细胞培养常见问题与分析

广东天然药物研究与开发重点实验室主要研究方向
1、抗肿瘤植物药作用机制研究及抗肿瘤新药的开发研究
（1）对半边旗有效成分抗肿瘤作用机制的研究获国家自然科学基金和广东省科技攻关计划项目的资助，对半边旗有效成分的提取工艺申报了1项国家发明专利，半边旗二萜类有效成分的医学用途获得了国家发明专利权。

该项研究成果可为申报国家新药提供依据
肿瘤对全球的危害不容置疑，癌症是我国民众的第二死因，控制癌症已成我国卫生战略的重点之一。

本研究方向在学科带头人梁念慈教授的主持下，从1990年起开始了从中药中筛选抗肿瘤药物的研究，经过多年的艰苦筛选工作，发现了植物药半边旗具有明显的抗癌活性。

后来，课题组按现代药理学的研究思路，开展了从半边旗中提取有效成分的研究和深入证明这些成分的药理作用机制的研究工作。

经过近10年的努力，该课题组已对植物药半边旗进行了一系列植化、药学、药理学、毒理学研究工作，分别鉴定和证明了半边旗中5F、6F和A组分（均为二萜类）为抗癌活性成份。

这些成分均是国际上首次从半边旗中
发现的有抗癌活性的二萜类化合物，据此我们1995年申请了国家发明专利—《半边旗提取物及其医药组合物》（中国专利号：95119380.5），于2002年4月获得了发明专利授权。

本重点实验室成立以来，在已有的基础上，重点探讨了半边旗全草的抗癌活性成份为5F和6F的抗癌作用机制，研究了活性成份5F的提取新工艺，5F的几种医用制剂，初步制定了其中2种制剂的质量标准。

目前本研究室正在对半边旗抗癌活性成份作药效学研究。

本研究方向获得的资助包括国家自然科学基金1项、广东省重点攻关项目1项、厅局级科研课题多项；已获得了国家有发明专利1项，2002年新申请了国家发明专利1项（二萜类有效成分的提取方法，申请号：02149680.3）；先后培养了6名硕士研究生。

本研究在对半边旗抗癌活性成份的分离、提取和鉴定和对半边旗的抗癌活性成份的抗癌作用机理研究方面具有明显的特色和优势，研究成果有明显的创新性和实用性，在同类抗癌中药研究领域具有优势。

本研究方向的主要目标是研制出具有我国特色的、拥有自主知识产权的中药抗癌新药。

目前，该研究方向正在以半边旗抗癌活性成分的系统药理学和毒理学为研究目标，计划把该成分开发为我国有独立自主知识产权的国家新药。

近年来，梁念慈教授的课题组还开展了抗肿瘤转移、抗侵袭药物的研究，筛选了多种黄酮类、萜类、蒽醌类物质，发现了不少重要苗头。

初步认定槲皮素、木犀草素、芹菜素、甘草甜素、斑蝥素、5F（半边旗成分）以及腺苷衍生物有显著的抗肿瘤转移作用和抗血管新生作用，并对它们的作用机理作了初步研究，为抗肿瘤转移、抗侵袭天然药物的开发提供了科学依据。

（2）开展了细胞凋亡机制与凋亡基因表达干扰的研究以及白藜芦醇、喜树碱等多种促进细胞凋亡药物的开发研究，在利用反义核酸和RNA干扰技术选择性封闭凋亡抑制基因bcl-xL，诱导鼻咽癌细胞凋亡从而实现鼻咽癌的基因治疗的研究方面积累了大量的实验数据，获得了大量有关鼻咽癌分子水平的资料，为鼻咽癌的防治提供了科学依据
鼻咽癌是华南地区特有的疾病，据统计，这些地区的发病率为世界其他地区的十倍以上。

该研究方向在学术带头人周克元教授的主持下，对华南地区地方疾病鼻咽癌的酶学改变、DNA含量、基因变化等分子生物学特征进行了系统的研究，重组了促进细胞凋亡的基因，并以之转染鼻咽癌细胞，观察对细胞凋亡的影响。

该项研究从细胞凋亡的机理及影响因素入手，进行了bcl-xS促进细胞凋亡的观察，将bcl-xS基因重组后，转染细胞，以观察对细胞凋亡的促进作用；用反义寡核苷酸封闭bcl-xL基因，观察bcl-xL基因对细胞凋亡的影响；探讨Caspase相互激活、调控等途径，以了解Caspase调控细胞凋亡的具体过程；已对白藜芦醇、喜树碱等多种促进细胞凋亡的药物进行了探讨，以寻找新的促进细胞凋亡的药物。

该方向的研究成果“鼻咽癌的分子生物学研究”和“细胞凋亡机理及其影响因素的研究”分别获2000年度和2003年度湛江市科技进步奖一等奖。

2、抗骨质疏松中药作用机制及中药新药的开发研究
抗骨质疏松中药新药研究取得重要进展，获得广东省科技计划重点攻关项目和省自然科学基金的资助，新申报4项国家发明专利，共获得3项国家发明专利权，有3个中药Ⅲ类新药和1个Ⅱ类新药在研制中，居国内中药抗骨质疏松研究领域的先进水平。

随着世界人口的老化，患骨质疏松症的人群在逐年增多，据统计，我国目前65岁以上的老年人已占1.2亿，而患有骨质疏松症的患者在这些人群中约占90%，在未来的10年内世界范围内的髋骨骨折人数将达到600万人，而髋骨骨折的病人在1年内将有12％～40％死于各种合并症。

因此，防治骨质疏松是抗衰老，延长寿命，保证人民的生活质量的一个十分迫切的研究课题。

目前，国内外至今仍未找到理想的防治骨质疏松的药物。

由于长期以来中医中药防治骨质疏松症的研究缺乏严格的实验和作用机理探讨，国外很多专家对中医中药防治骨质疏松症仍不十分了解。

本研究方向在学科带头人崔燎教授的主持下，从1991年起在国内首先建立了以骨组织形态计量学为手段对抗骨质疏松药物进行研究的实验方法，参照了国际上用大白鼠去卵巢建立动物骨质疏松模型的研究思路，先后建立了大白鼠去卵巢、去睾丸、类固醇、羟基脲和环磷酰胺骨
质疏松模型，研究用中药防治骨质疏松的药理作用及其作用机制，探讨从具有抗骨质疏松的中药中提取有效成分进行再研究。

该课题组还建立了骨细胞培养方法，筛选对成骨细胞具有活性作用的中药有效成分，先后发现了中药蛇床子、淫羊藿、人参、丹参、何首乌、甘草等的抗骨质疏松活性成分，希望能找到一种具有抗骨质疏松活性的中药有效成分，并把这一成分开发成中药新药。

在此基础上，我们选取了其中一些成分作了动物抗骨质疏松模型研究，用骨组织形态计量学的方法进行药理学观察。

已发现了两个很有开发前景的抗骨质疏松中药活性成分。

本课题组还根据骨质疏松发病机制的最新研究结果，从骨髓脂肪细胞调控入手探讨骨质疏松的发病机制和防治措施，以骨髓基质细胞成骨与成脂转化为靶点，从有抗衰老作用的中药中提取有效成分，寻找能作用于骨髓基质细胞，使该细胞向成骨细胞转化，不向成脂细胞转化，从根本上防止骨质疏松的发生。

通过多年的努力，发现了丹参的水溶性部分有效部位群有促进骨髓基质细胞向成骨细胞转化，抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞转化的作用。

据此，开展了丹参水溶性有效部位群对糖皮质激素所致大鼠骨质疏松的防治实验，结果表明，以丹参水溶性有效部位群为主的“丹参骨宝”对糖皮质激素所致大鼠骨质疏松模型有明显的预防作用，对去卵巢大鼠骨质疏松模型也有预防作用，体外实验表明丹参素（丹参水溶性有效成分）抑制由糖皮质激素所致骨髓基质细胞脂蛋白酯酶mRNA表达的升高，并增加成骨诱导I型胶原mRNA和骨保护素mRNA的表达，对骨髓腔骨髓细胞计量学研究进一步证明了骨髓内的脂肪细胞明显减少，而丹参的醇提部位群或纯丹参酮片剂的效果比丹参水溶性有效部位群的要差。

“丹参骨宝”用于皮质类固醇性骨质疏松、原发性骨质疏松症的防治。

该新药与目前市场开发用于骨质疏松症的中药新药具有明显优点：1）根据中药有效成分药效学结果来组方，属现代中药类，组方简单，非祖传组方；2）作用机制明确，即促进成骨细胞骨形成，抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞转化，尤其可抑制皮质类固醇诱导的骨髓脂肪细胞转化；骨形态计量学显示“丹参骨宝”明显增加各种骨质疏松动物模型的骨量，尤其明显对抗皮质类固醇诱导的骨量丢失；3）副作用极低，长期作用还对脑、心血管系统有保护作用。

我们申请了国家发明专利（申请号：2003101162819;发明名称：由丹参水提物或丹参素制备防治骨质疏松新药）。

为了阐明丹参有效部位群的抗骨质疏松药理作用，探讨丹参有效部位群的最佳工艺，研制丹参有效部位群的药物剂型，把其开发成一种新型的抗骨质疏松药物，本研究拟按国家《药品注册管理办法》规定的中药、天然药物分类及申报资料2类新药（未在国内上市销售的从中药、天然药物中提取的有效部位群及其制剂）的要求，完成有关的研究工作。

该研究方向获得省自然基金、省重点科技攻关项目及湛江市科研经费共约100万元，发表论文100余篇，获厅局级及市级科技进步奖4项，获国家发明专利权3项。

培养出9名骨药理学方向的硕士生，另有10名在读。

3、生物活性药物的开发研究方面
在利用发酵工程技术筛选植物广谱抗炎药物的研究方面取得了进展。

李延平教授带领的课题组，利用复合植物药发酵工程技术制得了疗效高、毒副作用小的新药。

现已根据临床疗效筛选出了发酵植物药的种类、确定了比例；探索了培养基、发酵时间、温度、湿度、搅拌次数、通气量等发酵工艺参数。

药效学试验表明，该药对被动型Heymann肾炎大鼠有治疗作用，可显著降低血清肌酐、尿素氮、甘油三脂、总胆固醇含量，对金黄色葡萄球菌、链球菌及白色念球菌均有抑菌作用；急性毒性试验表明该药临床应用安全可靠。

该项目得到省教育厅科研基金的资助，现已初步建立了质量标准，筛选出的处方已申请国家专利（申请号：200410026970.5）。