接护坏管进范口行围处整，理核或高对者中定对资值某料，些试审异卷核常弯与高扁校中度对资固图料定纸试盒，卷位编工置写况.复进保杂行护设自层备动防与处腐装理跨置，接高尤地中其线资要弯料避曲试免半卷错径调误标试高方中等案资，，料要编试求5写、卷技重电保术要气护交设设装底备备置。4高调、动管中试电作线资高气，敷料中课并设3试资件且、技卷料中拒管术试试调绝路中验卷试动敷包方技作设含案术，技线以来术槽及避、系免管统不架启必等动要多方高项案中方；资式对料，整试为套卷解启突决动然高过停中程机语中。文高因电中此气资，课料电件试力中卷高管电中壁气资薄设料、备试接进卷口行保不调护严试装等工置问作调题并试，且技合进术理行，利过要用关求管运电线行力敷高保设中护技资装术料置。试做线卷到缆技准敷术确设指灵原导活则。。：对对在于于分调差线试动盒过保处程护，中装当高置不中高同资中电料资压试料回卷试路技卷交术调叉问试时题技，，术应作是采为指用调发金试电属人机隔员一板，变进需压行要器隔在组开事在处前发理掌生；握内同图部一纸故线资障槽料时内、，设需强备要电制进回造行路厂外须家部同出电时具源切高高断中中习资资题料料电试试源卷卷，试切线验除缆报从敷告而设与采完相用毕关高，技中要术资进资料行料试检，卷查并主和且要检了保测解护处现装理场置。设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。

细胞周期的流式检测方法

细胞周期的流式检测方法细胞周期（cell cycle ）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为G0/G1 期、S 期、G2/M 期。

在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。

细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA 进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI 从而测定细胞群体的周期分布。

因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson ）公司生产的BD FACSCalibur 流式细胞仪测定PI 标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。

一、PI 染色步骤概略1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min ，弃上清。

2、PBS 1ml 离心，弃上清。

3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。

4、PBS 1ml 离心，弃上清。

5、RNase A 的PBS 溶液(20ug/ml) ，500ul，37℃，30min，离心弃上清。

6、PBS 1ml 离心，弃上清。

7、PI 的PBS 溶液(50ug/ml) ，500ul，室温避光孵育30min。

8、吹打混匀，300 目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。

二、Calibur 仪器设置及数据收集1、依次打开Calibur 机器电源、电脑开关和CellQuest Pro 软件，按快捷键Command+B 连机，按快捷键Command+1 、2、3、4 调出Detectors/Amps 面板、Threshold 面板、Compensation面板和Status面板，软件的操作界面如图 1 所示。

图1. Cell Quest Pro 软件操作界面2、建立实验模板，包括FSC/SSC 散点图、FL2-W/FL2-A 散点图和FL2-A 直方图。

因为PI在Calibur 上是由488nm 的激光器激发，530/30 滤光片收集信号，所以选择FL2 通道进行检测。

细胞周期是2N 和4N 的循环，所以FL2 通道的Mode 参数应设置为Lin 模式，同时阈值（Threshold）的Primary Param 参数设置为FL2-H ，Four Color DDM Param 参数设置为FL2，如图2、图 3 所示。

流式细胞仪检测细胞周期原理和方法

流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。

它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。

流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。

流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。

细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。

在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。

细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。

G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。

接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。

而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。

1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。

同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。

2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。

如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。

如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。

3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。

细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。

同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。

4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。

利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。

根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。

检测细胞周期的方法

检测细胞周期的方法细胞周期是细胞的一个重要生命周期阶段，包括细胞的增殖和分裂过程。

细胞周期的检测方法主要包括直接观察法、细胞计数法、细胞染色法、蛋白质检测法等。

以下将详细介绍这些方法及其优缺点。

1. 直接观察法：直接观察法是通过显微镜观察细胞形态和结构的变化来判断细胞周期的进程。

通过观察细胞的形态变化，如细胞大小、形状、染色体构象等，可以初步判断细胞处于哪个周期。

这种方法简单方便，但只能对有核细胞进行观察，且对于快速增殖的细胞不够敏感。

2. 细胞计数法：细胞计数法是通过对大量细胞进行统计，根据细胞数量的变化来推测细胞周期的进程。

可以通过细胞计数仪或显微镜进行计数，计算不同阶段的细胞比例。

这种方法适用于标记有核细胞或细胞核。

但此方法无法判断具体是哪个细胞周期阶段和细胞死亡。

3. 细胞染色法：细胞染色法是通过特定染色剂染色，观察染色结果来判断细胞周期的进程。

常用的染色方法包括苏木精-伊红染色法、Geimsa染色法、草铥酸盐-吉姆萨染色法等。

通过这些染色方法，可以看到细胞和细胞核的结构变化，如染色形态、核分裂消失和再出现、染色体过程等。

虽然这种方法对于辨别不同细胞周期阶段有很高的准确性，但是染色过程会对细胞造成损伤，有时甚至对细胞结构和细胞器的形态有一定干扰。

4. 蛋白质检测法：蛋白质检测法是通过检测细胞周期与特定蛋白质表达之间的关系来判断细胞周期的进程。

细胞周期的不同阶段通常伴随着特定蛋白质的表达和活化，通过检测这些蛋白质的表达水平可以推测细胞的周期分布情况。

常用的方法包括免疫荧光染色、免疫组织化学染色和Western blot等。

这些方法可以定量分析特定蛋白质的表达水平，提供一种精确迅速的数据分析手段。

但是该方法需要有特异性高的抗体和相关试剂的支持，且需要一定的实验技术和设备。

除了上述常用的方法，还有一些新的技术在细胞周期的检测中也得到了广泛应用。

例如流式细胞术（Flow cytometry）结合DNA染色剂如荧光素蓝、荧光素染色法等可用于准确分析细胞周期不同阶段的比例；定量实时荧光定位杂交（Quantitative Real-time Fluorescent In Situ Hybridization）可定量地检测和定位染色体上的特定基因；最近兴起的单细胞测序技术，可用于更加精细地分析细胞周期的状态及其调控网络。

PI单染流式细胞术检测细胞周期

1.消化：将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化1-3min，（时间尽可能长，以减少吸管吹打），待消化充分，弃去胰酶，加入PBS5ml。

2.收集细胞：吸管吹打，移入离心管。

3.低速度离心：1000转5min弃去上清。

4.反复漂洗离心：加入PBS5-8ml，低速离心，同上步，重复3次，以除去细胞碎片。

5.获得单细胞悬液：加入1mlPBS，调整单细胞悬液至1-5*10^6/l，吸管吹打，制成单细胞悬液，4度保存。

6.PI染液制备：100ml去离子水加入5mgPI。

调PH值7,2-7。

4度棕色瓶保存。

4度避光保存。

7.、加入-20度预冷的乙醇。

4度过夜。

8.1000转5分钟离心弃去上清，
9.加入3mlPbs重悬。

10.1000转5分钟离心弃去上清，
11.加入100ulRNA酶37度水浴孵育30min
12.加入500ulPI染液4度避光孵育30min
13.上机前轻弹试管，，设立PI单染细胞组，检测。

流式细胞仪检测细胞周期原理和方法

流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（FCM）检测细胞周期的原理和方法高考和模拟试题中经常会出现流式细胞仪检测细胞周期图像，那么，什么是流式细胞仪？如何检测细胞周期？流式细胞仪是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

流式细胞仪，又称荧光激活的细胞分选器，作为进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体力学、图像技术、细胞生物学、免疫学理论于一体，是一种非常先进的检测仪器，被誉为生物医学实验室的“CT”。

流式细胞术已经成为一种用途最广泛和最先进的细胞分析技术，在细胞生物学、血液学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域发挥着重要作用。

流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由流动室与液流系统、激光源与光学系统、光电管与检测系统、计算机与分析系统四部分组成（如图）。

典例分析（2015年北京高考试题）流式细胞仪可根据细胞中DNA含量的不同对细胞分别计数。

研究者用某抗癌药物处理体外培养的癌细胞，24小时后用流式细胞仪检测，结果如图。

对检测结果的分析错误的是A．b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍B．a峰和b峰之间的细胞正进行DNA复制C．处于分裂期的细胞均被计数在a峰中D．此抗癌药物抑制了癌细胞DNA的复制【答案】C【解析】从题目图中我们不难看出有两个峰值细胞的数目最多，分别对应的DNA含量为40和80。

可知40的应该是处于分裂间期的G1期细胞，G1期时间比较长。

而80的细胞应该是属于G2期和分裂期的细胞，DNA含量已经加倍。

因此A选项中b峰中细胞的DNA含量是a峰中的2倍是正确的。

B选项中a峰和b峰之间应该是细胞周期中的S期，正在进行DNA分子复制。

C选项中，处于分裂期的细胞DNA含量处于加倍状态，应该计数在b峰中。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤PI（Propidium Iodide）染色是一种常用的细胞周期分析方法，可用来定量分析细胞在不同细胞周期阶段的比例。

下面是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤：实验步骤：1.细胞培养：将要进行细胞周期实验的细胞株在无菌条件下培养至富有活力的生长期，并确保细胞数目足够。

2.细胞收获：将培养皿中的细胞用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤2次，以去除残留的培养基和衰老细胞。

然后用细胞解离液将细胞从培养皿上彻底剥离。

3.细胞计数：采用显微镜或血球计算板等工具计数细胞数目。

确保每个实验条件下的细胞数相似。

4. 固定细胞：用70%（体积比）的乙醇在-20℃的环境中将细胞固定。

将乙醇均匀地加入细胞悬浮液中，一般细胞浓度为1×10^6/ml。

放置细胞悬液在-20℃的冰箱中固定1小时。

5.染色：将固定的细胞在室温下洗涤2次PBS。

制备PI染色液，可以选择适当的PI浓度（如50μg/mL）然后将染色液加入洗涤后的细胞悬液中，使之均匀包涵。

在黑暗中静置15分钟以便细胞充分染色。

6.流式细胞仪检测：使用流式细胞仪对染色后的细胞进行检测。

在流式细胞仪前，将细胞过滤，以去除聚团的细胞。

7.数据分析：使用流式细胞仪的软件或其他分析软件对所得数据进行细胞周期分析。

基于DNA含量，细胞可以被分为G0/G1、S和G2/M三个周期阶段，通过计算这些细胞的百分比可以得到细胞周期分布情况。

注意事项：1.实验要在无菌条件下进行，以避免细胞污染。

2.在染色时，应在黑暗的环境中操作，以避免PI受光照的影响。

3.使用流式细胞仪时，要注意正确设置仪器参数，以获取准确的测量结果。

4.实验前后仔细清洁工作区和实验设备，以防止交叉污染。

以上就是一种常见的PI染色检测细胞周期实验步骤，根据实验的需求和细胞类型的不同，还可以对实验步骤进行适当的调整。

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤

流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。

在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。

以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。

根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。

2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。

碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。

RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。

磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。

流式细胞仪专用的上样管。

3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。

离心机：用于离心细胞。

二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。

2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。

3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。

4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。

5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。

三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。

2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。

乙醇的最终浓度应在 70%左右。

3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。

四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。

2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。

3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。

4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。

细胞周期实验报告

细胞周期实验报告一、实验目的本实验旨在研究细胞周期的各个阶段，包括 G1 期、S 期、G2 期和M 期，以及细胞在不同阶段的生理和生化变化。

通过对细胞周期的深入了解，有助于我们更好地理解细胞生长、分裂和遗传物质传递的机制，为相关疾病的研究和治疗提供理论基础。

二、实验原理细胞周期是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程。

细胞周期的进程受到多种因素的调控，包括细胞内的一系列信号通路和蛋白质复合物。

常用的检测细胞周期的方法是利用流式细胞术，通过对细胞内DNA 含量的测定来区分不同的细胞周期阶段。

处于 G1 期的细胞具有二倍体的 DNA 含量，S 期细胞的 DNA 含量逐渐增加，G2 期和 M 期细胞具有四倍体的 DNA 含量。

三、实验材料与方法（一）实验材料1、细胞株：选用_____细胞株。

2、试剂：胰蛋白酶、PBS 缓冲液、70%乙醇、PI 染液、RNA 酶等。

3、仪器：流式细胞仪、离心机、显微镜等。

（二）实验方法1、细胞培养将细胞接种在培养皿中，在含10%血清的培养基中，置于37℃、5% CO2 的培养箱中培养，待细胞汇合度达到 80%左右时进行实验。

2、细胞收集用胰蛋白酶消化细胞，离心收集，用 PBS 缓冲液洗涤两次。

3、固定细胞将细胞沉淀重悬于 70%乙醇中，于－20℃固定过夜。

4、染色离心去除乙醇，用 PBS 缓冲液洗涤细胞，加入 PI 染液和 RNA 酶，避光孵育 30 分钟。

5、流式细胞术检测用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，分析细胞周期各阶段的分布比例。

四、实验结果（一）细胞周期各阶段的比例通过流式细胞术分析，得到以下细胞周期各阶段的比例：G1 期：＿____%S 期：＿____%G2 期：＿____%M 期：＿____%（二）结果分析1、 G1 期比例较高，可能表示细胞处于静止或生长缓慢的状态。

2、 S 期比例适中，说明细胞正在进行 DNA 合成，细胞的增殖活动正常。

3、 G2 期和 M 期比例相对较低，可能与细胞的生长条件或细胞本身的特性有关。

PI染色检测细胞周期实验步骤

PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是指细胞从一个开始时期，经过一系列的生长、分裂和分化过程后，再次回到原点开始的一个完整周期。

细胞周期是细胞生物学中一个重要的研究领域，对于理解细胞生物学的基本规律以及细胞增殖和分化过程具有重要意义。

其中，PI染色是一种常用来检测细胞周期的方法，下面将详细介绍PI染色检测细胞周期的实验步骤。

实验所需材料和仪器：1.细胞培养液2.细胞培养器具（细胞培养板、培养瓶等）3.离心机4. PI染色溶液（含有荧光染料Propidium Iodide的溶液）5.双色流式细胞仪6.PBS缓冲液实验步骤：1.细胞培养及处理a.选择需要研究的目标细胞，并进行适当的处理。

b.将目标细胞培养在合适的培养液中，并在37摄氏度、5%CO2的恒温培养箱中培养至所需的状态。

2.细胞收获和处理a.将细胞培养液转入培养细胞的容器中（如培养板、培养瓶等），通过离心机低速离心收集细胞。

b.将细胞沉淀在PBS缓冲液中，然后再次进行离心，去除上清液，并将细胞沉淀用PBS缓冲液进行重悬。

3.细胞固定a.用PBS缓冲液溶解适量的细胞固定剂（如乙醛或甲醛）制备1%细胞固定液。

b.向细胞悬液中加入1%细胞固定液并充分混合，使细胞固定。

4.细胞染色a.将固定的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除细胞固定剂。

b.向细胞悬液中加入适量的PI染色溶液，并在暗处孵育30分钟。

5.流式细胞仪检测a.将染色后的细胞用PBS缓冲液进行洗涤，去除多余的染色剂。

b.将洗涤后的细胞悬液用PBS缓冲液进行重悬。

c.将细胞悬液转移到流式细胞仪的样品管中。

d.使用流式细胞仪进行细胞周期的检测，记录细胞的荧光强度和数量，得到细胞的周期分布。

6.数据分析a.使用流式细胞仪软件分析细胞周期的数据。

b.统计不同细胞周期阶段的细胞数量，并绘制相应的细胞周期分布图。

c.分析细胞周期分布的差异，并进一步探究细胞周期调控的机制。

需要注意的事项：1.在实验过程中，要保持实验环境的洁净和无菌，以避免细胞污染和结果失真。

细胞周期检测

细胞周期
1、原理
碘化丙啶(Propidium Iodide，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。

碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。

细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

2、步骤
2.1细胞处理
悬浮细胞：收集悬浮细胞5~20×10⁵于离心管中，300 g/5min 离心，弃去培养液；
加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷) 洗涤一次，300 g/5min 离心，弃去上清，弹散
管底沉淀；
贴壁细胞：贴壁细胞弃去培养基，加入胰酶消化，待消化完全后，培养基终止消化，
吹散细胞，300 g/5min 离心，弃去培养液；加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷)洗涤
一次，300g/5min 离心，弃去上清，弹散管底沉淀；
2.2细胞固定
将用PBS洗涤好的细胞用250ul预冷的PBS重悬，吹打混匀，将预冷的750ul无水
乙醇缓缓滴入重悬的细胞内，混匀，-20℃固定过夜。

600 g/10min离心，沉淀细胞，
对于特定的细胞如果沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心
吸除上清，可以残留50μl左右的乙醇，以免吸走细胞。

加入约5ml冰浴预冷的PBS,
重悬细胞，离心收集细胞，小心吸除上清，可以预留50μl的PBS，以免吸走细胞。

轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

2.3细胞染色
加入500ul FxCycle™ PI/RNase 染色溶液，混匀，室温孵育30min，上机检测。