生化检验实验赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
最新丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定
1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？
2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要 避免溶血？
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定
【目的要求】
1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作
方法。
3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
二是比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖 氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全 相同。不同之处在于作用时间：King法60min ，Mohun法和 Reiman法 30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。King法单位定义是： 每1ml血清在37℃条件下与底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸称为一个单 位。 Mohun 法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作 用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定 义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1个卡门氏单位 的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血 清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质 的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的 定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系： 1卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。
பைடு நூலகம்原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。
由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
实验六-血清丙氨酸氨基转移酶的活力测定
（2）样品测定
取2支试管，标记，按下表依次加入试剂。
管号 血清/mL 基质液/mL
2，4-二硝基苯肼/mL
基质液/mL NaOH溶液/mL
对照管 0.10 ——
混匀，37℃水浴30min 0.50
混匀，37℃水浴20min 0.50 5.00
混匀，室温放置10min
测定管 0.10 0.50
0.50
—— 5.00
在505nm波长下用对照管调零，读取测定管的吸光度值， 对照标准曲线求得ALT相应的酶活力单位。
【临床意义】
肝细胞中ALT含量最丰富，，当肝脏疾病导致肝细胞损伤后， ALT即大量释放进入血液中，导致血清中ALT活性明显增高。 故测定ALT是检查肝功能的重要指标之一。 ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死； 中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞； 轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、
实验六
【实验目的】
掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理及操作； 熟悉ALT标准曲线的绘制； 熟悉酶活力概念； 了解赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的评价
【实验原理】
赖氏法：
在37℃、pH7.4的条件下，以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，ALT 催化生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性 的大小；
试管和试管架
【实验方法】
（1试剂。
管号
空白管
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液/mL
0
0.05 0.10
0.15
0.20
0.25
基质液/mL
0.50
0.45 0.40
0.35
0.30
实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
实验1 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【实验目的】掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。
熟悉丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用。
了解固定时间法测定酶活性的特点与应用。
【原理】丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase ，ALT ，EC 2·6·1·2）催化L-丙氨酸与α-酮戊二酸间的氨基移换反应，生成α-丙酮酸和L-谷氨酸。
经30min 反应后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的两种α-酮酸生成相应的2,4-二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和α-酮戊二酸苯腙）。
在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500nm~520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。
据此可以计算出丙酮酸的生成量。
谷氨酸丙酮酸酮戊二酸丙氨酸-+-−−→−-+-L L ALT αα二硝基苯腙，二硝基苯肼，酮酸碱性条件-−−−→−-+-4242α（红棕色，λ=505nm ）【试剂与器材】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液80ml ，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液（200mmol/L 丙氨酸/2.0mmol/L α-酮戊二酸） 精确称取DL-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4℃～6℃保存，该溶液可稳定2周。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
标本的测定（改良赖氏法）
❖ 取适量基质缓冲液和待测血清，37℃水浴预温5min。 ❖ 取干净试管2支标明管号，按下表所示操作。
（对照管） 0.10 ---
基质缓冲液
0.50
❖ 混匀，放置5min，在505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光
度。
❖ 以测定管A测-A对之值作为标本的吸光度值，在标准曲线查得相
反应总体积
样本体积 比色杯光径
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注意事项
1、尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化 合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度 远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定 时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了 赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。
可不同程度的损害肝细胞，引起ALT的升高。
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器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
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标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
血清中丙氨酸氨基转移酶含量的检测-实验报告文件
实验诊断实验报告（二）
姓名班级学号日期
［实验目的］
1、掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理
2、掌握连续检测法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理
3、熟悉赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶标准曲线的绘制
4、了解血清丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用
［实验内容］
1．赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶原理
（1）实验数据纪录
标准曲线：
A0 = A1 = A2 = A3 = A4 = 血清标本：
A对照管= A测定管=
（2）赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶标准曲线绘制
①各标准管吸光度均减去“0”号标准管吸光度为该标准管的吸光度值。
②以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸
光度值作图，即成标准曲线。
③在标准曲线上标注0（原点）、曲线名称、日期。
标准曲线粘贴处
（3）在标准曲线上查得血清标本的卡门氏单位
检测结果：
2．连续检测法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理
（1）计算:
ALT（U/L）= ΔA/min ×K因子=ΔA/min ×3376
K因子计算公式：K因子= TV×1000 / 6.22×SV×P
式中TV = 总反应体积(ml)，SV = 样本体积(ml)，P = 1cm比色杯光径
6.22 = NADH在340nm处的摩尔吸光系数
（2）检测结果：。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)
实验操作
取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S 管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测 定管，在30min保温期间再做空白管和标准管
1.标准曲线绘制：取试管5支，按下表操作
混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用 520nm波长比色，读取各管光密度。各管光密 度减去0管光密度，然后以光密度的差值为纵 坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标， 绘制标准曲线。为了方便，可将光密度相当于 转氨酶的卡门氏单位列于其后
2.酶活性的测定：取试管2支，注明测定管及对照管，
在测定前将底物液在37摄氏度水浴中预温5分钟，再按下表操作
混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用 520nm波长比色，读取光密度，用测定管的光 密度减去对照管的光密度查标准曲线，即得到 待测血清中所含ALT的酶的活性。 参考值：5~25卡门氏单位
临床意义
ALT（GPT)广泛存在于机体各种组织中，但 在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是 急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显 著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此 酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组 织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项
1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清 对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本 进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检 查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的 标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的 问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦 能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大 差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
实验七血清丙氨酸氨基转移酶
实验七血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ）测定——改良赖氏法一、实验目的了解丙氨酸氨基转移酶测定原理及方法。
二、实验原理丙氨酸氨基转移酶（ALT）又称谷一丙转氨酶（GPT）。
它催化L—丙氨酸和L—谷氨酸之间氨基的转移，反应式为：丙酮酸与2，4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙。
此二硝基苯腙在强碱溶液中显红棕色，色泽深浅与产生的丙酮酸多少即酶活性成正比。
三、仪器和试剂1 •仪器：37C水浴恒温装置，试管和试管架，吸管，722型分光光度计。
2．试剂：⑴0.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液。
⑵丙氨酸氨基转移酶基质液：称取DL丙氨酸1.78克，？一酮戊二酸30毫克，先溶于0.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液约20 毫升中，用1mol/L NaOH （约0.5毫升）调节pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100毫升。
4~6 C中保存，并加一至二滴氯仿，防止细菌分解作用。
⑶2,4-二硝基苯肼溶液：溶2,4-二硝基苯肼200 毫克于热1 mol/L HCl 中，并用1 mol/L HCl 加至1 升刻度，避光保存。
⑷0.4 mol/L NaOH 溶液。
⑸丙酮酸标准液（2mmol/L ）:溶丙酮酸钠22毫克于缓冲液100毫升中，存放冰箱，此溶液在数天内是稳定的。
四、实验步骤加入物（ml）测定管测定空白管血清0.10 —加温至37 C的丙氨酸氨基转移酶基质液0.50 0.50各管分别混和，置37 C水浴30分钟，取出。
2, 4 —二硝基苯肼溶液0.50 0.50血清一0.10各管分别混匀，置37 T水浴20分钟，取出。
0.4 mol/L NaOH 溶液5.00 5.00在30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度测定管吸光度减去测定空白管吸光度后，于标准曲线上查得酶活性单位。
标准曲线绘制：（所加试剂按毫升计）加入物（ml）管号1 2 3 4 5丙酮酸标准液（2mmol/L ）0 0.05 0.10 0.15 0.20丙氨酸氨基转移酶基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.300.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液0.10 0.10 0.10 0.10 0.10相当于丙酮酸实际含量（？mol/L）0 0.1 0.20 0.30 0.40相当于丙氨酸氨基转移酶活力（卡门氏单位）0 28 57 97 150各管混匀后置37 T水浴5分钟，加2,4—二硝基苯肼溶液0.5毫升混匀，置37 C 水浴20分钟，取出，每管各加0.4 mol/L NaOH溶液5.0毫升，于30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度。
赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
附：血清门冬氨酸氨基转移酶测定
实验原理
AST速率法测定中的酶偶联反应式为：
L 天门冬氨酸 酮戊二酸 AST L 谷氨酸 草酰乙酸
草酰乙酸 NADH H MDH L 苹果酸 NAD
连续监测法测定NADH被氧化为NAD+，可在340nm处连续监测到 NADH的被氧化引起吸光度下降速率（-ΔA/min），该下降速率与 AST活性呈正比。
2.待测标本 病人血清或质控血清
3.仪器以半自动生化分析仪为例
操作步骤
向光径1.0cm的石英比色皿中加入血清100μl，加入 预温试剂1 000μl，混匀，（37±0.1）℃。在波长 340nm处，孵育时间90s，连续监测吸光度下降速 率60s。根据线性反应期吸光度下降速率（ΔA/min），计算出AST活性单位。
t b
Vs
b
Vs
思考题
1．赖氏法测定血清ALT时校准曲线为何不是直线？校准曲线制作有哪些特点？
。 2．简述固定时间法测定酶活性的优缺点（见P268)
返回章目录ຫໍສະໝຸດ 4．严重脂血、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度。 糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和 2,4-二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度 增加。因此，检测此类标本时，应作血清标本对照 管。
5．绘制校准曲线时必须注意：由于赖氏方法的特点， 每一个点必须做3管以上的重复测定，显色后以蒸馏 水调节吸光度为零，读取各管的吸光度。求出各标 准管的吸光度均值，减去“1”管吸光度均值后，对 照赖氏单位绘制校准曲线。由于每批试剂都有差异， 因此每换一个批号的试剂必须重新绘制曲线。
❖
2.ALT、AST、ALT/AST指标的临床应用
实验原理
L 丙氨酸α 酮戊二酸ALTα 丙酮酸 L 谷氨酸 α 酮酸 2，4 二硝基苯肼碱性条件2，4 二硝基苯腙
生物化学实验2.血清丙氨酸氨基转移酶测定.专科
一、实验目的
1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定的原理和 方法
2.熟悉722G型可见光分光光度计的使用
二、实验原理
血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT），在37℃、pH7.4 的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊 二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
在足量底物作用下，生成产物越多表明酶活力越大， 酶浓度越高。一般以在一定时间内丙酮酸的生成量代 表血清ALT活力的大小
三、试剂和仪器
(一）试剂 1、 小牛血清 2、ALT底物液、2,4-二硝基苯肼溶液 0.4mol/L NaOH
(二）仪器 722G型可见光分光光度计、恒温水浴箱
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制（不做）。 2.血清ALT活力测定 取两支试管按下表操作：
试剂（ml）
测定管
对照管
血清
0.1
0.1
ALT底物液
实验二
血清丙氨酸氨基转移酶测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定
丙氨酸氨基转移酶（ALT）是体内最重要的转 氨酶之一，正常情况下，丙氨酸氨基转移酶主要存 在于各组织细胞中（以肝细胞中含量最多，心肌细 胞中次之），只有极少量释放入血，所以血清中此 酶活力很低。当这些组织病变、细胞坏死或通透性 增加时，细胞内的此类酶即可大量释放入血液中， 使血清中该酶活力显著增高。因此在患各种肝炎急 性病、药物中毒性干细胞坏死等疾病时，血清丙氨 酸氨基转移酶活力明显增高。
•从标准曲线上查出酶活力单位。
本法正常值：0~30单位。
注意事项
• 加完试剂需要将试管内溶液混匀 • 注意水浴的温度及时间 • 分光光度计的正确使用
• 【临床意义】
• 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于 阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发 性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。
标曲线血清丙氨酸氨基转移酶测定(赖氏法.
3. 标本的测定 按表2操作。
表二：
对照管 基质液（ul） 样品（ul） 显色剂 50 250 μ L 混合37℃水浴30分钟 250 μ L 样品管 250 50
基质液（ul） 37℃水浴20分钟
稀释氢氧化钠
250
2.5ml 2.5ml
室温放置3min，在波长510nm处，以蒸馏水调零，读取各 管吸光度。
血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）
【实验要求】 掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）的 原理 操作方法及标准曲线的绘制； 了解试剂的配制和临床意义。
【实验原理】
L-丙氨酸与α -酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶 （alanine aminotransferase，ALT，EC 2.6.1.2）催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，加入 2，4-二硝基苯肼终止酶反应，并与丙酮酸生 成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，苯腙在碱性条件 下显红棕色，在波长510nm处读取吸光度， 即可计算出丙氨酸氨基转移酶的活性。
【计算】 以空白调零，测定管吸光度减去对照管吸光度 的差值为标本的吸光度，用该值在标准曲线上 查得ALT的卡门单位。 或者以对照管调零，直接读出测定管吸光度值， 用该值在标准曲线上查得ALT的卡门单位。
【参考范围】 0～50卡门单位 【临床意义】 1.血清ALT活性增高可见于下述疾病：（1）肝胆疾病 传染性肝炎、肝癌、肝硬化活动期、中毒性肝炎、脂 肪肝、胆管炎和胆囊炎等；（2）心血管疾病 心肌梗 死、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等；（3） 骨骼肌疾病 多发性肌炎、肌营养不良等。 2.一些药物和毒物可引起ALT活性升高 如氯丙嗪、异 烟肼、利福平、奎宁、地巴唑、水杨酸制剂、乙醇、 铅、汞、四氯化碳、有机磷等。停药后ALT活性就可下 降。
赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
实验十九 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】L-丙氨酸 + α-酮戊二酸α-丙酮酸 + L-谷氨酸 α-丙酮酸 + 2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙 （红棕色，λ=505nm ）利用比色分析原理将样品显色与丙酮酸标准品配制成的系列标准液比较，求出样品中丙氨酸氨基转移酶（ALT ）活性。
【试剂】1．0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液 称取KH 2PO 4 13.61g ，溶解于蒸馏水中，加水至1 000ml ，4℃保存。
2．0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液 称取Na 2HPO 414.22g ，溶解于蒸馏水中，并稀释至1 000ml ，4℃保存。
3．0.1mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4） 取420ml 0.1mol/L 磷酸氢二钠溶液和80ml 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，混匀，即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
加氯仿数滴，4℃保存。
4．基质缓冲液 精确称取D-L-丙氨酸1.79g ，α-酮戊二酸29.2mg ，先溶于0.1mol/L 磷酸盐缓冲液约50ml 中，用1mol/L NaOH 调pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100ml ，4～6℃保存，该溶液可稳定2w 。
每升底物缓冲液中可加入麝香草酚0.9g 或加氯仿防腐，4℃保存。
配成200mmol/L 丙氨酸与2.0mmol/Lα-酮戊二酸基质缓冲液。
5．1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液 称取2，4-二硝基苯肼（AR ）19.8mg ，溶于1.0mol/L 盐酸100ml ，置棕色玻璃瓶中，室温中保存，若冰箱保存可稳定2个月。
若有结晶析出，应重新配制。
6．0.4mol/L NaOH 溶液 称取NaOH 1.6g 溶解于蒸馏水中，并加蒸馏水至100ml ，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。
7．2.0mmol/L 丙酮酸标准液 准确称取丙酮酸钠（AR ）22.0mg ，置于100ml 容量瓶中，加0.05mol/L 硫酸至刻度。
生化检验实验ALT ALP
实验十实验名称：血清中ALT的测定实验目的与要求：掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理。
实验仪器、试剂：丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒，分光光度计实验原理：血清中的丙氨酸氨基转移酶催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，可测定其吸光度值，通过标准曲线计算出丙氨酸氨基转移酶的活力。
操作方法：1、将NaOH溶液稀释10倍，至0.4mol/L，基质液37℃水浴。
2、标准曲线的绘制，取5支试管，按下表分别加入试剂，试管0 1 2 3 4生理盐水（ml）0.1 0.1 0.1 0.1 0.1丙酮酸标准(ml) 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20基质液（ml）0.50 0.45 0.40 0.35 0.30活力单位0 28 57 97 150各管加入2，4-二硝基苯肼0.50ml混匀，37℃水浴20分钟,再分别加入0.4mol/LNaOH溶液5.0ml,室温10分钟。
以“0”管调零，505nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，酶活力单位为横坐标绘制标准图。
3、取试管2支，按如下操作：单位ml 测定对照血清0.10 0.10基质液0.50 -混匀，37℃水浴30min2，4-二硝基苯肼0.50 0.50基质液-0.50混匀，37℃水浴20min加入0.4mol/LNaOH溶液5.0ml，室温10分钟。
以对照管调零，505nm测定吸光度，实验现象与数据：记录吸光度值结果分析与结论：在标准曲线上查得酶活力单位。
参考值：0－25临床意义：实验十一实验名称：血清碱性磷酸酶的测定实验目的与要求：掌握AMP法测定血清碱性磷酸酶的原理。
实验仪器、试剂：碱性磷酸酶测定试剂盒半自动生化分析仪实验原理：血清中碱性磷酸酶在碱性条件下将磷酸-4-硝基苯酚中的磷酸基转移到2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）并释放4-硝基苯酚。
在405nm处测定4-硝基苯酚生成的速率，即可计算出ALP的活性。
生化检验实验赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶
步骤：一．组长取5个试剂瓶贴标签注明将要装的实际名称，然后倒取试剂。
血清由老师分装后，由组长领取。
二．测定血清ALT1.取2支试管，贴标签注明组别、学号、对照管（B）和测定管（U），用微量移液器分别加0.1ml血清。
2.用移液管向U管中加入0.5ml基质缓冲液。
B管不加。
混匀后同时在水浴温箱中37℃保温30min。
作用：U管中有酶促反应，B管无。
3.用移液管向B、U管各加0.5ml 2,4-二硝基苯肼溶液。
作用：终止反应，生成显色物质。
4.用移液管向B管加入0.5ml基质缓冲液，U管不加。
混匀后在水浴温箱中37℃保温20min。
作用：保证检测条件的一致性。
5.用移液管向B、U管各加2,4-二硝基苯肼溶液作用：碱性条件，显色。
6.B、U管室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度。
注意：基质缓冲液和2,4-二硝基苯肼溶液的加入顺序不能颠倒A。
表13-7三．ALT标准曲线绘制1.取5支试管，贴标签标明组别、学号、序号（0、1、2、3、4）。
用移液管取0.1 mol/l磷酸盐缓冲液，各加0.1ml。
2.用移液管取2.0 mol/l丙酮酸标准液加入各试管，0管不加，1、2、3、4管各加0.05、0.10、0.15、0.20ml。
作用：代替酶促反应产物。
3.用移液管取基质缓冲液加入各试管，0、1、2、3、4管分别加0.50、0.45、0.40、0.35、0.30ml。
4.用移液管取2,4-二硝基苯肼溶液加入各试管，各加0.5ml。
5.混匀，各试管同时在水浴温箱中37℃保温20min。
6.用移液管向各试管加2,4-二硝基苯肼溶液。
7.混匀，室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度A。
各管吸光度减去0管吸光度为该标准管的吸光度值。
8.以吸光度值为纵坐标，对应的卡门单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成标准曲线。
表13-6。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
赖氏法实验报告
1. 掌握赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的原理和方法。
2. 学会操作赖氏法测定ALT活性的实验步骤。
3. 熟悉ALT测定的临床应用及注意事项。
二、实验原理赖氏法是一种常用的酶偶联速率法，用于测定血清中ALT活性。
该方法利用ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸在磷酸盐缓冲液中进行反应，生成L-丙酮酸和α-酮戊二酸，同时NADH被氧化为NAD+。
在特定波长下，NADH的吸光度与ALT活性呈线性关系，通过测定吸光度变化，计算出ALT活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本（2）赖氏法ALT测定试剂盒（3）磷酸盐缓冲液（4）L-丙氨酸（5）α-酮戊二酸（6）NADH（7）NAD+（8）分光光度计2. 实验仪器：（1）恒温水浴箱（2）移液器（3）离心机（4）微量滴定板1. 样本处理：取血清样本，按照试剂盒说明书进行稀释。
2. 标准曲线制备：（1）取6个微量滴定板，分别加入不同浓度的标准ALT溶液。
（2）向每个板中加入一定量的磷酸盐缓冲液，混匀。
（3）加入一定量的L-丙氨酸和α-酮戊二酸，混匀。
（4）将滴定板放入恒温水浴箱中，设定反应时间。
（5）反应结束后，加入一定量的NADH和NAD+，混匀。
（6）在特定波长下测定吸光度，以ALT浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样本测定：（1）按照标准曲线制备的步骤，向微量滴定板中加入血清样本。
（2）按照标准曲线制备的步骤，进行反应和测定吸光度。
（3）根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性。
五、结果与分析1. 标准曲线制备：根据标准曲线，得出线性方程为y=0.0068x+0.0015，其中y为吸光度，x为ALT浓度。
2. 样本测定：根据标准曲线，计算血清样本的ALT活性为40 U/L。
六、讨论1. 赖氏法测定ALT活性的原理和步骤简单，操作方便，准确度高。
2. 实验过程中，要注意反应时间的控制，以保证反应充分进行。
3. 标准曲线的制备是实验的关键环节，要确保标准曲线的线性关系良好。
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步骤：
一．组长取5个试剂瓶贴标签注明将要装的实际名称，然后倒取试剂。
血清由老师分装后，由组长领取。
二．测定血清ALT
1.取2支试管，贴标签注明组别、学号、对照管（B）和测定管（U），用微量移液器分别
加0.1ml血清。
2.用移液管向U管中加入0.5ml基质缓冲液。
B管不加。
混匀后同时在水浴温箱中37℃
保温30min。
作用：U管中有酶促反应，B管无。
3.用移液管向B、U管各加0.5ml 2,4-二硝基苯肼溶液。
作用：终止反应，生成显色物质。
4.用移液管向B管加入0.5ml基质缓冲液，U管不加。
混匀后在水浴温箱中37℃保温
20min。
作用：保证检测条件的一致性。
5.用移液管向B、U管各加2,4-二硝基苯肼溶液作用：碱性条件，显色。
6.B、U管室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度。
注意：基质缓冲液和2,4-二硝基苯肼溶液的加入顺序不能颠倒A。
表13-7
三．ALT标准曲线绘制
1.取5支试管，贴标签标明组别、学号、序号（0、1、2、3、4）。
用移液管取0.1 mol/l
磷酸盐缓冲液，各加0.1ml。
2.用移液管取2.0 mol/l丙酮酸标准液加入各试管，0管不加，1、2、3、4管各加0.05、
0.10、0.15、0.20ml。
作用：代替酶促反应产物。
3.用移液管取基质缓冲液加入各试管，0、1、2、3、4管分别加0.50、0.45、0.40、0.35、
0.30ml。
4.用移液管取2,4-二硝基苯肼溶液加入各试管，各加0.5ml。
5.混匀，各试管同时在水浴温箱中37℃保温20min。
6.用移液管向各试管加2,4-二硝基苯肼溶液。
7.混匀，室温放置5min，在波长505nm以蒸馏水调零，读取吸光度A。
各管吸光度减
去0管吸光度为该标准管的吸光度值。
8.以吸光度值为纵坐标，对应的卡门单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值
作图，即成标准曲线。
表13-6。