流式细胞仪检测细胞周期操作步骤之欧阳家百创编
流式细胞仪的使用程序
流式细胞仪的使用程序------血液病实验诊断中心一.开机程序1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。
2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS 或FACSFlow),合上压力阀。
确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。
3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印,打开打印机电源。
5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。
7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。
二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x 轴和y轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。
4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。
. 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测, EXP用于细胞表面标志分析。
手把手教你流式细胞周期检测（一）
手把手教你流式细胞周期检测（一）细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
G2期和M期：当DNA复制成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
从DNA含量我们同样无法区分G2期和M期。
流式细胞仪工作原理：将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是经典的周期检测方法。
PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
图片来自网络1材料准备6孔板；15ml离心管；胰酶；RNase-A；PI；无水乙醇（四度冷藏）；PBS2仪器设备流式细胞仪；离心机；水浴；锡箔纸3实验步骤及注意事项：（以细胞加药为例）细胞样品的准备细胞消化和固定后不可过度吹打,防止细胞碎片1. 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)2. 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;3. 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。
流式分析细胞周期
流式分析细胞周期
最近在做加药物的细胞周期，做了好几次，出现如下图的流式拟合图，师姐们都说你这样的拟合是强行的拟合，s期不明显，需要重新做，可是做了好多次还是这样的结果。
望专家教教我是哪里出错。
做细胞周期的步骤是：
1. 先铺板，2E5/孔。
过夜培养后加药（24h）
2. 再经过24h后可以进行测量。
3. 收集上清，并用PBS洗涤，再用胰酶消化，接着用PBS再洗一遍（在15ml管子中进行）
4. 1500转离心，小心去除上清，加入1ml的预冷PBS（记得要冲洗一下管壁），混匀后吸到1.5ml管中，再次在大厅中的离心机1500转4-5min（经过这样的一遍洗涤即可）
固定
5. 用枪吸走上清，剩余50ul左右，切勿吸走细胞，随后➕300ul 预冷PBS（用左手拿着EP管小拇指抵住涡旋震荡仪，右手拿住吸有700ul的乙醇的枪）缓慢打入其中，（这个过程尽量要慢）
6. 置于-20°冰箱中20min（有的说1h），若是过夜要要置于4°（有的说4h以上）
7. 1500转离心3-5min，小心吸上清
8. 加入1ml预冷PBS，重悬
9. 1500转离心3-5min，吸取上清，轻弹
染色
10. 0.5ml/管的碘化丙锭染色液（PI）缓慢加入，并充分的混匀
11. 37°避光30min
先配好染色的溶液
12. 4°避光存放2h
13. 上流式仪。
BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞周期-操作步骤
BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。
2、把鞘液桶装上，拧紧。
3、开左边开关，从右向左依次打开，即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。
（关机时从左向右关）。
4、按流式细胞仪开关。
换上新的已装超纯水的流式管。
5、将减压阀调至“run”（水缸旁边的黑色按钮）。
6、排气：将白色的手动排气阀从小头向大头移动，排气，2-3次，至无气泡。
最后停至小头。
自动排气：开始时是“低速”“standby”，调至“低速”“prime”，待排气完成会自动跳到“standby”，如此循环，到流式管内无气泡为止。
7、插电脑白色插头，打开电脑。
8、到无气泡时候调到“hign”“run”。
9、输入开机密码，打开电脑桌面上的“CELLQuest”（第四个图标）启动软件。
File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件（cell dw 2018LSD）→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期，count改成1，即从第一个开始。
10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire，看是否正常。
11、上样。
使仪器处于low run状态，样品管支架左移，上样品管后支架回位。
确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾（即不收集数据，用于仪器设置），点击Acquire。
仪器设置完成后，取消Setup前的“√”，点击Acquire 正式开始收集数据。
调界面操作：Cytometer → Detectors/Amps出现 Detectors/Amps 界面后，调FSC和SSC和FL2和FL2-W。
FSC调节的是门内(R1)细胞位置的左右，FSC的“Voltage”调到“E-1”，“E-1”是指个体很大细胞；“Amo Gain”的值调节门内(R1)细胞位置的宽度。
流式细胞仪操作流程(单标)
流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。
（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。
3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。
以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。
4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。
三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。
2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。
3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。
4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法I流式细胞仪（FCM ）检测细胞周期的原理和方法高考和模拟试题中经常会出现流式细胞仪检测细胞周期图像，那么, 什么是流式细胞仪？如何检测细胞周期?流式细胞仪是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检査相比，具有速度快、精度高.准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
流式细胞仪，乂称荧光激活的细胞分选器，作为进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体力学、图像技术、细胞生物学、免疫学理论于一体，是一种非常先进的检测仪器,被誉为生物医学实验室的“CT"。
流式细胞术已经成为一种用途最广泛和最先进的细胞分析技术，在细胞生物学、血液学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域发挥着重要作用。
流式细胞讣的基本结构流犬细胞计主要山流动室与液流系统、激光源与光学系统、光电管与检测系统、计•算机与分析系统四部分组成（如典例分析 槽品»・正电荷偏 •分光的向第散射尤检测話 植満充Mi 信号•夕 ••負电（2015年北京高考试题）流式细胞仪可根据细胞中DNA 含量的不同对细胞分别计数。
硏究者用某抗癌药物处理体外培养的癌细胞，24小时后用流武细胞仪检测，结果如图。
对检测结果的分析错误的是【答案】C【解析】从题目图中我们不难看出有两个峰值细胞的数U 最多，分别 对应的DNA 含量为40和80。
可知40的应该是处于分裂间期的G1期细胞，G1期时间比较长。
而80的细胞应该是属于G2期和分裂期的细胞，DNA 含量已经加倍。
因此A 选项中b 峰中细胞的DNA 含量是a 峰中的2倍是正确的。
B 选项中a 峰和b 峰之间应该是细胞周 期中的S 期，正在进行DNA 分子复制。
C 选项中，处于分裂期的细胞DNA 含量处于加倍状态，应该i|•数在b 峰中。
D 选项通过看右侧图可知b 峰明显下降，可知应该是抑制了 DNA 分子的复制，DNA加倍的细胞明显减少，所以D 选项正确。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪操作流程
查看文章流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ2008-11-01 10:20一PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器l PBS溶液（配制方法见附录）；l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
l 70%乙醇l 400目筛网l 流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤(仅供参照)
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管↓提前一天网上预约↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱↓液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）↓荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C。
细胞周期的流式检测方法
细胞周期的流式检测方法细胞周期（）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为期、期、期。
在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行检测的需求。
细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是（碘化丙啶）渗入进行染色，然后通过流式细胞仪检测从而测定细胞群体的周期分布。
因此，下面笔者主要通过（＆）公司生产的流式细胞仪测定标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。
一、染色步骤概略、单细胞悬液离心，, ，弃上清。
、离心，弃上清。
、酒精，℃，，离心，弃上清液。
、离心，弃上清。
、的溶液()，，℃，，离心弃上清。
、离心，弃上清。
、的溶液()，，室温避光孵育。
、吹打混匀，目筛网过滤至流式管中，℃保存，待测。
二、仪器设置及数据收集1、依次打开机器电源、电脑开关和软件，按快捷键连机，按快捷键、、、调出面板、面板、面板和面板，软件的操作界面如图所示。
图. 软件操作界面2、建立实验模板，包括散点图、散点图和直方图。
因为在上是由的激光器激发，滤光片收集信号，所以选择通道进行检测。
细胞周期是和的循环，所以通道的参数应设置为模式，同时阈值（）的参数设置为，参数设置为，如图、图所示。
图. 面板图. 面板3、设置细胞的收集数目，数据保存的路径和名称，如图、图所示。
图. ＆面板图. 面板、在图所示的操作面板中，勾选选项，点击按钮进行数据收集并调节通道的电压值使得周期图位于直方图中合适的位置。
调好电压后，将选项勾掉，点击按钮收集数据。
数据以格式保存在之前预设好的文件夹中。
图. 面板三、细胞周期数据的分析流式数据分析软件有很多种，比如、、等等。
但对于细胞周期数据的分析，统一的分析步骤如下：1、建立散点图，圈定细胞群，如图所示。
图. 散点图2、建立散点图，去除粘连细胞，如图所示。
图. 散点图3、建立直方图分析细胞周期，如图所示。
图. 直方图。
流式细胞仪操作流程
流式细胞仪操作流程流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，它能够对单个细胞进行快速、准确的细胞分析和分类。
本文将详细介绍使用流式细胞仪的操作流程。
一、实验准备在进行流式细胞仪实验之前，需要做好以下准备工作：1. 准备样品：收集和准备待分析的细胞样品，确保样品质量符合要求。
处理样品时要注意细胞的保存和处理条件，以避免样品的污染或破坏。
2. 准备反应体系：根据实验的需要，按照标准操作规程制备所需的反应液和缓冲溶液。
3. 检查和校准仪器：在使用流式细胞仪前，需要对仪器进行检查和校准，确保仪器状态良好，获得准确的实验结果。
二、仪器开机和设置1. 打开流式细胞仪电源，并等待仪器启动完成。
2. 进行仪器的初始化设置，包括选择所需的参数和实验模式等。
3. 设置流式细胞仪的激发和检测通道，根据实验需要选择适当的滤光片和荧光探针。
调整激光功率和检测灵敏度，确保后续实验过程中的信号质量。
三、样品加载和检测1. 将样品转移到适当的离心管中，并进行样品标记。
根据实验需要可以使用荧光标记物、抗体等对细胞进行特异标记。
2. 打开流式细胞仪的样品载架，将样品离心管安置在载架上，并将载架插入流式细胞仪的样品槽中。
3. 启动数据采集软件，设置样品参数和实验条件。
选择合适的采集速度和事件数目，确保获得足够的数据。
4. 开始数据采集，点击软件上的“实时运行”按钮，流式细胞仪将开始读取样品中的细胞信息，并将其转化为电子信号。
5. 采集完成后，保存数据并关闭数据采集软件。
四、数据分析1. 导出数据文件：根据实验需要，将采集到的数据文件导出到数据分析软件中进行进一步处理。
2. 进行数据筛选和清洗，去除噪音污染和非特异信号。
3. 根据实验的目的和问题，选择合适的数据分析方法，对细胞数据进行统计学和生物学分析。
4. 生成结果图表：根据数据分析结果，生成合适的图表或图像，用于展示实验结果和研究发现。
5. 结论和讨论：根据数据分析结果，撰写实验结论和讨论，解释实验结果并提出相应的科学推论。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种现代生物学实验技术，主要用于检测和分析细胞的形态、结构、功能及其分子水平的变化。
它通过利用激光传感器探测透过细胞的激光散射或荧光信号，同时可以通过细胞的大小、荧光强度和荧光波长的变化将细胞分为不同的亚群。
流式细胞仪的使用已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学、生殖医学等领域。
流式细胞仪检测细胞周期的原理主要基于细胞的DNA含量不同于不同细胞周期阶段。
细胞周期通常分为G1期（细胞生长期）、S期（DNA复制期）、G2期（前期）、M期（有丝分裂期）和G0期（休止期）。
在细胞周期中，细胞会通过分子调控机制从一个阶段进入到下一个阶段。
细胞在G1期，其DNA含量为单倍体（2N）。
G1/S转变时，细胞准备开始进入DNA复制期（S期），在S期中，细胞的DNA含量翻倍，达到二倍体（4N）。
接下来，细胞进入G2期，准备进入有丝分裂期（M期），在M期，细胞的DNA含量达到四倍体（8N），细胞核开始分裂。
而G0期，则代表细胞处于休眠或未分裂状态，DNA含量不变（通常是2N）。
1.细胞样本制备：首先需要制备良好的单细胞悬浮液，通常通过细胞消化酶处理细胞集落或组织样本，将细胞分散为单细胞。
同时，还要对细胞进行化学固定或冷冻处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.细胞染色：将细胞进行荧光染色或抗体标记。
如果使用荧光染料，可以直接将染料加入到细胞悬浮液中，使其与DNA结合。
如果使用抗体标记，先将抗体与细胞混合，然后再加入荧光二抗进行染色。
3.流式细胞仪检测：将样品注入流式细胞仪仪器中。
细胞悬浮液在仪器中通过微细管道流动，激光通过细胞悬液时，细胞会散射激光，形成散射信号。
同时，荧光标记的细胞也会发出荧光信号。
4.数据分析：通过流式细胞仪仪器，可以获取每个单个细胞的散射与荧光信号。
利用仪器中的分析软件，可以对细胞的散射与荧光信号进行分析和计数。
根据荧光信号强度，可以对细胞进行不同周期阶段的区分和计数。
流式细胞仪的使用流程
流式细胞仪的使用流程1. 简介流式细胞仪 (Flow Cytometer) 是一种先进的生物学实验设备，用于检测和分析细胞的形貌、大小、形态、功能和数量等特征。
它可通过流式技术将单个细胞排列成单个的流束，然后通过激光器进行激发和检测，实现对细胞的高通量分析。
本文将介绍使用流式细胞仪的具体使用流程，帮助用户能够正确、高效地操作该设备。
2. 准备工作在正式操作流式细胞仪之前，需要做一些准备工作：2.1 样本准备•从培养皿中取出待分析的细胞，并进行适当的处理，如洗涤、离心等。
•将细胞悬浮液转移至离心管中，并进行适当的离心操作，以获得较为纯净的细胞样本。
2.2 仪器准备•打开流式细胞仪的电源开关，并等待设备启动完成。
•根据实验需要，调整仪器的相关参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•准备合适的背景溶液，用于样本的稀释和冲洗。
3. 操作步骤了解了准备工作后，下面将介绍流式细胞仪的具体操作步骤：3.1 样本准备与装载•使用移液器将经过处理的细胞悬浮液取出一定量至样本管中。
•观察样本管中的细胞悬浮液是否均匀分散，如果存在沉淀则轻轻摇晃样本管使之均匀。
3.2 仪器设置•在流式细胞仪的操作界面上设置相应的参数，如流速、激发光源、检测通道等。
•检查仪器的液路系统是否正常工作，如检查液体的流速、流量传感器是否正常等。
3.3 校准仪器•使用已知样本进行仪器的校准。
通常使用亮度微珠进行仪器的调整和刻度。
•在仪器设置界面选择亮度微珠的通道，并进一步设定检测参数以达到最佳校准效果。
3.4 样本测试•将样本管装载至流式细胞仪中的样本架上，确保样本与仪器的光学系统的光路对准。
•启动流式细胞仪，开始测试。
•根据实验需要，选择合适的激发光源和检测通道，进行样本的快速测试。
•在测试过程中，可根据实验需要采集样本的荧光和散射信号，以及其他额外的参数。
3.5 数据分析•测量完成后，通过流式细胞仪软件导出所测细胞的数据文件。
•使用相应的数据分析软件对所测细胞的数据进行分析和解读。
流式细胞术检测细胞周期的技术流程
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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的A549细胞，按1 x 106 cells/ mL 以1mL接种于100mn 培养皿内24h后，进行所需的处理（比如加药，照射）特定时间后终止培养，进行下一步的实验收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中lOOOrpm离心5min （短时低速离心）弃上清，用1.5ml预冷PBS lOOOrpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4C固定30min,或-20 C长期保存。
1OOOr/min, 离心5min将乙醇吸除，加PBS清洗混匀1000r/min,5min 再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去J吸除离心管内PBS加入200ul PBS和2ul的RNA B（0.25mg/ml）（37 C下孵育30min）J加入0.5ml 的50ug/ml 的PI 溶液室温下避光染色30minJ将离心管内的细胞过滤（300um尼龙网膜）至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管J提前一天网上预约J开机（先开仪器后开软件）J流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④ 信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
J检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激发光源）荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出3 臨 1 *w ri —rfjcpctfi * |ra^art rc* iJif Mode (K»*4khf ClrlWQg arf+Q结果分析--- Modfit软件分析剌甸2憾阻圉工庖黒書醫.叭二j :」Ma Ml Mnv MMak I MN.sn i pi丘七注《二因4拦熬二I-…祥・4・图片拷贝：直接Ctrl+C Flowjo软件分析Filt Id^ t Varkspac t Gr ourps T CID I S Tin^oife s Hrlpin画因@邑■Ju ^4 h-> M SfffCWlGrDgp吕Mid Indium电EZ.；；20130620 ad TCSL 20130620 3-2.TCSae i TIT*HHcamsB■{：} AllS^mpleB {}20430620 BDrag SiimF- L*- Edi ■ >H-taEFMK i>np‘ L Q.匕虫Hi址ID IWL L J b；；2013D62O a-3fcs .,20130025a^lfc&U 20130620 a-5fcs UJ013062 ^a-5ics U20i306?fla-7it5U 20130620 9-3TC3U 2013062Da-9Tcs；；2013062D a-io.res；；20130620a-11.fcs ；；201306203-12.fcsU 20130620 a-13 ItsU 20130620 a-!4ltsJhiriher aE 5anpL"■ ■］口|刘亠岬-.d叭15906435661244115D7E3470031317304543155235351J33BB3i2736934&B441631書边lisa &4 -Kr AJto* Models-Zanilrhi.httFCM-DNA 量分析1个细胞增殖群时，可将 DNA 含量分布组方图分 为三部分，即GO/1、S 、G2M G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为Fil# Bd.L t Gr-aph Di spl ay 诞 H*lp「|门凶止圖端i 胭—■■jmaiium ■山■-问创Til 4 Edi t Gr-aph D L fpl bj 笳岂 M»lpA1图回田凹创4銅&00AJ 巳 +. d 久飼二I E J L L J °FwWiBrd Scatter (FSC-HLink 宮 g 日 BT (SSC-HLinH uAaet国」工10山K曹匸总器』o n LZp *#£:□*□创團►奇 licm* »■ Atctive Gate » St b.ti sties FSC-HLin.. Forward Scatter.. ■国For* ard Scatter (FSC _ML LJI )!P Side Scat ter ■Zisaiat： 3953 2 / 39512 L(M 的・ Oft9«ns* Xctave Gate• StfttisticsRE&W: H ・d FkjwMpanM ：_* | [TjR.ed flupreBcenc t a dill CKEBTlh Red. Finer remit ： 17»J 56 / 59512 O. !71..苗、曲：柑"«■ -mM20仙 :K1W aM1K4 .201*?: “ M1WEto 冲 Kb Ct #ipr in vi lit Cur^4fl-Copy St>t i tta-CE|?ni30ft7tlV'aTwd Sr it4l*r (FSC-ML IMSE■ Srkll t«r KL K ■) ^vbv»l/'lr£S?ii0血J# S*l F**i tupuww Ctrl*?Ud Slttkctie-reats i_rst -tsFr«f«r«n4rtiCtrl*!•A M RMS ・2女 Freq. Oi ■ *45.07 F^q 5■ ■- 30.04Fftq 42 ■ ^2 *G1 M«jin ・237U7 02 MtJih ■ <24 61i CV ■ 0 47 G2 uw^a.27 f nq a t^b-01 ■ O M Fheq. iu4f+&2 ■ 1St at « Io Frtf ITH斗GC 一Ra>H|Jn R«d Auafftce.. V正态分布，S期可以认为是一个加宽的正态分布检测结果刻录光盘保存9 30 60 S0 120ChwinelstPI-A）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA 穿膜丢失，胞内DNA含量减少。
流式细胞仪操作方法
一、样品制备1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。
分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。
每个样品至少获取2×104cells，二、上流式测细胞1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。
检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。
确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。
1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。
将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。
如果需要打印，打开打印机电源。
打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。
1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。
若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。
关闭液流抽屉。
执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。
结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。
2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤流式细胞仪是一种能够对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。
在细胞生物学研究中，流式细胞仪常用于检测细胞周期，这对于了解细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程具有重要意义。
以下是流式细胞仪检测细胞周期的详细操作步骤：一、实验前准备1、细胞培养选择处于对数生长期的细胞进行实验，以保证细胞状态良好且增殖活跃。
根据细胞类型和实验要求，在合适的培养条件下培养细胞。
2、试剂和材料70%乙醇：用于固定细胞。
碘化丙啶（PI）染液：用于染色细胞核中的 DNA。
RNA 酶：用于去除 RNA 对染色的干扰。
磷酸盐缓冲液（PBS）：用于洗涤细胞。
流式细胞仪专用的上样管。
3、仪器设备流式细胞仪，并确保仪器处于正常工作状态，包括光路校准、液流系统稳定等。
离心机：用于离心细胞。
二、细胞收集1、当细胞培养达到所需的密度和状态时，小心吸出培养基。
2、用 PBS 轻轻洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。
3、加入适量的胰蛋白酶或其他细胞解离试剂，将细胞从培养容器表面解离下来。
4、加入含有血清的培养基终止胰蛋白酶的作用，防止过度消化细胞。
5、将细胞悬液转移到离心管中，离心（一般 1000 1500 rpm，510 分钟），使细胞沉淀。
三、细胞固定1、弃去上清液，留下细胞沉淀。
2、缓慢加入预冷的 70%乙醇，边加边轻轻涡旋或吹打细胞，使细胞充分分散在乙醇中。
乙醇的最终浓度应在 70%左右。
3、将细胞在 4°C 下固定至少 1 小时，可固定过夜以确保固定效果。
四、PI 染色1、离心固定后的细胞，弃去乙醇。
2、用 PBS 洗涤细胞两次，以去除残留的乙醇。
3、加入适量的 RNA 酶溶液，在 37°C 水浴中孵育 30 分钟，以去除 RNA 对染色的干扰。
4、加入 PI 染液，使其终浓度达到合适的范围（通常为 50 100μg/mL），在室温下避光孵育 30 分钟。
细胞周期检测
细胞周期
1、原理
碘化丙啶(Propidium Iodide，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。
碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
2、步骤
2.1细胞处理
悬浮细胞：收集悬浮细胞5~20×10⁵于离心管中，300 g/5min 离心，弃去培养液；
加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷) 洗涤一次，300 g/5min 离心，弃去上清，弹散
管底沉淀；
贴壁细胞：贴壁细胞弃去培养基，加入胰酶消化，待消化完全后，培养基终止消化，
吹散细胞，300 g/5min 离心，弃去培养液；加入1ml 冷PBS(提前放冰上预冷)洗涤
一次，300g/5min 离心，弃去上清，弹散管底沉淀；
2.2细胞固定
将用PBS洗涤好的细胞用250ul预冷的PBS重悬，吹打混匀，将预冷的750ul无水
乙醇缓缓滴入重悬的细胞内，混匀，-20℃固定过夜。
600 g/10min离心，沉淀细胞，
对于特定的细胞如果沉淀不充分，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。
小心
吸除上清，可以残留50μl左右的乙醇，以免吸走细胞。
加入约5ml冰浴预冷的PBS,
重悬细胞，离心收集细胞，小心吸除上清，可以预留50μl的PBS，以免吸走细胞。
轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。
2.3细胞染色
加入500ul FxCycle™ PI/RNase 染色溶液，混匀，室温孵育30min，上机检测。
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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
欧阳家百（2021.03.07）
取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内
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24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）
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特定时间后终止培养，进行下一步的实验
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收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入
15ml离心管中
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1000rpm离心5min（短时低速离心）
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弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细
胞悬液内的细胞碎片
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加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
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1000r/min,离心5min
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将乙醇吸除，加PBS清洗混匀
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1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去
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吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶
（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)
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加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min
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将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管
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提前一天网上预约
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开机（先开仪器后开软件）
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流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；
②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
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检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
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流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱
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液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm
激发光源）
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荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞
DNA 分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）
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在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出
结果分析——Modfit 软件分析
——Flowjo 软件分析
FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布
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检测结果刻录光盘保存
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关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）
正常细胞DNA 含量：2n-4n
图片拷贝：直接Ctrl+C
凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。
PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）。
1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
2、横坐标DNA Content：即DNA含量；
3、G1、G2、S三期在图中已经标示；
4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；
Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡
基本原理：
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ-
凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+
凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+
坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
实验步骤：
取对数生长期的细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内
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24h后，进行所需的处理（比如加入药物）
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特定时间后终止培养，进行下一步的实验
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细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）
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加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）
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倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）
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将细胞悬液移入15ml离心管中
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2000rpm离心5min,PBS吸除
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用PBS 清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）
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用400ul 1×Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1×106 cells/ml)
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在细胞悬液中加入5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8℃避光
条件下孵育15 min
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加入10ul PI 后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5 min
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在1 h内用流式细胞仪检测
流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射波长检测PI。
细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V
+/PI-。