原代细胞培养和细胞实验设计(陈加祥)
细胞的原代培养实验报告
实验十一细胞的原代培养一、实验目的1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。
2、掌握无菌操作方法及注意事项。
3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。
二、实验原理模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。
三、实验器材1、纯水设备：纯水仪2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 m滤膜；3、超净工作台4、培养设备：普通培养箱、CO2培养箱；5、贮存设备：冰箱、液氮罐6、观察设备：倒置显微镜7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等培养主要用品1、培养瓶、皿：以玻璃器皿为主，应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品（1）培养瓶（2）培养皿2、血球计数板3、眼科剪、镊；实验材料7－14日龄鸡胚（肝素）抗凝血原代培养材料选择幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养分化程度低的组织比分化高的容易培养肿瘤组织比正常组织容易培养。
实验试剂1、D’Hanks液KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌。
4℃下保存。
2、o．25％胰蛋白酶（D’Hanks液配）3、M199 培养液4、小牛血清5、青、链霉素6、5％NaHCO3、2％碘酒7、75％酒精8、洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成四、实验方法与步骤一）培养前的准备工作1、用品清洗与消毒2、溶液配制与消毒（1）培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒（2）平衡盐等高压蒸汽消毒3、预热溶液4、工作间及超净台消毒：紫外线、消毒液。
5、洗手和着装6、进入无菌室7、关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)将消毒过的所用物品放入超净工作台中组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤1、配M199完全培养液：M199基础培养液90％小牛血清10％青霉素100IU/ml链霉素100 g/ml过滤除菌。
实验报告-细胞原代培养实验
实验报告-细胞原代培养实验细胞生物学实验报告实验三细胞原代培养1引言1.1 实验目的1. 理解细胞原代培养原理。
2. 了解细胞原代培养的应用。
3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。
4. 巩固无菌操作技术。
1.2 实验原理细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚2.4 实验步骤A.鸡胚成纤维细胞的原代培养1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。
5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。
将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋壳。
6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。
8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。
9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。
10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组织块接种到培养瓶内。
在培养瓶中放置10-15个组织块。
原代细胞培养实验报告
原代细胞培养实验报告实验名称：原代细胞培养实验实验目的：1.掌握原代细胞培养的基本技术和方法；2.观察和记录原代细胞在体外培养过程中的生长和变化；3.学习和探究细胞培养对细胞形态、功能和特性的影响。
实验材料和方法：1.实验材料：原代细胞，培养基，培养皿，培养瓶，培养箱等；2.实验方法：a.准备工作：消毒实验区域，准备适宜的培养条件；b.培养器皿预处理：将培养皿和培养瓶加热至高温，使其表面杀菌；c.细胞移植：用适量的培养基将原代细胞移植至培养皿或培养瓶中；d.细胞培养：将细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，定期观察和记录细胞的生长情况；e.细胞传代：当细胞达到一定密度时，用消化液将细胞从原培养皿中剥离，并转移到新的培养皿中，促进细胞的继续生长和繁殖。
实验结果与分析：在进行原代细胞培养实验的过程中，我们发现原代细胞在培养基中可以维持一定的形态和生物活性。
经过一段时间的培养，细胞开始出现贴壁生长，并形成单层密集的细胞群。
这时，细胞的数量明显增加，可见其细胞分裂和增殖的效果。
细胞形态也逐渐变得规整，细胞质较为丰满，细胞核染色质着色精细。
随着培养的时间推移，细胞的代谢活动逐渐增强，细胞数量持续增加。
细胞形态和功能逐渐分化，并出现特定的细胞类型，如心肌细胞、肝细胞等。
这表明原代细胞在体外培养的过程中，依然能够保持其特定的细胞类型和功能特性。
然而，我们也发现在长时间的培养过程中，细胞的生长速度逐渐放缓，甚至停滞。
细胞形态也开始出现变异和退化，如细胞形状异常、质量变差等。
这可能是由于细胞的老化和突变导致，同时也与培养条件和传代的次数有关。
结论：通过本次实验，我们成功地进行了原代细胞的培养，并观察到了细胞在体外培养过程中的生长和变化。
我们发现原代细胞能够在适宜的培养条件下，维持其形态和功能的稳定性，并且能够分化成特定的细胞类型。
然而，在长时间的培养过程中，细胞的生长速度逐渐放缓，而细胞的形态也逐渐出现变异和退化。
因此，在进行原代细胞培养时，需要合理控制培养条件和适时进行细胞传代，以保持细胞的生长和特性。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞原代培养姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的方法：1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
取材注意事项：取材要注意新鲜和保鲜。
取材应严格无菌。
取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。
要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。
取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。
二、实验目的1、理解细胞原代培养原理2、熟悉细胞原代培养方法与过程3、了解细胞原代培养的应用4、独立进行细胞原代培养操作三、实验材料手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。
动物：9-12日龄的鸡胚蛋四、实验步骤1、购买9-12日龄鸡胚蛋。
放入孵化箱中孵养待用。
2、取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，气室处擦拭两遍，用镊子小心去除气室部分的蛋壳。
原代细胞培养实验报告单
一、实验目的1. 熟悉并掌握哺乳动物细胞原代培养的基本操作流程。
2. 学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制及酸碱度的调节。
3. 了解无菌操作的重要性，学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。
二、实验原理细胞培养是生物学和医学研究的重要手段之一，可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指从生物体中取出某种组织或细胞，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素。
细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐等因素的影响。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：新生乳鼠肺组织2. 器材：眼科剪、眼科镊、泡器械（直径15cm）、培养皿、动物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培养瓶、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、电磁搅拌器3. 试剂：Hank’s液、RPMI-1640液、血清细胞培养液、安尔碘、酒精四、实验步骤1. 取新生乳鼠肺组织，用无菌手术刀将组织切成小块。
2. 将组织块放入装有Hank’s液的培养皿中，用眼科剪和眼科镊轻轻剪碎组织。
3. 将剪碎的组织块移入离心管中，加入适量胰蛋白酶，在37℃水浴中消化10分钟。
4. 将消化后的细胞悬液移入离心管中，1000 rpm离心5分钟，弃上清。
5. 用RPMI-1640液重悬细胞，调整细胞浓度至1×10^6细胞/mL。
6. 将细胞悬液接种于培养皿中，放入二氧化碳培养箱中培养。
7. 每2-3天更换一次培养液，观察细胞生长情况。
细胞培养技术实验报告单
一、实验目的1. 熟悉细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 掌握原代细胞培养和传代细胞培养的方法。
3. 了解细胞培养过程中常见问题的处理方法。
二、实验原理细胞培养是指将生物体内的细胞取出，在无菌条件下，模拟体内环境，使其在体外生长、繁殖和传代的过程。
细胞培养技术在生物学、医学和生物工程等领域具有广泛的应用。
三、实验材料与仪器1. 材料：原代细胞、培养皿、培养瓶、吸管、移液器、胰蛋白酶、EDTA、D-Hank's液、胎牛血清、PBS缓冲液、消毒剂等。
2. 仪器：显微镜、生物安全柜、CO2培养箱、超净工作台、离心机、水浴锅、酒精灯等。
四、实验步骤1. 原代细胞培养（1）取原代细胞，加入适量D-Hank's液，轻轻吹打使细胞悬浮。
（2）将细胞悬液加入培养皿，在CO2培养箱中培养。
（3）观察细胞生长情况，待细胞贴壁后，用移液器将细胞悬液转移至培养瓶中。
（4）加入适量胎牛血清，轻轻摇匀，放入CO2培养箱中继续培养。
2. 传代细胞培养（1）将培养瓶中的细胞用胰蛋白酶或EDTA消化。
（2）加入适量PBS缓冲液，终止消化反应。
（3）将细胞悬液转移至离心管中，离心去上清液。
（4）加入适量胎牛血清，轻轻摇匀，使细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量胎牛血清，放入CO2培养箱中继续培养。
3. 细胞冻存（1）将培养瓶中的细胞用胰蛋白酶或EDTA消化。
（2）加入适量胎牛血清，终止消化反应。
（3）将细胞悬液转移至离心管中，离心去上清液。
（4）加入适量冻存液（如DMSO），轻轻摇匀，使细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移至冻存管中，放入液氮中冻存。
五、实验结果与分析1. 原代细胞培养：细胞在培养皿中贴壁生长，细胞形态良好。
2. 传代细胞培养：细胞在培养瓶中生长旺盛，细胞形态良好。
3. 细胞冻存：冻存细胞复苏后，细胞生长状况良好。
六、实验结论1. 成功掌握了原代细胞培养和传代细胞培养的方法。
2. 了解了细胞培养过程中常见问题的处理方法。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞原代培养细胞生物学实验报告细胞原代培养实验报告一、实验目的本实验的主要目的是进行细胞原代培养，通过对细胞的体外生长和繁殖过程进行观察和研究，以了解细胞的生物学特性，探索细胞生长、分化和凋亡的机制，为细胞生物学、肿瘤学、药理学等领域的研究提供实验基础。
二、实验原理细胞原代培养是指将组织样本通过一定的消化和培养技术，获得并培养单细胞悬液的过程。
这些细胞可以在体外生长和繁殖，并保持一定的生物学特性。
通过细胞原代培养，我们可以对细胞的生长、分化和凋亡过程进行深入研究，了解细胞的生物学特性，探索疾病的发病机制和药物的作用机制。
三、实验步骤1.组织样本准备：选取适当的组织样本，用PBS洗涤并用剃毛刀除去表面脂肪和结缔组织，切成1-2mm3的小块。
2.消化：将组织块加入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃下消化10-15分钟。
期间需轻轻摇动几次以促进细胞释放。
3.细胞悬液制备：消化完成后，将消化液过滤至100目筛网，用PBS洗涤并离心（1000rpm，5分钟）去除上清液。
加入适量培养基制成细胞悬液。
4.细胞培养：将细胞悬液接种到培养瓶中，加入适量培养基进行培养。
在培养期间需注意观察细胞的生长情况和更换培养基。
5.细胞传代：当细胞生长到一定密度时，可以进行传代。
用胰蛋白酶消化细胞并离心收集，加入适量培养基制成细胞悬液，按比例接种到新的培养瓶中。
6.实验记录：在整个实验过程中，需要对细胞的生长情况、形态学变化等进行详细记录。
同时，需要定期拍照记录细胞的生长情况。
7.结果分析：通过对细胞的生长情况、形态学变化等进行观察和分析，可以得出有关细胞生物学特性的结论。
四、实验结果及数据分析1.实验结果（请在此插入不同时间点的细胞生长照片）通过观察和记录细胞的生长情况，我们发现原代细胞在接种后的前几天内处于适应期，细胞数量增长较慢。
随后，细胞数量开始加速增长，并逐渐形成集落。
传代后，细胞的生长速度又逐渐减缓，但仍然保持稳定增长。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告引言原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。
它具有重要的科研和临床应用价值。
本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。
材料与方法1. 实验所用细胞系我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。
MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。
2. 原代细胞培养基的配制与消毒配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。
3. 细胞分离与传代分离过程1.取出小鼠胚胎。
2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。
3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。
4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。
5.加入细胞培养基中的胞外消化液。
6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。
8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
传代过程1.收集上述分离得到的细胞悬液。
2.用血细胞计数板计数细胞数目。
3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。
4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。
4. 影响细胞培养的因素4.1 培养基的质量培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。
优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。
4.2 培养条件的控制细胞的生长需要适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
同时，细胞培养过程中需要定期更换培养基，以保持培养环境的稳定性。
4.3 质量检测与细胞鉴定在细胞培养的过程中，定期进行培养基的质量检测和细胞的鉴定非常重要。
常用的质量检测方法包括菌落计数法和PCR方法。
结果与讨论1. 细胞形态观察在细胞原代培养的过程中，我们进行了细胞形态的观察。
原代培养_实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。
3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。
2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。
3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。
4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。
四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。
（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。
（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。
2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。
3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。
（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。
4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。
五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。
2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。
3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。
六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。
应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。
2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。
应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。
细胞的原代培养和传代培养修订稿
细胞的原代培养和传代培养WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH 值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告一、实验目的本实验旨在通过细胞原代培养实验，学习细胞培养技术，了解细胞生长特性和生理功能，以及评估细胞毒性和细胞增殖能力。
二、实验原理细胞原代培养是指从组织或器官中分离出的一种或多种类型的原代细胞在无血清条件下进行传代培养。
该技术可以用于研究不同类型的细胞生长特性、生理功能和分子机制。
在无血清条件下进行原代细胞培养可以避免血清成分对实验结果的影响，并且有助于减少非特异性因素对实验结果的干扰。
三、实验步骤1. 准备工作：将所需物品（包括培养皿、离心管、移液器、显微镜等）消毒，并将所有物品放置在无菌条件下。
2. 组织取样：选择需要研究的组织或器官，如肝脏、肺组织等，并将其切成小块。
3. 组织分离：将组织块放入含有酶类消化液（如胰蛋白酶）的培养皿中，将其放置在37℃的恒温培养箱中进行消化。
消化时间根据不同的组织类型而异，通常需要30分钟至1小时。
4. 细胞分离：将消化后的组织过筛，用离心管收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤。
5. 细胞培养：将细胞沉淀转移至含有完整培养基（如DMEM/F12）的无菌培养皿中，并加入适量的血清替代物（如B27），以促进细胞生长和增殖。
将培养皿放置在37℃、5% CO2、95%湿度的恒温培养箱中进行传代培养。
6. 细胞检测：通过显微镜观察细胞形态和数量变化，并使用MTT法或CCK-8法评估细胞增殖能力。
同时可以使用流式细胞术等技术对细胞进行表型和功能分析。
四、实验结果通过原代细胞培养实验，我们成功地从肺组织中分离出了一种类型的原代肺成纤维细胞（primary lung fibroblasts）。
在无血清条件下进行传代培养后，我们观察到细胞数量逐渐增加，并且细胞形态发生了明显的变化。
同时，我们使用MTT法评估了细胞增殖能力，并发现细胞在培养24小时后开始快速增殖，直到培养72小时时达到峰值。
此外，我们还使用流式细胞术对原代肺成纤维细胞进行了表型和功能分析，并发现其具有一定的合成和分泌基质蛋白的能力。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告细胞原代培养实验报告细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究细胞的生物学特性和功能。
本实验旨在通过原代培养的方式，观察和分析细胞在体外环境下的生长和变化。
我们选择了小鼠胚胎成纤维细胞作为实验对象，以下是实验的详细步骤和结果分析。
实验步骤：1. 细胞分离：将小鼠胚胎取出，用无菌PBS洗涤去除血液和其他污染物。
然后将胚胎组织切碎，并用胰酶和胆汁酸溶液进行消化。
最后通过过滤器筛选，获取单个细胞悬浮液。
2. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到含有培养基的培养皿中，加入适量的血清和抗生素。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
3. 细胞观察：每天观察细胞的生长情况，记录细胞数量和形态的变化。
使用显微镜观察细胞的形态和结构，拍摄照片以备后续分析。
4. 细胞传代：当细胞达到80-90%的密度时，使用胰酶和胆汁酸溶液将细胞从培养皿上剥离下来。
将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，加入新的培养基，并按照相同的条件进行培养。
实验结果：在细胞培养的过程中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞的生长和变化。
初始阶段，细胞悬浮液中的细胞数量较少，呈现单个细胞的状态。
随着培养时间的延长，细胞开始聚集成群，形成细胞聚落。
在观察细胞形态时，我们发现细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征。
细胞体积较小，形状呈椭圆或长条状，有较长的细胞突起。
细胞质呈现出丰富的胞浆，胞核位于细胞的中央位置。
随着细胞的传代，我们观察到细胞的增殖速度逐渐加快。
细胞密度逐渐增加，细胞聚落的大小也逐渐增大。
同时，我们还观察到细胞形态的变化，细胞突起的数量和长度有所增加。
实验讨论：细胞原代培养是一种常用的实验方法，可以用于研究细胞的生长、增殖和分化等生物学特性。
在本实验中，我们成功地将小鼠胚胎成纤维细胞进行原代培养，并观察到了细胞的生长和变化。
细胞的形态特征对于细胞的功能和特性具有重要的指示意义。
在本实验中，我们观察到小鼠胚胎成纤维细胞呈现出典型的成纤维细胞形态特征，这与之前的研究结果一致。
原代细胞培养和细胞实验设计陈加祥
• （3）弃上清液，加入全M199培养液（含20%胎牛血清、100 ng/ml VEGF）4 ml，吹打使细胞重新 悬浮，移入培养瓶中，静置培养。
• （4）24 h后换液，以后每隔3天换液一次，约7天左右细胞长满汇合，可以传代。 • （5） 使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。
• 血液中各种细胞的比重不同： 淋巴细胞与单核细胞：1.070 粒细胞和红细胞：1.092 • 将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按 相应密度梯度进行分布。
2. 淋巴细胞分离步骤：
1. 抽取静脉血2ml，注含有肝素的无菌试管中摇匀，加入 2ml Hanks溶液稀释。
2. 吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分 离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为 1:1:1）。
一、原代细胞的取材
取材的基本要求： （1）注意新鲜和保鲜：取材时应尽量在4-6 h内能制作成细胞； （2）严格无菌； （3）用锋利的器械切碎组织，减少对细胞的机械损伤；
（4）去除材料上的血液、脂肪、坏死组织及结缔组织；
（5）尽量选用易培养的组织进行培养。胚胎组织易于成熟个体组织，分化低易于分化高的组织，肿瘤 组织易于正常组织。
• （5）漂洗：将含有血清、钙、镁的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后，加入完全 培养基。
• （6）机械分散：采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑制作用。 • （2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长，以免过量损伤细胞。 • （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，而且动作要轻柔。
《原代细胞培养实验》课件
案例二：胰岛细胞的原代培养
要点一
总结词
要点二
详细描述
胰岛细胞是胰腺内分泌部分的主要组成部分，其原代培养 需要模拟体内环境，以保持细胞的正常生理功能。
胰岛细胞的原代培养需要使用特殊的基质和生长因子，以 促进细胞的生长和分化。同时，需要控制培养液中的葡萄 糖、胰岛素等物质的浓度，以模拟体内环境。在培养过程 中，还需要注意防止细胞凋亡和自噬等问题。
细胞生长状态
通过观察细胞形态，评估 细胞的生长状态，如贴壁 、增殖、融合等情况。
细胞排列
观察细胞在培养容器中的 排列情况，判断细胞的生 长密度和分布情况。
细胞生长曲线的绘制
01
细胞计数
在原代细胞培养的不同时间点进 行细胞计数，记录细胞的增殖情 况。
02
绘制生长曲线
03
生长曲线的分析
将不同时间点的细胞计数数据绘 制成生长曲线，分析细胞的生长 速率和生长周期。
选择适合细胞类型的基础培养 液，如MEM、DMEM等。
添加物
根据细胞类型和生长需求，添 加适量的生长因子、血清、抗
生素等。
pH值
维持适宜的pH值范围，通常 为7.2-7.4。
渗透压
保持适宜的渗透压，以避免细 胞因渗透压过高或过低而受损
。
细胞的传代与冻存
传代时机
在细胞生长达到适宜密度时进 行传代，避免细胞过度生长或
原代细胞培养的应用
原代细胞培养在药物筛选、肿瘤研究、组织工程、再生医学等领域具有广泛的应 用价值。
通过原代细胞培养可以研究细胞的生理功能、药物作用机制和毒理反应，同时也 可以用于制备组织工程材料和进行基因治疗等研究。
02
原代细胞培养实验步骤
《一、动物细胞培养经历原代培养和传代培养》教学设计
《一、动物细胞培养经历原代培养和传代培养》教学设计一、教学目标1. 知识与技能目标- 学生能够准确说出动物细胞培养的概念、原理和过程，包括原代培养和传代培养的特点与区别。
- 理解动物细胞培养在现代生物工程中的应用，如生物制药、疾病治疗等方面的实例。
- 掌握动物细胞培养过程中所需的条件，如无菌环境、营养物质、温度、pH值等。
2. 能力目标- 通过观察图片、视频和实验模拟等活动，培养学生的观察能力和分析归纳能力。
- 以小组讨论动物细胞培养的应用案例为契机，提高学生的合作学习能力、交流表达能力和解决实际问题的能力。
- 让学生尝试设计简单的动物细胞培养实验方案，锻炼学生的实验设计能力和创新思维。
3. 情感态度与价值观目标- 激发学生对生物技术领域的兴趣和探索欲望，培养学生积极投身科学研究的热情。
- 让学生认识到动物细胞培养技术在生命科学发展和人类健康保障方面的重要意义，增强学生的社会责任感。
- 在小组合作学习过程中，培养学生相互尊重、团结协作的团队精神。
二、学情分析1. 已有知识基础- 学生在之前的学习中已经对细胞的基本结构和功能有了一定的了解，这为理解动物细胞培养过程中的细胞代谢和生长奠定了基础。
- 他们也学习过微生物培养的一些基本知识，如无菌操作技术，这对动物细胞培养中的无菌环境要求有一定的借鉴作用。
2. 学习能力- 高中学生具备一定的逻辑思维能力和自主学习能力，但对于较为复杂的生物技术过程，如动物细胞培养，还需要教师进行详细的讲解和引导。
- 学生在分析实验数据和现象方面还有待提高，需要通过具体的实例和练习来加强。
3. 兴趣爱好- 大部分学生对生物技术领域比较感兴趣，尤其是那些与人类健康和现代科技相关的内容，如基因治疗、生物制药等。
这可以作为激发学生学习动物细胞培养知识的切入点。
4. 学习风格- 学生比较喜欢直观的教学方式，如图片、视频展示等。
同时，小组合作学习和探究性学习也能够提高他们的学习积极性和参与度。
原代细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习细胞传代培养的方法和注意事项。
3. 观察细胞在不同培养条件下的生长状态，为后续实验提供基础细胞。
二、实验原理原代细胞培养是指从生物体内取出组织或细胞，经过消化、分离等步骤，在无菌条件下将其培养在适宜的培养基中，使其生长、繁殖的过程。
原代细胞培养是细胞生物学、分子生物学、药理学等领域研究的重要技术手段。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏组织、胰蛋白酶、EDTA、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、无菌水、细胞培养瓶、培养皿、移液器、显微镜、离心机等。
2. 实验仪器：CO2培养箱、超净工作台、显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 组织处理：将小鼠肝脏组织放入无菌培养皿中，用无菌手术剪将其剪成1mm³大小的组织块。
2. 消化：将组织块放入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃水浴中消化5-10分钟。
3. 分离：将消化后的组织块转移到离心管中，加入适量DMEM培养基，用移液器吹打使其分散成单个细胞。
4. 细胞计数：取少量细胞悬液，用血球计数板进行细胞计数。
5. 细胞接种：将细胞悬液接种到培养瓶中，放入CO2培养箱中培养。
6. 细胞传代：待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞，按照1：2的比例进行传代培养。
7. 观察细胞生长状态：定期观察细胞生长状态，记录细胞数量、形态等变化。
五、实验结果1. 细胞计数：接种后24小时，细胞开始贴壁生长，48小时后细胞数量明显增加。
2. 细胞传代：传代培养过程中，细胞生长状态良好，细胞数量、形态等指标均符合要求。
3. 细胞生长状态：细胞呈多边形，排列整齐，细胞间隙较小，细胞核清晰可见。
六、实验讨论1. 原代细胞培养的成功关键在于无菌操作和适宜的培养条件。
在实验过程中，要严格按照无菌操作规程进行，确保细胞培养环境的无菌。
2. 细胞传代培养是维持细胞生长和繁殖的重要手段。
在传代过程中，要选择合适的消化时间，避免过度消化或消化不足。
细胞培养实验设计
细胞培养实验设计细胞培养是现代生物学研究中的重要手段，利用细胞培养技术可以模拟体内环境，研究细胞的生长、分化、增殖以及药物毒性等。
本文将探讨细胞培养实验设计的相关内容，包括实验目的、材料和方法、预期结果等。
一、实验目的细胞培养实验的目的是通过培养细胞体外来观察其特性和行为。
具体目的可根据研究问题的要求来确定，例如观察细胞的增殖速度、细胞的表型变化、细胞对药物的敏感性等。
在制定实验目的时，需明确目标并合理设计实验步骤来保证实验的可行性和有效性。
二、材料和方法2.1 细胞系选择：根据研究对象选择合适的细胞系，如肿瘤细胞、原代细胞等。
可考虑细胞系的来源、生长特性、文献报道等因素来进行选择。
2.2 细胞培养基选择：根据细胞系的营养需求选择适宜的细胞培养基。
常用的细胞培养基包括DMEM、MEM、RPMI-1640等，可根据实验需求添加适量的生长因子或药物。
2.3 培养条件设置：确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常以37摄氏度、95%湿度和5% CO2作为常规培养条件。
2.4 细胞传代：将细胞培养至合适的密度后进行传代，以确保细胞的健康生长。
传代可采用胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养皿上解离，然后重新分装于新的培养皿中。
2.5 实验处理：根据实验目的进行相应的处理，如加入药物、暴露于特定环境等。
处理时需注意浓度、时间和方法的控制，以保证实验的可重复性和结果的可靠性。
2.6 细胞观察和记录：根据实验目的选择合适的观察方法，如显微镜观察、细胞染色、流式细胞术等。
观察时需仔细记录细胞形态、数量和相关实验数据。
三、预期结果根据实验目的不同，预期结果也会有所区别。
一般可从细胞数量、形态学变化、生物学功能等多个方面进行观察和分析。
例如，如果实验目的是研究某药物对细胞增殖的影响，预期结果可能是药物处理组与对照组的细胞数量有明显差异；如果实验目的是观察细胞分化的变化，预期结果可能是处理组与对照组的细胞形态和功能有所差异。
医学细胞实验报告
实验名称：哺乳动物细胞原代培养与传代培养实验目的：1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 了解细胞培养技术在医学研究中的应用及其重要性。
实验原理：细胞培养技术是指从生物体中取出某种组织或细胞，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
通过细胞培养，我们可以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充。
细胞培养技术在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等研究领域中得到广泛应用。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养是指直接从体内获取的组织细胞进行首次培养；传代培养是指原代培养的细胞增殖达到一定密度后，将其分散后转移到另一个或几个容器中扩大培养。
传代培养的累积次数即为细胞的代数。
实验材料：1. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、PBS缓冲液等。
2. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、移液器、培养皿、吸管等。
实验步骤：一、原代细胞培养：1. 取实验动物组织，用PBS缓冲液清洗，去除杂质。
2. 将组织剪成小块，加入胰蛋白酶溶液，37℃水浴消化。
3. 消化完成后，用吸管吹打组织，使细胞脱落。
4. 将细胞悬液过滤，去除未消化组织。
5. 将细胞悬液加入培养皿，加入适量胎牛血清和DMEM培养基，放入细胞培养箱中培养。
二、细胞传代培养：1. 当原代细胞增殖到一定密度时，用胰蛋白酶消化细胞。
2. 收集细胞悬液，加入适量的胎牛血清和DMEM培养基，终止消化。
3. 将细胞悬液转移至新的培养皿中，加入适量胎牛血清和DMEM培养基，放入细胞培养箱中培养。
三、细胞观察：1. 将培养的细胞用PBS缓冲液清洗，加入固定液固定。
2. 将固定后的细胞用染色剂染色。
3. 将染色后的细胞制成涂片，用显微镜观察细胞形态、生长状态等。
实验结果：1. 原代细胞在培养过程中，细胞逐渐生长、增殖，形成单层细胞。
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• 血清浓度，上皮细胞耐受低血清环境的能力较 强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差 异，用含1.5%小牛血清的培养液可以降低培养 物中成纤维细胞的生长。
• （5）克隆法 • 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分 别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 • （6）流式分选
第二节、细胞实验设计
• 采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化。
• 最终浓度0.1~0.3 mg/mL。
• 胶原酶Ⅰ：用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织 细胞的分离。
• 胶原酶Ⅱ：适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和 唾液腺组织。 • 胶原酶Ⅳ：包含至少7种蛋白酶成分，能消化 多种组织。 • 胶原酶Ⅴ：可用于胰腺小岛组织的分离
（2）非酶消化法（EDTA消化法）
四、培养细胞的纯化
• 1、自然纯化
• 2、人工纯化 • （1）酶消化法
• （2）机械划除法
• （3）反复贴壁法
• （4）克隆法
• （5）培养及限定方法 • （6）流式分选
1、自然纯化
• 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他 细胞生长，靠自然的增殖潜力最后留下生长优 势细胞，去除其他细胞。 • 无法人为选择细胞，时间长 • 有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化 建立细胞系。
• 在不锈钢网内用钝物压挤使细胞从网孔中压挤 出。
• 特点：分离细胞简便、快速，但对组织机械损 伤大，而且细胞分散效果差。
（2）消化分离法
• 组织消化法是把组织剪切成小块，应用酶的生化 作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结 构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，再结合 机械法（用吸管吹打分散或电磁搅拌）使细胞团 块得以较充分的分散，制成细胞悬液。
2. 淋巴细胞分离步骤：
1. 抽取静脉血2ml，注含有肝素的无菌试管中 摇匀，加入2ml Hanks溶液稀释。 2. 吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2m l淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液: 淋巴细胞分离液的比例为1:1:1）。 3. 水平式离心2000r/min×20min
4. 用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状 的细胞层，用Hanks溶液洗涤两次， 每次离心1500 r/min×10 min。 5. 弃上清，加RPMI-1640培养液1 ml混 匀，取少许进行细胞计数及活力测定。 6. 贴壁法区分单核细胞（易贴壁）和淋 巴细胞
（3）反复贴壁法
• 成纤维细胞与上皮细胞相比，贴壁快，大部分 细胞常能在短时间内（约10-30 min）完成附着， 而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着 不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差 别来纯化细胞。
（4）培养基限定方法
• 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某 种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来 纯化细胞： • 溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰 细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤 维细胞的生长。
注意事项
• 1. 抽血后在2小时内使用。
• 2. 注意将稀释后的血轻轻地沿管壁铺在聚蔗糖 液面上，避免破坏其界面。
• 3. 在收集单核细胞和淋巴细胞时，将吸管轻轻 插入该层后，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。
2、组织块培养法（组织培养）
举例：贴块法培养血管平滑肌细胞
步骤：
• 铺瓶： 大鼠经颈动脉放血后，无菌操作取一段胸 主动脉，置于含Hank‘s液的平皿中漂洗3次，将血 凝块洗干净后剥除外膜的纤维脂肪层，纵行剪开 血管，刮血管内膜2~3遍，将中膜剪成约1 mm2大 小碎片，均匀铺在瓶底，25 mL培养瓶可接种20~ 30小块。
2、实体组织材料的分离方法 • 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用： • （1）机械分散法 • （2）消化分离法
（1）机械分散法
• 适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部分 胚胎组织。 • 方法： • 采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞。 • 将已充分剪碎分散的组织放在注射器内使细胞通过 针头压出。
二、原代细胞的分离和制作
• 1、悬浮细胞的分离方法
• 组织来源：血液、羊水、胸水或腹水。 • 方法：1000 r/min的低速离心10 min→沉淀用 无钙、镁PBS洗两次，培养基洗一次→调整适 当细胞浓度→分瓶培养。
• 若选用悬液中某些细胞，加入细胞分层液，经 离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中 形成不同层。 • 如：淋巴细胞分离。
• 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞 系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为 细胞株（Cell Strain） 。
• 原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外 进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。 • 原代细胞生物学特性未发生很大变化，最接近 和反映体内生长特性。
• 原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂。 • 原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格 的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。
• 轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加 入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃ 温箱内。 • 翻瓶：待其稍干燥后，将培养瓶缓慢翻转平放， 静置培养。 • 培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时 要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴 壁和生长，培养3~5天时可换液。
7-9天开始有细胞从组织块 周围爬出
14天左右细胞融合成大片
3. 消化法原代培养HUVEC
• （1）无菌条件下取正常分娩胎儿的新鲜 脐带(20 cm)，用PBS冲洗脐带至无血色 液体流出。 • （2）从脐静脉一端注入0.1%的Ⅱ型胶 原酶溶液，夹闭脐带两端，置于37℃培 养箱消化。15 min后，收集消化液，并 加入含20％胎牛血清的M199培基10 ml 终止消化，注入M199培基反复灌洗脐带， 收集冲洗液，与消化液一起于1000 rpm 离心5 min。
1）酶消化分离法
• 常采用胰蛋白酶和胶原酶 （a）胰蛋白酶
• 胰酶是一种胰脏制品，使细胞间质中的蛋白质水 解而使细胞分散。
• 影响胰酶消化细胞能力的因素：
• ① 组织类型 • 适于消化细胞间质较少的软组织（肝、肾、胚 胎组织、上皮组织）。 • 对含结缔组织较丰富的组织单用无效（如 乳腺、 滑膜、子宫、肿瘤组织），需与胶原酶合用。
• （5）漂洗：将含有血清、钙、镁的培养基沿 瓶壁缓缓加入，中止消化反应，漂洗2-3次后， 加入完全培养基。 • （6）机械分散：采用吸管吹打或振荡法，使 细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、 镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。 • （2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以免过量损伤细胞。 • （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，而且 动作要轻柔。
2、人工纯化
• （1）酶消化法
• 如上皮细胞和成纤维细胞对胰酶的耐受性不同： 消化细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮 细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原 代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而采 用多次差别消化法将上皮细胞和成纤维细胞分 开。
（2）机械划除法
• 上皮细胞和成纤维细胞同时出现，混杂生长。 每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在 瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要 的细胞。
• EDTA又称螯合剂，全名为乙烯二胺四乙酸。
• 常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，
• 对上皮组织分散效果好
• 原理：与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物， 利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使 贴壁细胞从瓶壁上脱离
• 缺点：细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时 呈片状，有团块。
一、原代细胞的取材
取材的基本要求： （1）注意新鲜和保鲜：取材时应尽量在4-6 h内能制 作成细胞；
（2）严格无菌；
（3）用锋利的器械切碎组织，减少对细胞的机械损 伤；
（4）去除材料上的血液、脂肪、坏死组织及结 缔组织； （5）尽量选用易培养的组织进行培养。胚胎组 织易于成熟个体组织，分化低易于分化高的组 织，肿瘤组织易于正常组织。
• 与胰酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞 脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒 性作用。
消化分离法的操作步骤：
• （1）剪切：把组织块剪碎。 • （2）漂洗：无钙镁PBS洗2-3次。
• （3）消化：加入消化液（胰蛋白酶/胶原酶/EDTA） 于37 ℃中作用适当时间。
• （4）弃去消化液：倾斜自然沉降或低速离心法。
• ② 酶的活力：新鲜配制，低温保存。 • ③ 酶的浓度: 为0.1%-0.25%。
• ④ 温度: 常用的温度为37 ℃。
• ⑤ pH: 选用7.6~8.0之间。
• ⑥ 无机盐离子：钙和镁可抑制胰酶的消化作用， 配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。
• ⑦ 消化时间： 20分钟为宜，冷消化时可使用 低浓度消化液4 ℃过夜。
原代细胞的培养
细胞实验设计
陈加祥，Ph.D
第一节、原代细胞培养
• 基本概念：
• 来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方 法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。 • 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称 之为细胞系（Cell Line） 。
—能够连续传代的细胞叫做连续细胞系 —不能连续培养的称为有限细胞系
例如：p53调控NGFR基因转录
Thanks!
• ⑧ 无血清：血清中含有抗胰蛋白酶因子
（b）胶原酶（Collagenase）
• 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，水解结缔 组织中胶原蛋白成分 ，而不损伤其它蛋白质和组 织。
• 适用组织：纤维性组织、上皮组织以及癌组织。 • 对细胞间质有较好的消化作用。
• 有钙、镁离子存在仍有活性。
• 消化作用缓和，无需机械振荡。 • 价格较高，大量使用将增加实验成本。
三、原代细胞的培养方法
• 悬浮细胞培养法: 如淋巴细胞 • 组织块培养法：如血管平滑肌细胞