长白山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的分离纯化

大连理工大学硕士学位论文长白山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的分离纯化及活性研究姓名：李莹雪申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：安利佳;包永明20020601欧随由南籍嫒蛇蛇毒神经海索静分离纯纯及活髋聱｝究摘要采用ｉ５同离子交换层析和凝胶过滤层析技术，从长白山自眉蝮蛇（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｂｌｏｍｈｏｆｆｉｉｕｓｓｕｒｅｎｓｉｓ）蛇薄粗海中筛选分离得到了一种神经辫素ａ凝胶层析测定为单一组分，ＳＤＳ．聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条带，两种方法得到的分予量基本一致，证明其为单难基分予，质谱检测其分予餐为１３８８Ｉ．８５±０．３３Ｄ，等电聚焦电泳测定其等电点为８．５６。

酶活实验证明长自山白腭蝮蛇蛇海神经毒索不具有磷脂酶Ａ２活性、纤溶酶活性、乙酰胆碱脂酶活性及出ｊ衄活性。

海性实验测定该毒索对小鼠的半数致死量为５１ｍｇ／ｋｇ。

热板实验淡明该蛋白具有中枢神经镇痛活性，且镇痛活性与给药剂量成ｍ比。

纳洛酮抑制实验证明该神经毒索止痛效果可被纳洛酮抑制，掇示其镇痫作用与阿片鼹体有关。

该神经诲素在１．２５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．Ｐ．）的给药莉蹩时，对小鼠的镇痛活性约是辅酸哌替啶（３０ｍｇ／ｋｇ）的２０倍。

以摩尔计算则燕其的８８０涪左右。

关键诵：长自山囱眉蠖蛇蛇毒ｌ神经毒素ｉ分离纯能ｉ攮痛淆性长白山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的分离纯化及洒性研究ＡｂｓｔｒａｃｔＡｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｈａｓｂｅｅｎｐｕｒｉｆｉｅｄｔｏｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙｆｒｏｍｔｈｅｃｒｕｄｅｓｎａｋｅｖｅｎｏｍｏｆＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｂｌｏｍｈｏｆｆｉｉＵｓｓｕｒｅｎｓｉｓｂｙｅｍｐｌｏｙｉｎｇｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｏｎａＨｉＴｒａｐＳＰ（５ｘ５ｍ１）ｃｏｌｕｍｎａｎｄｇｅｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｎａＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ｃｏｌｕｍｎ（１２０ｍ１），ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄａｓｉｎｇｌｅｂａｎｄｉｎＳＤＳ－ＰＡＧＥ．ＵｓｉｎｇＱ—ＴＯＦ／ＭＳ，ｔｈｅｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｈａｖｅａｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆ１３８８１．８５４－０．３３Ｄ，ａｎｄｔｈｅｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｉｓ８．５６ａｎａｌｙｚｅｄｂｙＩＥＦ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｈａｓｎｏｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅＬＤｓ０ｏｆｔｈｅｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｉｓ５．１ｍｇ／ｋｇ．Ｉｔｓａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｔｈｅｈｏｔｐｌａｔｅｔｅｓｔ．Ｗｈｅｎｉｎｊｅｃｔｅｄ（ｉ．Ｐ．）ｉｎａｄｕｌｔ６１５ｍｉｃｅ（１８－２２９），ｉｔｉｎｄｕｃｅｄａｔｉｍｅ—ｄｏｓｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎａｌｇｅｓｉｃｅｆｆｅｃｔｗｈｉｃｈｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｎａｌｏｘｏｎｅ，ｔｈｕｓｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇａｎｏｐｉｏｉｄａｃｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｗｈｅｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｐｅｔｈｉｄｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（３０ｍｇ／ｋｇ），ｔｈｅｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｉｎａｄｏｓｅｏｆ１．２５ｍｇ／ｋｇ（ｉ．Ｐ．）ｉｓａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ２０－ｆｏｌｄｍｏｒｅｐｏｔｅｎｔｔｈａｎｉｓａｂｏｕｔ８８０－ｆｏｌｄｐｅｔｈｉｄｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅａｓａｎａｎａｌｇｅｓｉｃ．Ｏｎａｍｏｌａｒｂａｓｉｓｉｔｍｏｒｅｐｏｔｅｎｔｔｈａｎｐｅｔｈｉｄｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｕｋｉｓｔｒｏｄｏｎｂＩｏｍｈｏｆｆｉｉＵｓｓｕｒｅｎｓｉｓ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ：ａｎａＩｇｅ８ｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ长自由自瘸浚蛇蛇毒神经毒索鲸分离缝往及活性磷究前言章率经毒豢是蛇簿蛋自鹣重要鳃液帮分，在稳凑上炼睾睾经毒素援霜寒浚疗矮固性享孛经痛、风湿瘸、肌肉萎缩憔侧索硬化症和戒毒。

与传统的镇痛药相比蛇毒神经毒索具有止痛时间长，无成瘾性等优点，因此一矗倍受入｛ｆ】关注。

蟊前发瑰秘静经薄素多来鸯跟镜蛇科鞠海蛇秘，瑟摆蝰蛇科和响尾蛇科则很少发现。

有关长臼山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的研究东今还未见报道。

长自由臼詹竣赡蛇毒楚一静蜜畲盎德嚣毒索瓣癌露，获箕中疆取豹渍礁翡已用于临床治疗血栓病，黼其它缌分则米能加以利用。

如果能从该蛇毒中摄取到具有止痛效果的神经毒素，就有可能实现对自眉暖蛇蛇鸯的迸～步综合剩蘑，觚蔼爨赢羹经济徐蛰。

在本文中，我们利用神经毒索的特性从长囱山白屑蝮蛇蛇毒粗毒中筛选分离斑取出一种神经海素，对其缩稳，酶活萑进行了裙步研究，并显建立逛７动物实验模型，对该毒索的镇痛摄性和镇瘸机理逃行了初步的探讨。

上述ｊ：作不仅具有一定的科研价值，也为开发威用新的镇痛药打下了基穑。

该课题为大遣市科技局资助项目。

长白山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的分离纯化及活性研究１文献综述１．１概述【１】蛇作为一种古老的动物在地球上已经生存了１．３５亿年。

在现今存活的２７００种蛇中，有毒蛇６００多种，其中剧毒的有１９５种。

我国蛇类资源丰富，己发现的蛇有１６５种，其中毒蛇有４７种，隶属于４科２５属，主要分布在长江以南地区。

蝮蛇主要有白眉蝮短尾亚种和白眉蝮乌苏里亚种。

长白山白眉蝮蛇属于蝰蛇科蝮亚科白眉蝮乌苏里亚种。

主要分布于我国的辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、山东、河北等省，以及朝鲜、俄罗颠的部分地区。

该蛇头部略成三角形，吻棱明显，鼻间鳞宽，外侧缘尖细，背鳞起棱。

体较短粗，尾部较小。

头部在眼后到口角有一较宽的黑色带，其上缘镶以黄白色细纹。

体背交互排列着黑褐色的圆形斑，有些个体出现一条红棕色脊线，腹面灰黑色，具有不规则的灰色小点。

与短尾蝮不同，乌苏里亚种尾下鳞数目较多，尾部与体部色斑相似，短尾亚种尾下鳞数目较少，尾后段焦黄色无斑，尾失常为黑色。

全长４００—７００ｍｍ。

该蛇多栖于平原和丘陵地带的坟堆草丛，荒野及其附近的稻田，麦地和小路旁。

入蜇前和出蛰后一段时间多于白天在洞口附近活动，属晨昏性蛇类，食性广。

１０月上旬开始入蛰，至翌年５月中旬才出蛰。

卵胎生，８月中下旬至９月上中厶Ｊ产仔，每次产２条－２０条。

１。

２蛇毒中的毒素及活性因子概述蛇毒的主要生物学功能是帮助蛇捕食和消化食物。

蛇毒中的毒素种类很多，都属于蛋白质和多肽。

各种毒素或者单独作用或者协同作用。

对蛇毒中的２长自山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的分离纯忧及活性研究毒索势类方法缀多，有久麓擎麴把毒索分为襻经毒素秘盘獯垮毒素嚣类。

毒孛经毒素是指能够影响李枣经一肌巍传导，碍ｌ起砰设麻痹的毒索。

根据其作用位点不同，又分为突触后神经毒素和突触前神经毒素两种。

ｍ循环濑素种类繁多，它们的基本特点都是作用于动物酶血液循环系统，童要存在予鹃尾懿毒帮戆兢毒中。

Ｋｌ曲ｕｓｉｔｚｔｖ（１９３６）根据毒素的生理作用把蛇毒中的毒憷组分大致分为１０类：１．２．１律席子斑液本身或备静斑液成分静匏麓爨有这类甥厦要么热速要么延缓血液凝固，或者引起溶魍，或者减弱白细胞的活动性。

这类物质如类凝觑酶，直接溶血因子等。

１．２．２影响血液循环物质这类穆质一部分箨璃予盘管静缀中心，一裁分｛睾用予盘管宋搂，镬冀爨张。

欺类物矮如某些心脏毒索，舒缓激默增强烈予和降压因子等。

１．２．３作用予横纹肌的物质这些物质可以改变肌肉细胞的邋透性，弓ｌ怒组织肿胀，有些稳可醴弓ｌ起心虢豹浚维。

１．２。

４佟用予乎滑胍的物质通过对～些分离器僧，如小肠，子宫，输卵管的实验，可以证明此类物质的存在。

小剂量蛇毒或其组分可以ｇｆ起上述器官的收缩，大翔量潮可敬侵其寐瘪。

１．２。

５影响代谢的物质给家兔按每千克体踅ＩＯｍｇ的剂量注射烙铁头蛇毒或某些眼镜蛇科蛇毒，能够俄家兔酌血稿水平升至原来的２００％，舔使内脏襻经已经谤鞭，戴者鹜上艨已经淀去，这个｛乍爰仍然存在。

１．２．６改变ｍ液中碱储铸的物质矛头骏属、确尾蛇满帮眼镜蛇耩的蛇簿辛禽骞鼍潋改交盘滚中疆麓备豹躲’长白山自描蝮蛇蛇毒神经毒索的分离纯化及活性研究两与突触蓊神经毒素稽煮葚远。

ｂ．商级结构鑫静已或功静瓣定了忍释突融惹帮经簿素静窒愆结稳，它露是海蛇程熬Ｅｒａｂｕｔｏｘｉｎｂ和Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎａ，限镜蛇科的ｎ．Ｃｏｂｒａｔｏｘｉ和ｏ，Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ。

前２静属予短链棒经毒素，爱２穗鬟予长链神经毒素。

这些毒豢熬ｘ簿瓣谤究邑达Ｏ．２８ｒｉｍ以上分辨率，所得到的空间绩聿毒愚缀类似韵。

潋Ｅｒ如ｕｔｏｘｉｎｂ为镶，４对二硫键聚集在一起，形成一个致密的瘫核，崮瑟拔，§｛枣曩爨３令嚣，整个分子好缘一个碟子，如图１．１所永。

对Ｅｒａｂｕｔｏｘｉｎｂ麓二缓装魏磷究表鞠，它主要是０。

折叠结构，不存在ｏ．螺旋结构。

捌弛翻虬ｓ爨示，六条嘴焉‰善篇燃竺篡兽通过许多链问鬣键维系在～起，不变的或保守簸基骏残鏊，豫了一部分焱４对半胱氨酸与结构稳定性商关外，大部分集中在中阉那令大环上，嚣盈分鑫予巧的一侧，形成～个活性寝面。

尽管对突齄蠡爨经毒索静窆弱缀梅终了较详细的研究，但对突触后神经毒素与受体结合豹缝合蒸经龆知邋豹不多。

从圈１＋≈；糍麓ｂ的艇平Ｅｒａｂｕｔｏｘｉｎｂ空间结构的活性表灏这个Ｆｉ９１．２ＴｈｅａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌＢ’。

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“ｏ‘Ｅｒａｂ“‘““‘ｎｂ攮型，可以对突魅爱毒孛缀毒素豹搀用规制做～些推测：一是将此神经毒紫的活蛙表嚣毙接一个酶豹活毂中心，簿以推测乙懿疆碱爱体正照与这个活性中心栩９长白山白眉蝮蛇蛇毒神经毒素的分离纯化及活性研究互作用的。

另一种可能是，当毒素与受体分子发生作用时，毒素分子将其大环插入受体的缝隙或通道中，而分子的活性表面上的正电荷则有利于使毒素分子被吸引到通道中去，正是这种通道的封闭，可以导致去极化的阻断。

突触后神经毒素与乙酰胆碱受体结合后，与受体接触的部分肯定对化学修饰剂不再敏感。

根据这一特点，Ｔｓｅｔｌｉｎ等（１９８２）和Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等（１９８３）分别对眼镜蛇泰国亚种（Ｎａｊａｎａｊａｓｉａｍｅｎｓｉｓ）蛇毒中的神经毒素活性位点进行了研究。

结果表明该蛇毒中的突触后神经毒素与受体的接触面较大，与此有关的氨基酸残基包括Ｌｙｓ２３，ｌｙｓ４９和ＩｌｅＩ，Ｌｙｓ６９和Ｌｙｓ３５也可能与结合作用有关。

图１．３．ＥｒａｂｕｔｕｘｉｎｂＢ．折叠结构的部分氢键Ｆｉ９１，３ｈｙｄｒｏｇｅｎｂｏｎｄｉｎＢｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＥｒａｂｕｔｕｘｉｎｂ眼镜蛇泰国亚种（Ｎａｊａｎａｊａｓｉａｍｅｎｓｉｓ）蛇毒中的ａ．Ｃｏｂｒａｔｏｘｉｎ属于长链神经毒素，它在三维结构和功能上与Ｅｒａｂｕｔｏｘｉｎｂ相似，但免疫学很不一样。

长链神经毒素与短链神经毒素结构的差异有以下两个方面：一是长链神经毒素中央大环顶部分叉，这是第５对二硫键的存在而引起的；另一处是它有一个长的尾巴从致密的二硫键核心伸出，这一凸出的尾部表面可能是它具有独特免疫学性质的结构基础，其他一些免疫学资料也支持这一点。