一种改良的扩增cDNA 5'末端的方法
5-RACE经验
5 Race(2007-11-18 21:37:08)转载▼分类：核酸技术如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。
在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。
做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。
克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。
偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。
然后一次就出来了。
RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。
PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。
SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。
再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。
这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。
另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。
希望你能有好结果。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
5'race具体方法和实验流程
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扇贝防御素基因改良5’cDNA末端快速扩增聚合酶链反应筛选方法的研究
ＬＩ Ｙ ｎ —ｕ ， Ｕ ｏ ｇｊ ｎ ＨＯＵＧａ ， ｎ ’ ＨＵＡＮＧ —ａ 。 （ ．Ｉ ｓｉｕｅｏ ｂ ｒ ｔｒ ｆ Ｍｅ ｃｎ ； ．Ｉ ｓｉｕ ｅｏ Ｂｉ— Ｄｉｎ ｎ ’ １ ｎ ｔｔ ｔ ｆ Ｌａ ｏａ ｏ ｙ ｏ ｄｉｉ ｅ ２ ｎｔｔ ｔ ｆ ｏ
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１６ ・ １Ｏ
检 验 医学 与 临 床 ２ １ ０ ２年 ５月 第 ９卷 第 １ Ｉ ｂＭｅ ｌ ， ｙ２ １ ， ｏ． ， ． ０ ０期 ｄＣｉ Ｍａ ０ ２ Ｖ １９ Ｎｏ １ ａ ｎ
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论 著 ・
扇 贝 防御 素 基 因 改 良 ５ｃ ＤＮＡ 末 端 快 速 扩增 聚 合 酶 链 反 应 筛选 方 法 的研 究
【 要 】 目的 应 用 改 良 ５ｅ ＮＡ 末 端 快 速 扩 增 聚 合 酶 链 反 应 （ Ｃ ） 摘 Ｄ ＲＡ Ｅ 筛选 扇 贝抗 茵 肽 基 同 源性 的双 壳类 抗 菌肽 （ ＭＰ 的 筛选 方法 。方 法 Ａ ）
保 守序 列设 计基 因特 异 性 简并 引物 ， 行 改 良 ５ 进 ＲＡ Ｅ钓 取 可能 防御 素 基 因 ｃ ＮＡ 的 ５端 序 列 、 克 隆 、 ＮＡ 测 Ｃ Ｄ ＡＴ Ｄ 序 和 同 源性 分析 。结 果 采 用 改 良 ５ ＲＡ Ｅ 从 扇 贝 血 淋 巴 Ｒ Ｃ ＮＡ 中得 到 多 个 未 知 基 因 的 ｃ ＮＡ ５ 端 序 列 ， 选 Ｄ 挑 ６０ｂ 以 下 的基 因 片段 进 行 ＡＴ 克 隆和 ＤＮ 测 序 后 得 到 ３个 插 入 片段 序 列 ， 长度 分 别 为 ２ ７ ２５和 ５ １ ｐ ０ ｐ Ａ 其 ５ 、７ １ 。通 ｂ 过 Ｂ Ａ Ｔ 程 序 搜 索 Ｇ ｎ ａ ｋ核 酸 数 据 库 ， Ｌ Ｓ ｅＢｎ 未发 现 与 之 高度 同 源的 基 因 。结 论
5’-race鉴定转录起始位点的原理
5’-race是一种用于鉴定RNA转录起始位点的实验技术，它可以帮助研究者确定基因的启动子区域和转录调控元件，对于理解基因表达调控机制具有重要意义。
本文将介绍5’-race的原理及其在实验中的应用。
一、什么是5’-race？5’-race是Rapid Amplification of cDNA Ends的缩写，翻译为cDNA末端快速扩增。
该技术最早由Frohman等人于1988年提出，并在随后的研究中不断完善和应用。
5’-race主要用于鉴定mRNA的5’端序列，揭示RNA的转录起始位置，并发现新的调控元件。
二、5’-race的原理1. 引物连接：5’-race首先通过连接一个短寡核苷酸引物到RNA的5’端，同时进行逆转录反应以合成cDNA。
这个引物称为内引物。
2. 增大cDNA：在反转录后，通过PCR技术进行cDNA的快速扩增，采用一个外引物和内引物的连接引物结合进行扩增。
3. 清除非特异产物：将PCR产物纯化后，对于其中非特异扩增的产物进行去除，留下特异的5’端cDNA。
4. 提取cDNA：将特异5’端cDNA变性后进行连接进行克隆。
5. 测序：对克隆产物测序，最终得到RNA的转录起始位点。
三、5’-race的应用1. 确定基因启动子区域：通过5’-race技术可以鉴定基因的转录起始位点，从而确定基因的启动子区域，帮助研究者进一步分析基因的转录调控机制。
2. 发现新的转录起始位点：对于未知基因或未知转录本，5’-race可以帮助研究者发现新的转录起始位点，进一步研究其功能及调控机制。
3. 肿瘤基因的研究：在肿瘤基因研究中，通过5’-race技术可以鉴定肿瘤相关基因的启动子区域和转录调控元件，对于肿瘤的发生和发展具有重要意义。
四、5’-race的优势与局限1. 优势：5’-race技术可以在较短的时间内鉴定RNA的转录起始位点，帮助研究者快速了解基因的转录调控机制。
2. 局限：5’-race技术对于RNA的质量和纯度要求较高，同时在设计引物和PCR条件优化上也需要一定的技术经验。
[转载]基因文库构建的过程、原理及方法
![[转载]基因文库构建的过程、原理及方法](https://img.taocdn.com/s3/m/75baf7f9162ded630b1c59eef8c75fbfc77d94c1.png)
[转载]基因⽂库构建的过程、原理及⽅法原⽂地址：基因⽂库构建的过程、原理及⽅法作者：蓝茶基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于 RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
cDNA末端的快速克隆
cDNA末端的快速克隆(RACE技术)1.基本原理对RNA结构进行分析时，一般通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再将扩增后的目的DNA片段进行克隆、测序来进行。
但一般的RT-PCR反应很难扩增某一基因从mRNA得到的全长cDNA片段。
在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要。
RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效地解决这一问题：通过已知的cDNA序列情况，进一步扩增此cDNA的5′末端或3′末端。
图1. 5′-RACE法原理图（1）以目的mRNA为模板，使用5′末端P标记的RT引物进行反转录反应，合成1st Strand cDNA。
（2）使用RNase H分解Hybrid DNA-RNA中的RNA链。
（3）使用T4 RNA Ligase使单链cDNA进行环化或形成首尾连接物。
（4）进行PCR扩增。
图2.各引物设计位置图2.注意事项引物设计时，设计引物的位置、结构、引物的长短等对实验结果影响很大，应注意以下几点。
1．反转录引物◇ 由于单链连接的需要，反转录引物必须进行5′末端P标记。
5′末端P标记可以在合成引物时直接进行。
◇ 反转录引物的长度以12～15 mers为宜。
◇ 设计反转录引物时，尽量选定靠近5′末端区域。
2．PCR引物◇ 引物长度以20 mers左右为宜。
◇ 引物中的GC含量应在50%左右，保证GC、AT分布均匀，避免局部富含GC或AT，特别是引物的3′末端不要富含AT。
◇ 避免引物自身形成二级结构（发夹结构等）。
◇ 1st PCR、2nd PCR用引物尽量避免形成引物二聚体，特别是3′端的3～4个碱基不要与配对引物形成互补序列。
3. 5′-RACE扩增的DNA片段的测序由于mRNA库中的每个分子的mRNA的5′端不一定全部完整，往往是参差不齐，特别是提取的RNA的状态不佳时，这种情况将更为严重。
所以在进行5′-RACE 实验时，扩增的PCR产物往往是长短不一的DNA片段混合物（相差数个至数十个碱基）。
RACE技术的原理和操作
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
编辑本段优点与筛库法相比较，有许多方面的优点1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。
2）节约了实验所花费的经费和时间。
3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
实验室现有的RACE试剂盒的简介RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。
此方法会产生较少的错误条带。
此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。
使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。
编辑本段引物的设计基因特异性引物（GSPs）应该是：23－28nt50－70％GCTm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
编辑本段反应中涉及到的一些事项cDNA的合成起始于polyA+RNA。
如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。
RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。
在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。
表4中给出了所有引物的相互关系。
重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。
另外，重叠的引物可以为PCR 反应提供一个对照。
并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。
引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。
这样可以使用降落PCR。
避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介
CDNA末端快速扩增技术(RACE)简介CDNA末端快速扩增技术(RACE)是一种利用PCR技术从低丰度的转录本中快速获取CDNA的5’和3’末端序列的方法。
这种方法的优点是简单、快速、廉价，可以用于研究基因的结构和表达。
RACE技术有两种主要类型，分别是3-RACE和5-RACE，分别用于扩增CDNA的3’和5’末端序列。
3-RACE原理和步骤3-RACE原理是利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用一个带有SMART序列的通用接头引物Oligo(dT) 30MN作为锁定引物，反转录合成第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因3’末端的DNA片段扩增出来。
3-RACE步骤如下：•从RNA样品中提取mRNA，并用Oligo(dT) 30MN作为锁定引物进行反转录反应，合成第一链cDNA。
•用GSP1和UPM作为引物进行第一轮PCR反应，扩增出包含目的基因3’末端序列和接头序列的片段。
•从第一轮PCR产物中纯化出目标片段，并用UPM和另一个靠近GSP1的内嵌引物GSP2进行第二轮PCR反应，扩增出更精确的目标片段。
•从第二轮PCR产物中纯化出目标片段，并进行克隆、测序和分析。
5-RACE原理和步骤5-RACE原理是先利用mRNA的3’末端的poly (A)尾巴作为一个引物结合位点，用oligo (dT) 30MN作为锁定引物，在反转录酶MMLV作用下，反转录合成第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的未端转移酶活性，在反转录达到第一链的5’末端时自动加上3-5个(dC)残基，与含有SMART序列的Oligo (dG)通用接头引物配对后，继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物GSP2作为下游引物，以第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。
RACE技术的原理和操作
RACE技术的原理和操作RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术是一种用于扩增cDNA末端序列的方法，广泛应用于克隆和鉴定未知基因的研究中。
下面将详细介绍RACE技术的原理和操作步骤。
一、原理：RACE技术是通过逆转录反应将RNA转录成cDNA，然后利用特殊的引物设计，通过聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最终得到所需的cDNA末端序列。
RACE技术主要包括5'-RACE和3'-RACE两个步骤。
5'-RACE：用于扩增未知序列的5'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行逆转录反应，得到第一链cDNA。
2.利用聚dT载体和逆转录酶进行第二链合成。
3.利用内源引物（如具有较高表达的基因的已知序列）和外源引物A 进行PCR扩增。
4. 应用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
5.得到扩增的特异性产物后，纯化PCR产物并进行测序分析，获得5'端的未知序列。
3'-RACE：用于扩增未知序列的3'端操作步骤：1.提取总RNA，并进行反转录反应。
2.利用特异性引物（如基因的已知3'端序列）和逆转录酶进行第一轮PCR扩增。
3. 利用Nested PCR进行第二轮扩增，内嵌引物（nested primer）会在前一轮PCR反应的基础上扩增更长的特异性产物。
4.纯化PCR产物并进行测序分析，获得3'端的未知序列。
二、操作：1. 提取总RNA：一般使用RNAiso Plus试剂或类似试剂从细胞或组织中提取总RNA。
2. 逆转录反应：利用逆转录酶将RNA转录成cDNA。
逆转录酶一般有M-MLV逆转录酶和SuperScript III等。
3.第一链合成：利用聚克隆酶将逆转录的cDNA合成第一链，即得到第一链cDNA。
4.第二链合成：利用特殊的引物和逆转录酶将第一链cDNA合成第二链。
RACE原理及应用
RACE的简介目前,全长基因的获得是生物工程及分子生物学研究的一个重点。
尽管已经有多种方法可以获得基因的全长序列，但在很多生物研究中，由于所研究的目的基因丰度较低，从而使得由低丰度mRNA通过转录获得全长cDNA很困难。
近年来发展成熟的cDNA末端快速扩增(RACE)技术为从低丰度转录快速获得全长 cDNA 提供了一个便捷的途径。
cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。
简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。
因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。
第二 RACE的原理RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完整cDNA5’和3’末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchoredPCR)和单边PCR(one2side PCR)。
3’RACE的原理一)加入oligo(dT)17和反转录酶对mRNA进行反转录得到(-)cDNA；二)以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor)为引物，其中在引物的接头中有一在基因组DNA中罕见的限制酶的酶切位点。
这样就在未知cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
再用一个基因特异性引物(3 amp)与少量第一链(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。
三)利用3amp和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。
扩增的特异性取决于3amp的碱基只与目的cDNA分子互补．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。
RACE常见问题解析
RACE常见问题解析RACE常见问题解析1.RACE-PCR是什么？与反向PCR有什么区别吗?RACE是rapid amplification of cDNA ends的缩写，是一种从低丰度转录本中快速扩增cDNA5’和3’末端的简单有效的方法。
RACE的原理是在PCR技术的基础上用已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA 5’和3’末端的方法，为要获得cDNA 3’末端，以Oligo dT17和一个35bp的接头〔（dT）17－adaptor〕为引物反转录总RNA 得到（－）cDNA。
引物的接头有一个在基因组DNA中罕见的RE酶切位点，这样就在未知的cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。
然后用一个基因特异性引物（3‘amp）与少量第一条（－）cDNA链退火（一般＜1ng）并延伸，产生互补的第二条（＋）cDNA链。
最后用3'amp和接头引物进行PCR扩增即可得到cDNA双链。
反向PCR是对一个已知序列的DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究的方法。
2.PCR引物和RACE引物有什么区别从设计引物的技术上讲，两者没有显著区别。
但是设计引物时是根据预测的基因序列，而实际在RACE的PCR扩增中，模板是由mRNA逆转录而来的cDNA，由于预测的基因序列和实际的编码序列可能会不完全相同。
所以会存在这样的可能，设计的引物是位于内含子中，这样可能就没有特异性的扩增产物。
另外，做RACE实验，一般都需要通过nested PCR来增加特异性产物，所以一般要设计两对引物。
3.超长片段RACE时要注意什么？以我们的一点浅薄的经验来看，有几下几点建议：（1）、每一轮PCR都需要做个梯度找出最佳退火温度；（2）、检测RNA是否降解，只有确认没有或只有轻微降解后面的实验才有意义；（3）、用于第二轮巢式或半巢式PCR模板的第一轮产物应该以不同倍数稀释；（4）、扩增较长片段时应该适当延长变性时间；（5）、GSP引物设计也不容忽视，需要保证较好的特异性；（6）、使用LA Taq酶，并配以热启动；4. 5′RACE扩增的电泳结果为什么出现多种条带？原因可能是：扩增的基因为多基因家族的成员；已知序列信息有限，导致PCR扩增特异性差；mRNA 5′端剪切、拼接方式不同。
cDNA末端扩增技术的研究进展
与经典的通过 ｅ Ｎ Ｄ Ａ文 库筛选进而克隆全长 ｅ Ｎ ＤＡ 的方法相 比， 该方法实验周期短 、 技术步骤简单 ， 同 时可免去接触同位素对人体 的危害。另外 ， 由于该 方法的敏感性高 ， 特别适合于在某些组织 中对一些 低拷贝基 因的钓取 。因此 ， Ｃ Ａ Ｒ Ｅ技 术 已成 为克隆
Ｐ Ｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｏ ｅｏ ｔ ｅ ｐ ｍ ｒ ｅ ｎ ｌ ｎｎ Ｄ Ａ Ｃ ｒａ ｔ ｎ，ａ ｎ ｆ ｒ ａ ｙ ｍ ａ ｓｃｏ ｇ ｅ Ｎ ｉ ｈ ｉ ｉ
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维普资讯
第２ 卷 第２ ｌ 期
２００６年 ６月
河
北
林
果
研
究
Ｖ０ －ｌ ｌ２ Ｎｏ． ２
5-RACE经验汇总
5 Race(2007-11-18 21:37:08)转载▼分类：核酸技术如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5'-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。
在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。
做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。
克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。
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RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的，这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。
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SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5'端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。
再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。
这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。
另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。
希望你能有好结果。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
现代分子生物学名词解释朱 玉贤
ABC模型：即控制花形态发生的模型。
该模型把四轮花器官同时发生作为基本前提，强调花形态突变体产生不同花器官的生理位置变化。
该模型中正常花的四轮结构的形成是由三组基因A、B、C共同作用完成的，每一轮花器官特征的决定分别依赖于A、B、C三组基因中的一组或两组基因的正常表达oA组基因控制萼片、花瓣的发育，B组基因控制花瓣、雄蕊的发育，C组基因控制雄蕊、心皮的发育oA、C组基因互相拮抗，抑制对方在自身所控制的区域中表达，如其中任何一组或更多的基因发生突变而丧失功能，花的形态就出现异常。
AP位点(APsite)：所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核酸位点的糖苷水解酶，它能特异性切除受损核苷酸上的N-β糖苷键，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。
cDNA(complementaryDNA)：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。
C值(Cvalue)：通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量，以每细胞内的皮克(pg)数表示。
C值反常现象（Cvaluedox）：也称C值谬误。
指C值往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物C值却很大，如一些两柄动物的C值甚至比哺乳动物还大。
Dane颗粒：HBV完整颗粒的直径为42nm，称为Dane颗粒，由外膜和核壳组成，有很强的感染性。
DNA（deoxyribonucleicacid）：脱氧核糖核酸，是世界上所有已知高等真核生物和绝大部分低等生物的遗传物质。
DNA的半保留复制（semi-conservativereplication）：DNA在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。
因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
DNA的半不连续复制（serru-cliscontinuousreplication）：DNA复制过程中前导链的复制是连续的，而另一条链，即后随链的复制是中断的、不连续的。
5'race 测序原理
5'race 测序原理5' 端快速扩增的 cDNA末端测序（5' RACE）是一种用于确定RNA序列的实验技术。
该技术通常用于鉴定RNA的5'端，尤其是在未知的转录起始位点（TSS）或者在已知的TSS附近的RNA修饰位点。
下面我将从多个角度全面解释5' RACE 测序的原理。
首先，5' RACE 测序的原理基于逆转录和PCR技术。
首先，RNA通过逆转录酶转录成cDNA，然后使用特定的引物（内引物）与cDNA结合。
内引物通常是一个寡聚核苷酸序列，它会与cDNA的末端结合。
接着，内引物与cDNA结合后，逆转录酶开始合成第一链cDNA。
接着，通过PCR扩增技术，使用内引物和外引物进行扩增，外引物与内引物相结合可以扩增出目标cDNA的片段。
最后，扩增出的片段可以进行测序，从而确定RNA的5'端序列。
其次，5' RACE 测序的原理涉及到特定引物的设计。
内引物的设计需要考虑到其与cDNA末端的特异性结合，以及逆转录酶的合成。
外引物的设计需要考虑到内引物的位置，以确保扩增出目标cDNA的片段。
引物的设计对于5' RACE 测序的成功至关重要。
另外，5' RACE 测序的原理还涉及到PCR扩增技术。
PCR扩增是通过DNA聚合酶酶链反应合成大量特定DNA片段的技术。
在5' RACE 测序中，PCR扩增可以扩增出包含RNA 5'端序列的cDNA片段，从而进行后续的测序分析。
总之，5' RACE 测序的原理基于逆转录和PCR技术，通过特定引物的设计和PCR扩增技术，可以确定RNA的5'端序列，为研究RNA转录起始位点和修饰位点提供了重要的实验手段。
希望这些信息能够帮助你更全面地了解5' RACE 测序的原理。
cdna末端快速扩增实验步骤
cdna末端快速扩增实验步骤英文回答：CDNA末端快速扩增是一种用于从已知序列的cDNA末端扩增未知序列的实验方法。
下面是该实验的步骤：1. RNA提取，首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
这可以通过使用RNA提取试剂盒来完成。
将样品与提取试剂混合，然后通过离心将RNA沉淀下来。
最后，用去离子水重悬RNA。
2. 反转录，接下来，需要将RNA转录成cDNA。
这可以通过使用反转录酶和随机引物来完成。
将RNA与反转录试剂混合，然后在适当的温度下进行反应，使RNA转录成cDNA。
3. 末端修复，在cDNA合成的末端通常存在未知序列。
为了扩增这些未知序列，需要进行末端修复。
这可以通过使用DNA聚合酶和dNTPs来完成。
在适当的温度下进行反应，使cDNA末端修复。
4. PCR扩增，接下来，需要进行PCR扩增。
这可以通过使用特定引物和PCR试剂混合来完成。
将cDNA模板与PCR试剂混合，然后在适当的温度下进行PCR反应。
PCR反应会扩增cDNA末端的未知序列。
5. 凝胶电泳，最后，需要对PCR产物进行凝胶电泳分析。
将PCR产物与DNA加载缓冲液混合，然后将混合物加载到琼脂糖凝胶上。
通过电泳将PCR产物分离，并使用DNA染料进行染色。
然后，使用紫外线照射凝胶，以可视化PCR产物。
中文回答：CDNA末端快速扩增是一种用于从已知序列的cDNA末端扩增未知序列的实验方法。
该实验的步骤如下：1. RNA提取，首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
可以使用RNA提取试剂盒进行提取。
将样品与提取试剂混合，然后通过离心将RNA沉淀下来。
最后，用去离子水重悬RNA。
2. 反转录，接下来，需要将RNA转录成cDNA。
可以使用反转录酶和随机引物来完成。
将RNA与反转录试剂混合，然后在适当的温度下进行反应，使RNA转录成cDNA。
3. 末端修复，cDNA合成的末端通常存在未知序列。
为了扩增这些未知序列，需要进行末端修复。
可以使用DNA聚合酶和dNTPs 进行修复。
cDNA+末端快速扩增技术(+RACE)+的优化与改良
cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良李关荣1,2,鲁 成2,夏庆友2,向仲怀2(1.西南农业大学农学与生命科学学院,中国重庆 400716;2.西南农业大学蚕学与生物技术学院,中国重庆 400716)摘 要:cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一.广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆.但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、Td T加尾、第二链合成、RACE-PC R扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度.主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述.关键词:cDNA末端的快速扩增法;优化;改良中图分类号:Q781 文献标识码:A文章编号:1007-7847(2003)03-0189-09The Optimization and Improvement of Rapid Amplificationof cDNA Ends(RACE)LI Guan-rong1,2,LU Cheng2,XIA Qing-you2,XIANG Zhong-huai2(1.College of Agronomy and Li f e Sciences,Southwest Agricultu ral University,Chon gqin g400716,China;2.College o f Sericultu re an d Biotechnology,Southwest Agricultura l Un iversity,Chon gqin g400716,China)Abstract:Rapid amplification of cDNA ends(RAC E)is one of the main methods for extending partially known e xon sequence and cloning of its ful-l length cDNA.It has been widely used in further extending of functional fra gments of genes of interests especially the cloning of the ful-l length cDNAs.RACE involves multiple enzyme-catalyzed processes,such as reverse transcription,TdT tailing,the sec ond-strand cDNA synthesis,RACE-PCR a mplification and the cloning of RACE products,which in practice have many problems and difficulties.These problems are analyzed in depth and the optimiza tions and improvements on each of the processes are revie wed. Key words:RACE;optimization;improve ment(Life Science Research,2003,7(3):189~197)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是扩增在mRNA的3 -末端或5 -末端的未知序列和已知部分外显子序列间的核酸序列的方法.此种单边特异性的扩增又称为 单边PC R (One-sided PC R)或锚定PCR(Anchored PC R).通常扩增复杂混合物中相对较少的目标分子的PCR要求扩增序列段的两个序列特异性引物,但为了扩增和鉴定未知序列区域,此种要求就构成了严重的局限.3 -和5 -RACE法提供了解决此问题的可能方法.这两种方法的结合可望获得全长cDNA基因.1 RAC E技术的原理及步骤3 -RACE利用mRNA3 -末端天然存在的Poly第7卷 第3期2003年9月 生命科学研究Life Science ResearchVol.7 No.3Sep.2003收稿日期:2003-04-01;修回日期:2003-08-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070580)作者简介:李关荣(1963-),男,四川营山人,西南农业大学副教授,博士,主要从事生物化学与功能基因克隆研究,Tel:+86-023-********,E-mail:lgrxn@(A)尾作为PCR扩增的通用引发点.首先用反转录酶和Oligo-dT接头引物对mRNAs进行反转录,使之转换为cDNA.然后,用一个能与已知外显子序列区退火的基因特异引物(GSP)和定位在Poly(A)尾部的接头引物直接进行PCR,扩增特异cDNA.这样,就能捕获位于外显子和Poly(A)尾之间的未知3 -mRNA序列.5 -RACE是一种从低拷贝信息中分离和鉴定5 -末端未知序列的方法.Frohman和Loh都综述过此法[1,2].尽管不同的使用者采用的具体的步骤略异,但策略是一致的.第一链cDNA的合成使用基因特异的反义寡核苷酸(GSP1)引发,使特异的mRNA及其相关家族转换为c DNAs,使完全延伸到5 -末端的潜力达到最大.第一链cDNA产物经纯化,去除未渗入的dNTPs和GSP1,用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)在cDNA的3 -末端加同聚尾[poly(T)或Poly(C)].最初,加尾后的cDNA用3个引物的混合物(在GSP1的3 -末端退火的基因特异性引物GSP2、互补的含同聚尾的锚定引物和相应的接头引物)进行PC R扩增.这使mRNA的5 -末端和GSP2间的未知序列得以扩增.RACE方法多用于传统cDNA克隆方法不易检测或挑战性极大的稀有mRNA的扩增和克隆. RACE也可用于已有的cDNA文库.随机六聚体引发合成的c DNA也曾用于5 -RACE从单一第一链反应中扩增和克隆了多个基因.RACE产物可直接测序,勿需任何中间克隆步骤;或用于制备探针.3 -RACE和5 -RAC E的产物可以结合得到全长cDNA.RACE法还可与外显子捕获法结合鉴定未知编码区序列.RACE法的重要特征是在PCR中使用一个根据mRNA的已知序列而设计的基因特异引物(GSP)和一个与mRNA的Poly(A)尾互补的 通用引物 (3 -RACE)或与添加在cDNA的3 -末端的同聚尾互补的 通用引物 (5 -RAC E).因同聚物不是良好的PCR引物,为了便于RACE产物的克隆,通用引物的5 -末端常引入一个限制性位点.用于RACE-PCR的cDNA模板可用Oligo-dT引物(3 -和5 -RACE),也可用与mRNA中的已知序列互补的引物(仅5 -RACE).在RACE-PCR产物复杂时,可取一等分的产物用第二个(在第一个引物内)特异的引物和原来的通用引物进行第二轮PC R,此为所谓的Nested PCR.2 RACE步骤的优化和改良2.1 反转录影响RACE结果的最关键步骤是mRNA的反转录合成第一链cDNA.这在克隆全长mRNA的5 -末端时尤其突出,因为不完全的cDNA仍然可以用TdT加尾和其后被PCR扩增.这些不完全分子与全长分子具有相同的末端,它们和全长分子都可以在PCR中扩增.这些不完全cDNA的存在,极大降低甚至不能产生代表全长cDNA的PCR产物,因为在有异质和具相同末端底物的PC R反应液中,较小的DNA分子较易发生扩增[3].因此,应当优化反转录过程,尽可能地避免不完全cDNAs的产生,因而必须使用高质量的、未被降解的mRNA.常用一步分离法[4],从组织或少量组织培养细胞中提取总RNA,对于大量的组织培养细胞,可采用胞质RNA制备方法制备[5].还有人建议用oligo(dT)-cellulose或用试剂盒纯化RNA,去掉非腺苷酸化的RNAs.使用poly(A)-mRNA可以避免含内含子序列的c DNAs的产生和克隆.如果材料足够,可用与RACE等量的RNA样品进行电泳、Northern印迹.用已知cDNA序列做探针检测,以证实目的序列存在且并未明显降解.但是,即使高质量的mRNA,在反转录过程中也会产生许多不完整的cDNAs.通常认为,这种切短的cDNAs的产生是由于反转录酶在有稳定的二级结构的mRNA区不能继续进行聚合反应所致[6]. GC AU比率高的转录本及含有稳定的二级结构区,更有可能产生切略了的cDNAs.在反转录过程中降低mRNAs二级结构稳定性的一个有效方法是在反应前提高反应混合物的温度(37~42 ).嗜常温的反转录酶(AMV-RT和MMLV-RT)只能在低于大约50 的温度下起作用.现已有热稳定的DNA聚合酶,可以在很高的温度下(60~70 )有活性.在此温度下,RNA的二级结构不稳定,反转录可以更容易进行到mRNA分子的5 -末端.在某些条件下,可以反转录mRNA的嗜热DNA聚合酶主要有rTth(PE公司)和TetZ(Amersham).甚至Taq酶也有表现出反转录酶活性的报道.虽然r Tth酶较嗜常温的反转录酶对二级结构不敏感[7],但也有不足.首先,r Tth主要是一个DNA 指导的DNA聚合酶,其最适温度在70 ,与嗜常温的反转录酶的操作温度相比,更有利于DNA的去稳定.因此,更有可能引发污染的基因组DNA发190 生 命 科 学 研 究 2003年生延伸.DNA的污染问题可以通过用RNase-free DNase进行预处理而很容易避免[8].其次,高于15 min的反转录反应,在最适聚合酶活性所要求的高温和二价阳离子(Mn2+)的存在下,由于RNA的快速水解,偏向于产生切略的cDNAs.部分降解的RNAs分子可以引发反转录,产生不完全的cDNAs.此种现象可能会导致rTth产生长于1kb的cDNA 的合成能力下降,因为长的延伸需要长的温育时间,而时间的延长又会增加模板降解(水解).因此,反转录的时间应控制在15min之内,需要反转录的区域应控制在最小长度.因此,在用RACE扩增、克隆5 -末端时,反转录应采用特异引物而不是oligo (dT),且此引物应尽可能定位在远离部分cDNA的5 -末端,以便保留足够的序列以设计两个PCR内引物和第3个检测特异PCR产物的Southern杂交区.另外,因为全长cDNA只有在酶分子和模板分子的比例为1或较高的情况下才能有效产生,在反转录反应中不应使用过量的RNA或cDNA引物.究竟多少量的RNA才会造成模板过剩,只能通过经验确定.有证据表明,对大多数方法中引物浓度可以在数个数量级内变化.2.2 TdT加尾和第二链cDNA的合成标准的RACE要求把第一链cDNA用TdT酶加上一个脱氧核糖核酸同聚尾[1,2,9].然后此同聚尾作为下步与锚多聚连接物杂交的底物.锚多聚连接物有一个3 -末端同聚物锚(N)15,可与cDNA的同聚尾互补,然后由锚(N)15引发第二链cDNA的合成.但此法也可能失败或促进无关产物的形成.为了使同聚加尾成功,反转录后自由的核苷酸和过剩的cDNA引物必须除去.如果自由的核苷酸未除去,它将被TdT加入到3 -末端cDNA尾中去,从而干扰互补同聚物尾与锚引物的杂交.如果不除去过剩的cDNA引物,其3 -末端将与c DNA末端竞争加尾,从而降低cDNA加尾的效率.加尾的cDNA 引物还可以与加尾的锚引物退火,与cDNA发生竞争,从而降低第二链cDNA合成的效率.这些小分子将会在下步用锚引物PCR反应中作为退火和延伸的底物,降低PCR的效率[10].为了去除过剩的自由核苷酸和引物,可采用分子排阻类方法如Centricon microc oncentrator(Amicon)[7].但更简便、更经济有效的方法是使用1 4体积的10mol L醋酸胺和3倍体积的100%的乙醇的两步沉淀法.5 -RACE加尾一个主要问题是所有的cDNAs,无论是不是全长,都被TdT加尾.一旦锚引物加到第二链合成中,这些切略了的cDNAs会在PCR中与全长产物竞争扩增[7].如果切略了的cDNA比全长cDNAs短得多的话,它们就可发生趋向性扩增[3],使得PCR反应不能积累足量的全长cDNA,因而不能检测到目的产物,降低这些切略了的cDNAs产生的唯一方法是优化反转录过程[7].另一个导致切略cDNAs产生的原因可能存在于第二链合成中.如果目标cDNA含有与anchor (N)15同聚尾互补的数个核苷酸构成的同聚物区,第二链合成就可从这个内部序列处引发,而不是从末端同聚区,从而会产生切略的第二链.Anchor(N)15的内部引发可以用许多方法克服.因为A T配对比G C配对的氢键要弱得多,使用A和T同聚物尾趋向于产生较少的内部引发[7,8].但是,对于富含AT的基因组中,anchor(N)15的内部引发率却较高[11].另一种降低非特异性的anchor (N)15引发的方法是在第二链合成中避免使用太多的引物或太低的杂交温度.2.3 加尾的其它替代方法上述加尾策略本身存在许多缺陷,有几个研究组独立地设计了RACE技术的改良方法以绕过cDNA的TdT介导的加尾.所有这些改良方法都使用RNA ligase以共价方式把寡核苷酸锚连在cDNA 的5 -末端[12~15]或直接连接在起始RNA群上[11,16,17].因此这些策略既可消除TdT加尾这一步,又可消除Anchor(N)15引发的第二链cDNA的合成.这样,Anchor(N)15的内部引发可能性就得以完全消除[15].在把Anchor直接连接在RNA上的方法中,从理论上讲,具有3 -末端anchor序列的任何切略cDNAs的产生都得以避免[11].有几个研究组发表了把DNA锚定寡核苷酸连接在cDNA上的方法[12~15].此种RACE变种通常称为锚连接PCR (Ligation-anchored PC R,LA-PCR)[12,13]或称单链cDNA末端的单链连接(Single-strand ligation to ss-cDNA ends,SLIC)[14,15].连接反应是通过T4RNA连接酶催化进行的,此酶具有连接单链脱氧核糖核酸和核糖核酸的能力[18].然后,使用特异的3 -末端引物和锚引物,连接了锚的cDNA可直接用于PCR 扩增,这与标准的RACE法相同.寡核苷酸锚在用于连接反应前,必须作两个修饰改变.首先,必须使其5 -末端磷酸化,才能使其成为T4RNA连接酶的底物[18].这可通过在合成寡核苷酸时或通过T4多核苷酸激酶和ATP的酶学方191第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良法而完成[12];其次,寡核苷酸锚的3 -末端必须封闭,以避免形成寡核苷酸锚的串联体.这一种修饰也可以在体外合成中通过用已封闭了的氨基核苷酸类似物作为最后的碱基或在寡核苷酸合成后,用TdT介导的方法在其3 -末端加上一个双脱氧核苷酸[14,15]而实现;另一个要求是,c DNA合成使用的寡核苷酸必须具有一个5 -末端羟基,这样cDNA分子的5 -末端才不会成为RNA连接酶的底物[12,14]. cDNA合成后,RNA模板可通过化学方法用NaOH 在高温下处理降解.碱处理把RNA水解为带5 -OH 和3 -P或2 -P的核糖核苷酸,RNA的转化产物不是T4RNA ligase的底物[13].通过上述步骤除去或钝化了连接反应的所有竞争性抑制剂后,连接酶的唯一底物就只有寡核苷酸锚和cDNA分子的3 -OH.然后,连接了锚的c DNA就可用特异的3 -末端引物和锚引物直接进行PC R扩增.尽管LA-PCR避免了在第二链合成中由于第一链cDNA分子的内部同聚物与Anchor(N)15的退火产生的切略cDNAs,但其它产生切略cDNAs的途径仍存在.严格地讲,cDNA合成中产生的任何不完整的第一链cDNAs都将作为T4RNA连接酶的底物,都有寡核苷酸锚连在其3 -末端,PCR仍然可以扩增这些切略了的cDNAs.相反,RNA连接酶介导的RACE(RLM-RACE)[11],也称反转录连接介导PCR(RLPCR),可以避免所有5 -末端切略的产生.在此法中,RNA寡核苷酸锚序列被连接到mRNA的5 -末端.然后,此锚修饰了的mRNA反转录产生第一链cDNA,后者用3 -末端特异引物和一个DNA锚引物进行PCR 扩增[11,16,17,19],因为只有完全延伸为全长的cDNA 才具有3 -末端锚序列,在PCR中切略了的cDNA 将不会被扩增.切略cDNAs产生的唯一途径是在PC R过程中DNA锚引物的非特异性内部退火所致.此类问题可以通过仔细设计引物和调节PCR 参数而避免.在制备用于RLM-RACE的mRNAs时, mRNA必须用酶学或化学方法处理[16,17,19,20],除去共价交联在所有mRNA转录本5 -末端上的7-MeGppp帽子结构.化学方法去帽采用 -消除法: RNA通过用高碘酸钠 SDS和甘油的顺序处理而被氧化.氧化了的mRNAs然后用环己酰胺处理以去除7-Me G帽子.去帽后留在5 -末端的焦磷酸基团用CIP处理除去后,再用T4多核苷酸激酶和ATP 重新加上一个磷酸基团,使其5 -末端成为T4多核苷酸激酶的底物(5 -末端焦磷酸不是T4RNA ligase 的底物)[18].化学去帽的主要缺点是,降解的RNAs 和非mRNAs都可被多核苷酸激酶磷酸化,产生连接反应不需要的底物[11],非mRNAs将竞争RNA 锚引物,这可能导致mRNAs连接效率的降低.但更有害的是可能降解的mRNAs,其5 -末端也连有锚引物,在反转录时,此切略了的mRNAs会产生具3 -末端锚的切略的cDNAs,后者会在PC R中扩增.酶学方法去帽步骤少,避免了化学去帽的不足[11].RNA样品首先用碱性磷酸酶处理,除去所有降解了的RNAs和不具帽的RNAs的5 -末端磷酸基团[16,19],通过热钝化或用酚-氯仿抽提,使碱性磷酸酶失活后[16],其中的mRNAs用烟酸焦磷酸酶(TAP)处理去帽,此酶水解mRNA帽的三磷酸桥上的磷酸苷键[20].这样,TAP处理后,在去帽的mRNAs上留下了一个5 -P,因此只有具帽的mRNA 的5 -末端才转化成T4RNA ligase的底物.切略了的mRNAs却留下了5 -OH,锚引物不能与之连接.这样,只有未降解的mRNAs模板的全长cDNAs延伸产物的3 -末端才有锚引物序列[16].RNA寡核苷酸锚引物既可化学合成[16],也可通过用带有适当启动子(T7、T3和SP6)的线性化质粒模板的体外转录而合成[11,17].在这两种方法中,合成后的RNA寡核苷酸都不需要对其5 -末端进行修饰,因为体外转录产物已经具有了一个5 -末端PPP基团,而化学合成产物有一个5 -OH,它们都不是RNA ligase的底物.因此避免了RNA寡核苷酸锚的串联体的形成.从理论上讲,RNA寡核苷酸锚引物的长度不限,只要有数个核苷酸保证PCR 反应的特异性就行.通常用30nt长,只是要控制其内部二级结构的形成和与mRANs群体中的部分互补序列的退火,因为它们会造成连接反应的效率降低.设计RNA锚引物也应遵循通常的PC R引物设计原则.一旦设计和合成了适合的RNA寡核苷酸锚引物后,就可通过T4RNA ligase将其连接到磷酸化的mRNAs上去.有人曾报道,在连接反应中添加PEG 8000至终浓度25%可以增强连接效率.为了阻止mRNAs的环化,可在去帽前在其3 -末端加pCp[16]或用高碘酸钠处理RNA以除去3 -OH[17].在使用RLM-RACE扩增、克隆转录本的3 -末端的过程中,把DNA或RNA寡核苷酸锚连接到mRNAs分子的3 -末端.尽管DNA寡核苷酸在RNA 连接反应中不是有效的受体,但却是良好的供192 生 命 科 学 研 究 2003年体[18],因此,可采用更易操作的DNA锚替代RNA 锚.如果用DNA锚,则可简单地用T4多核苷酸激酶磷酸化后,然后用T4RNA ligase将之连接在mRNA的3 -末端上.反转录是由另一与连接上的锚完全互补的DNA寡核苷酸引发的,PCR使用锚互补部分作为3 -末端引物和一个与已知cDNA序列互补的5 -末端引物[11,17].因为3 -末端锚是连接在mRNA的尾部的,在整个RACE产物中都保留了完整的mRNA尾.因此,除了能够明确确定克隆的转录本的完整3 -末端外,还可获得转录本3 -末端的有关生化信息.感兴趣的研究者可以根据各个克隆确定Poly(A)尾的长度及其长度的变化.同时还可确定特定转录本中是否具有经典的多腺苷酸化信号[11,17].2.4 PCR扩增关于PCR扩增技术及其参数的优化有很多的文献论述,本部分重点讨论某些简化和增强PCR 重复性的参数以及在PC R中遇到的问题的克服. 2.4.1 PCR的忠实性问题cDNAs的PCR扩增中的一个值得考虑的重要问题是聚合酶的忠实性.因为RACE技术是为确定未知cDNA序列设计的,必须注意使在PCR中引入的突变最少.现已有具3 5 校对核酸外切酶活性的商品嗜热聚合酶可供使用,如pfu(Stratagene)和Vent(Ne w England Biolabs)等.在这两种酶中,p fu的忠实性最高,每掺入一个核苷酸的突变率为1.6 10-6[21].据报道,Taq聚合酶的核苷酸误掺频率为2.5 10-5,比p fu高12倍左右[21].pfu酶还具有特别高的热稳定性,在95 ,60min仍有95%的活性[21].因此,可使用更高变性温度和变性时间的PC R循环而不会明显影响其聚合酶活性.Barnes报道[22],p fu和Klen Taq1(一种遗传修饰了的Taq聚合酶)以1:15混合,其忠实性几乎与pfu本身一样高,扩增时间比两酶单独使用要高得多.因此认为,反应混合物中的少量的pfu足以除去此Taq酶所添加的误配碱基,进而继续推断,PC R扩增通常只限于10kb以内的模板,因为Taq酶过早地终止了引物的延伸.因此,当大于10kb的分子作为PCR 模板时,此种误掺发生频率太高,理想的产物不能有效扩增.p fu聚合酶的校对活性的加入足以克服此种障碍.为了增加PCR反应的产率和特异性,已经设计了一些方法,先把不含模板[23]或模板和聚合酶或活性酶的其它PCR组分混合,只有当混合物预热到引物退火温度以上时,再加入这些组分.有人认为此种 热启动 (hot start)法能防止在室温装配试剂过程中事先变性的模板与引物发生非特异性退火,从而改善引物与模板相互作用的特异性[23]. Taq聚合酶延伸模板的速度较慢,室温下每分钟约15nt[21],因此,非特异性的引物与模板退火或引物与引物配对,在试剂装配和进一步的PCR扩增中都会延伸,从而产生高背景的非特异性产物[23].因为p fu在低温下的聚合酶和外切酶活性低得可以忽略[21],所有PC R的反应组分都可在冰上(或在处于4 的PCR仪)上装配,而不必担心非特异退火的引物或引物与模板被此酶的3 5 校对核酸外切酶活性的降解.由于pfu具有高耐热性,初始变性温度高达98 ,5min,而不会引起酶活性明显降低,尽管长的变性时间可导致PCR模板的损害.因此整个反应混合物都可在严谨的条件下变性,然后立即冷却到适宜温度,使引物退火和延伸.这样,模板的复性和非特异性引物的退火均达到最小化.2.4.2 引物的设计引物设计是另一个对PCR结果有重大影响的参数.PC R技术的使用者有许多经验规则,但却无实验证据[3].但还是有几个基本的规律和计算方法,能使研究者成功地设计出产生理想的PCR产物而无或低背景的引物.引物的正确设计与扩增分子的长度有某种依赖性,200~400bp的长度在PCR中扩增效率最高.许多设计算不上很好的引物,在此大小范围内仍能扩增出理想的产物[3].因理想的全长RACE产物的大小在PCR进行前大都未知,设计的引物应当尽可能符合许多优化参数.首先,应避免使用3 -末端有互补性的引物对,以防止引物二聚体的形成.即使3 -末端仅有几个互补碱基,仍可产生引物二聚体,因为Taq酶延伸引物速度快;同时,还应避免使用3 -末端有自我互补的引物,因此种引物将会以自己为模板而延伸.另外,所有PCR引物的3 -末端应设计为不稳定,以使从非目标部位引发降到最低.在目的位点杂交的稳定性是由引物的5 -末端和中部区域决定的,引物是连续延伸的.相反,如果引物与非目的位点序列有短的互补,不稳定的3 -末端在这个短暂杂合未结束前,不可能非特异性地退火和被延伸.Rychlick根据最近邻核苷酸分析创建了一个DNA双链形成的自由能值表,这些值可用于估算给定序列的DNA双链的稳定193第3期 李关荣等:cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良性.Rychlick建议一个特异引物的3 -末端的5个碱基的稳定性不能超过-9kcal mol,这就是说,3 -末端的5个碱基不能超过两个G或C.他还建议,对于小于500bp的位点的扩增,引物长度应保持较短(16~18nt),而长的位点(5kb)的扩增应用较长的引物(大约20nt).尽管这些原则在使用含有克隆接头引物时,难以达到,但与目的分子互补的引物区应控制在16~18nt范围内.引物的GC AT比率要尽可能接近模板的GC AT比率.虽然RACE目的位点的大多数碱基对组成未知,但其GC AT比率却可以通过已知cDNA序列或目的基因组的GC AT比率而估算.2.4.3 PCR参数PC R参数显著影响特定PCR扩增的成败,特别是目的位点的大小有数千个碱基时[22].变性循环必须有足够高的温度和足够的时间,才能至少使目的分子的小段成功变性.从理论上讲,要实现最佳的PCR效率,只有所有的目的分子在每个变性循环中都变性才可能.但是,特别值得考虑的是, DNA脱嘌呤的速度随温度的升高和pH的降低而升高.在PCR中,在25 ,pH8.3的Tris buffer,当温度达到94 以上时pH将降低(在95 时pH值将降到6.1).当遇到一个脱嘌呤点时,Taq酶就不能继续延伸引物[22].据Barnes计算,PCR扩增目标在kb级或更小范围内脱嘌呤发生明显.因此,变性次数(时间)应当控制在成功PC R的最小要求内.94 ,10s这样短的变性循环曾用于成功扩增20kb以上的目的片段,加入助溶剂如甘油、DMSO 改进了这些实验的产率,这可能是由于降低了解链温度的原因.Cheng等也指出,PCR反应中高温的危害性,可通过使用在变性循环中pH稳定的PCR buffer而减低[27].如果使用一个温度系数比Tris小的buffer(如Tricine,Bicine,EPPS),在变性中就可以采用较高的温度,脱嘌呤的发生就会降低.对一特定PCR引物对,有许多计算理想杂交温度的公式[24,25].据报道,理想的杂交温度的计算也要求采用模板核苷酸的最近邻分析[3].但是,他们认为,如果引物设计适当,使其3 -末端不稳定,引物退火的最适温度范围相当宽.Schaefer发现,即使是最简单的退火温度估算公式:[2 (A T)+4 (G C)]-5=T Hyb对大多数引物都很适用[26].在此公式中,引物退火温度通过赋予每个A或T2 和每个G或C4 来计算.然后杂交温度计为低于退火温度的5 [24].在可能的情况下,最好使用退火温度相当的引物对.Cheng等报道,当使用退火温度为68 的引物时,变性温度为94 、退火 延伸温度都为68 的双温热循环效果都很好[27].在扩增目的片段时,一般每个kb需要延伸1min,尽管对于数个kb的目的片段的扩增,可能要求更长的延伸时间.在目的片段大小不清的RACE扩增中,要求的最大延伸时间可以通过Northern杂交中mRNA 转录本的大小估算.2.4.4 增加特异性除非RAC E克隆的目的c DNA很丰富,一次PC R扩增,通常不能产生足以用于克隆的理想产物.在RACE中,产生的许多非目的cDNAs的5 -末端都有锚定引物序列,这与使用两个特异的引物的PC R相比,RACE-PCR扩增的效率要低些,因为有相当量的锚定引物消耗在与非目的cDNAs序列的退火和后来的延伸中.非目的单链cDNAs的积累,增加了特异3 -末端引物的非特异性退火和聚合酶延伸的可能性,从而产生可在以后的循环中竞争核苷酸、聚合酶分子和两个引物的底物.但是,第一次PCR产物可经过纯化除去残留的引物后,使用锚定引物和另一个与第一次PCR 产物的cDNA序列互补的特异3 -末端引物进行第二次PCR扩增[2,9,19].Frohman报道,如果两次PCR 扩增的循环总数达到60个的话,理想的RAC E产物就会在琼脂糖胶上,经溴乙锭染色表现出特异的带.另一种可以增强特异PCR产物的产率的方法称为亲和捕获(Affinity capture).此种方法有许多变化,但其基本方法涉及到使用特异交联在亲和基质上的一个标签寡核苷酸(Tagged oligo)来捕获理想的产物.如与目标cDNA序列互补的生物素化的oligo在溶液中与变性的cDNA杂交后,杂合体用Streptavidin亲和柱捕获,然后用适当条件洗脱除去非特异退火的杂合体.这样明显富积了的特异目的cDNA序列就从柱上洗脱下来,再用于PCR扩增. 2.4.5 RAC E产物的克隆一旦获得可以检测到的RACE产物,就必须进行纯化、回收和克隆.因为PCR产物在经酚 氯仿抽提和乙醇沉淀的回收过程中,有相当大的损失[28],最好使用专门的试剂盒回收.纯化的产物可用适当的限制酶切割,在低熔点琼脂糖胶上电泳,直接连接到测序载体中.虽然有RAC E产物直接用于测序的报道[9],但由于有替代的转录起始位点[11,16]和反转录酶合成的第一链cDNA的3 -末端有非模板指194 生 命 科 学 研 究 2003年。
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果 树 研 究 所 ，广 州 ５０ ０ １６ ） ４
摘
要 ：介 绍 一 种 改 良的扩 增 基 因 ５ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列 的方 法 （ 良 Ｔ Ｔ加 尾 扩 增法 ） 以龙 眼为 材 料 ，采 用 改 ｄ 。
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ＴＫＲ ａ ａ ａ试剂盒）对 比试验 ，发现该方法原理简单 ，操作性强 ；扩增特异性高 ，结果真实可靠 ；同时还具有
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分离 和克 隆基 因是研究 基因结 构 、功能 以及表 达 的基础 。 利用生 物 信息 学技 术 推测 的编码 基 因 ， 或通过酵 母双 杂交 （ ｅｓ ｔｏｈ ｂ ｄ 、抑制性 消减 杂交 （ Ｓ 、基 因芯片 （ ｅ ｃｉ ）技术 和 噬菌体 ｙａｔｗ —ｙ ｒ ） ｉ Ｓ Ｈ） ｇ ｎｈｐ 表面展示 （ ｈ ｇｄ ｐａ ） 等分 子生物学 技 术筛 选 得 到的序 列 一般 都 是部 分序 列 ，要想 进 一 步研 究这 ｐ ａｅ ｉ ｌｙ ｓ 些新基 因的生 物学功 能和 医学 意义 ，必须首 先获得 基 因的全长 序 列 （ 海 勃 和曹 建平 ，２ ０ ） 韩 ０ ５ 。虽然 很多用 于扩增 基因全 长的方法 已经 建立 ，如 反 向 Ｐ Ｒ、连 接介 导 Ｐ Ｒ等技 术 ，但 是 ，这些 方法 耗 时 Ｃ Ｃ 长 、费用 高 ，且 常 出现 Ｐ Ｒ扩增效 率低 、特 异性 差 等 问题 。 因而利 用这 些 方法 不 容易 得到 完 整 的全 Ｃ 长基 因 ，尤其 是基 因的 ５末 端 （ 唐慧 等 ，２ ０ ） ０ １ 。而 Ｆｏ ｍａ ｒｈ ｎ在 １８ ９ ５年首 次报 道 的 ｃ Ｎ 末端 快 速 ＤＡ 扩增技术 （ａ ｉ ａ ｐｉｃｔ ｎｏ Ｄ Ａ ｅｄ ，Ｒ Ｃ ｒｐｄ ｍ ｌ ａ ｏ ｆ Ｎ ｎ ｓ Ａ Ｅ）解 决 了这 些问题 。ｃ Ｎ ｉ ｆ ｉ ｃ Ｄ Ａ末 端快速 扩增 （ Ａ Ｅ） ＲＣ