细胞培养中的黑胶虫问题
黑胶虫作业
在细胞培养中常可见到一些大小不等、形态不同的黑色颗粒在细胞及培养液中做不规则运动。
镜下检查颗粒数目（100×），每视野计数在10个以上者就有可能使细胞生长受到影响。
若培养过程中，其数量继续增多则可能导致细胞停止增殖继而死亡。
人们常称这种颗粒为黑胶虫或中毒颗粒。
近年来，黑胶虫在现代细胞培养中被广泛讨论，但大多数文献未对其进行描述或仅一带而过。
从各个实验中发现，黑胶虫在不同条件或不同种类细胞的培养时对细胞培养的影响大小不一，但存在以下几个特点：（1）黑胶虫与细胞竞争生长，使细胞状态恶化甚至死亡，但不引起培养液浑浊；（2）多数情况下，抗生素对黑胶虫无效；（3）一般单用培养液及血清培养不会得到黑胶虫；（4）黑胶虫在培养体系中多做典型的布朗运动。
科学家们至今尚未对黑胶虫进行分类学上的归类，但对其身份有多种猜测。
一．非生物有部分科学家认为，任何一种外来生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单的运动。
如果黑胶虫的运动状况已达到用显微镜可观察到的程度，其营养代谢和能量需求也可想而知，那么，培养液中营养的消耗将加大、酸碱含量都将发生明显变化。
比如出现迅速、大含量的沉淀，pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡，引发其他微生物侵染等。
但这些状况在黑胶虫感染中很难观察到。
因此，有科学家提出黑胶虫为非生物。
（1）细胞碎片说在从37℃环境中取出细胞进行观察时，由于液体培养基比热大，液内环境高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，即出现观察到的“虫体”游动。
同时随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂。
破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。
尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和更多的残渣，即表现为“虫体”增多，同时细胞状态恶化甚至死亡。
（2）无机物说在1990年发表于细胞生物学杂志上的《对细胞培养中一种黑色运动颗粒性质的研究》中，青岛医学院肿瘤研究室指出，细胞培养中的黑色运动颗粒为硅复合物。
黑胶虫污染
细胞培养中的黑胶虫污染及解决方案点击次数：2365 发布时间：2011-4-2细胞培养中的黑胶虫污染摘要：预防和避免污染是细胞培养成功的关键，黑胶虫(也称黑焦虫)是近几年来几乎出现在每个细胞培养实验室。
但是现在无法对黑胶虫的确认和鉴别，导致学术界说法不一，笔者收集了关于黑胶虫的资料，对黑胶虫进行类系统描述，对黑胶虫出现的情况对细胞培养的影响以及黑胶虫污染后的有效处理进行介绍。
关键词：黑胶虫污染处理细胞培养The pollution of black dots in cell culture(Grade 2005, Biotechnology, School of Life Science and Engineering)Abstract Pollution prevention is the key to success in cell culture, black dots (also called black particles) almost appeared in every cell culture laboratory in past few years .But now no one able to confirm and identify what the black dots is. This lead to appear different academic arguments.The author collected information about the black dots to make a description about black spots which similar to the systemic description,and Introduce when aand where the black dots come out. At the same time give some advice to deal with the black dots.Key words Pollution black dots cell culture前言污染是细胞培养的大敌。
13(1).细胞培养中出现小颗粒的原因1
细胞培养的过程中，经常见到黑色的颗粒或小黑点，已成为很多细胞培养初学者的困扰，这种情况是怎么引起的呢？该如何避免呢？产生原因：1.细胞状态：细胞自身具有分泌功能，或细胞营养不良，生长状态欠佳，细胞老化都有可能在培养过程中出现小黑点。
2.血清沉淀：通常经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多。
有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖。
一般而言，此小黑点应不会影响细胞的生长，但若经过平行试验怀疑此血清的品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
3：黑胶虫污染黑胶虫概况：在细胞培养的时候,有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动,小黑点有时呈点状,有时呈小的片状,运动形式为在原地振动（类似布朗运动）,这种小黑点既不是细菌、霉菌,也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过,没有菌落出现）,目前业内人士称其为“黑胶虫”.黑胶虫到底是否为生物?这个一直是业内人士的疑惑.黑胶虫一般是存在血清里的,而血清通常是经过0.1μm 滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物.如果说黑胶虫不是生物,它会不断增多,达到一定数量时会与细胞竞争性生长,与细胞竞争培养基中的营养,从而使得细胞营养不足而死亡.不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：①与细胞竞争性生长,对细胞生长有不利影响.②“黑胶虫”会增殖,增殖多时,视野下一大片都为“黑胶虫”.③“黑胶虫”与血清有关,与血清质量有一定关系.4：支原体污染：如果细胞表面出现许多小黑点，细胞生长缓慢，培养液很黄，那么支原体污染的可能性就很大。
5：细胞受各种霉菌、细菌等生物污染。
此种原因大多为环境原因造成。
解决办法：1.如果小黑点有增殖趋势，那么就有可能是污染了，需要处理；如果确定是支原体解决办法很多：a 抗生素(antibiotic)除菌法：用抗生素抑制支原体。
细胞培养中常见污染
最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞污染及处理方法
（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）
若细胞状态极差，尽早处理掉细胞，并找出污染源，对培养箱，生物安全柜，细胞房进行消毒处理。
2、真菌污染
培养基：有的培养液清亮，不变色；
成像：
处理方法：
在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。这个拯救细胞还是主要针对无路可退的时候。污染还是重在预防！！！！！
细胞房
培养箱每两周更换一次水（高压过的双蒸水），条件允许的每两周可以用酒精擦洗一遍培养箱；
地面每两到三天用新洁尔灭拖洗一遍，桌面等同样用新洁尔灭擦洗一遍；
细胞污染及处理方法总结
洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。
霉菌污染多来自空气,所以做实验时说话聊天,或瓶口敞开时间太长,还有培养箱开关频繁是主要原因,还是多找自身原因.
4、支原体污染
支原体污染后，不会立即使细胞死亡，可以与细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑Байду номын сангаас细胞生长等。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞培养污染图片及甲醛熏蒸
4.将容器放入空调送风口，快速倒入全量的甲醛溶液，关上空调机组门；
5.启动空调，关闭新风口，循环运行1－2小时，（视甲醛的反应速度）； 6.关闭空调，取出容器，空调及房间密闭8小时以上； 7.生产前4小时，打开空调，关闭回风阀进行空调全排风运行，直至空 调无甲醛气味后，空调按常规操作运行。（除甲醛时，可在空调送风口加 入适量的氨水，以快速中和残留甲醛） 操作中注意事项：甲醛加入高锰酸钾中，会迅速产生高温至溶液沸腾， 因此容器应大并应做好防护工作，以免混合的棕红色溶液溅出而污染机组。
培养液中可见一类黑色 小虫，生长迅速，镜下
快速运动，单个不成串
支原体污染
阳性
阴性
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变 慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变 化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
疑似黑胶虫？霉菌污染
甲醛高锰酸钾熏蒸灭菌
高锰酸钾具有强氧化性，但和福尔马林常温下反应较
用量计算： 细胞房空间=35m3 甲醛用量=10ml×35=350ml=0.35L 高锰酸钾用量=350/2=175g 温水用量=175ml
慢，但是反应放热，反应加快促进甲醛的挥发,产生甲醛 气体，甲醛能使菌体蛋白质变性凝固和溶解菌体类脂，可 以杀灭物体表面和空气中的细菌繁殖体、芽胞下真菌和病 毒,所以经一定时间后可杀死病原微生物.
甲醛加高锰酸钾熏蒸操作法：
1.准备、计算、称取甲醛与高锰酸钾量：10ml甲醛溶液中加入高锰酸钾
3－5g；
细胞培养污染图片
2010.12.6
中间长梭形是正在分裂的念珠菌
细胞污染及处理方法
细胞污染及处理方法总结洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。
尽量减少进入培养体系细菌的数量。
所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！一、细菌污染培养基：颜色发红，液体清亮或浑浊；显微镜下：有黑点或杆状物在到处游走，细胞部分脱落，出现细胞碎片；成像：图一：杆菌污染图二：白色链球菌以下是摘自丁香园的处理方法：1）.将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。
转烧瓶口。
2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。
3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。
4）.重复步骤3再洗。
5）.重复步骤3再洗。
6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min 离心，然后洗一次。
置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗.11）.24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。
（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）若细胞状态极差，尽早处理掉细胞，并找出污染源，对培养箱，生物安全柜，细胞房进行消毒处理。
黑胶虫
黑胶虫1、黑胶虫概况：在细胞培养的时候，有时会在400倍显微镜下看到小黑点在动，小黑点有时呈点状，有时呈小的片状，运动形式为在原地振动（类似布朗运动），这种小黑点既不是细菌、霉菌，也不是支原体（我们曾经请周守长用血平板培养过，没有菌落出现），目前业内人士称其为“黑胶虫”。
黑胶虫到底是否为生物？这个一直是业内人士的疑惑。
黑胶虫一般是存在血清里的，而血清通常是经过0.1μm滤膜过滤的,所以血清里不可能存在细菌、霉菌及支原体等微生物。
如果说黑胶虫不是生物，它会不断增多，达到一定数量时会与细胞竞争性生长，与细胞竞争培养基中的营养，从而使得细胞营养不足而死亡。
不管对于黑胶虫的争论如何,但有几个是目前大家公认的：①与细胞竞争性生长，对细胞生长有不利影响。
②“黑胶虫”会增殖，增殖多时，视野下一大片都为“黑胶虫”。
③“黑胶虫”与血清有关，与血清质量有很大关系。
2、目前对“黑胶虫”的定论：有2种解释：第一，黑胶虫为生物。
它是小于细菌的生物，直径小于0.1μm，大多国外血清中多见，可能是国外牛血清中含有的某种原虫。
只要它是生物，那么在培养基中一定会对细胞有影响。
第二，黑胶虫不是生物。
国内的血清中，通常灭活之后都会有絮状沉淀出现，而黑胶虫出现时，所使用的血清被反复冻融过多次。
所以推测，所谓的“黑胶虫”其实就是血清中的某些蛋白成分的物质，经过灭活之后丧失活性，在培养基中，镜检见到的运动其实是这些物质在溶液中做“布朗运动”。
随着细胞消耗培养基，这些物质越来越多，最后细胞所用的营养消耗完，细胞容易死亡。
3、对于“黑胶虫”的处理方法：首先，血清买回来灭活前冻融应逐级冻融，即按照-20℃——4℃完全融化后，再置入水浴中，与室温一起升高到56度，这样的目的是避免温度骤变，导致血清中的营养物质丧失活性。
第二，血清灭活后分装保存。
按照每次用血清的量分装，尽量减少血清冻融的次数。
分装时注意无菌。
第三，细胞培养时血清浓度稍大一些。
通常细胞培养血清浓度为10%-15%，但如果血清冻融次数过多，那营养物质丧失活性，按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分，故培养基配置时一般用18%-20%的血清。
细胞培养中的黑胶虫问题
细胞培养中的黑胶虫问题1.我们实验室最近一次的情况:我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。
可以发现如下的特点：（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；（2）对抗生素无效；（3）可能通过培养箱空气进行污染；（4）单用培养液及血清培养没发现问题。
（5）换掖冲洗后也无效。
以下是论坛里我找来的相关帖子内容“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。
所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。
该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题关于是什么的问题的讨论A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
细胞培养中“黑胶虫”污染的检测及防治
6、建立有效的监控机制：对细胞培养过程进行实时监控，特别是在培养液 更换、细胞传代等关键环节上要格外留意。通过定期检查和记录细胞生长情况、 生化指标等数据，及时发现并处理潜在的黑胶虫污染问题。
7、采用新技术手段：随着科技的发展，一些新的技术手段如基因测序、生 物信息学分析等也可用于检测和防治黑胶虫污染。通过这些技术手段的应用，可 以更早地发现污染源、追踪污染途径并制定有效的防控措施。
4、建立应急预案：实验室应建立针对黑胶虫污染的应急预案，以便在发生 污染时能够迅速采取有效的措施进行处理，最大程度地减少损失。
5、加强学术交流与培训：通过参加学术会议、研讨会等活动，了解和学习 最新的研究成果和方法，提高对黑胶虫污染的认识和应对能力。同时，对实验室 工作人员进行定期的培训和教育，提高他们的专业素养和操作技能。
5、使用适当的消毒剂：在细胞培养过程中，可以使用适当的消毒剂对实验 器材和环境进行消毒处理。常用的消毒剂有75%酒精、紫外线、甲醛等。在使用 消毒剂时，要严格按照使用说明进行操作，避免对细胞造成不良影响。
参考内容三
引言
随着人类文明的不断发展，塑料制品的使用日益普遍，由此引发的白色污染 问题也越来越严重。本次演示将探讨白色污染的污染现状及防治对策，旨在引起 人们对白色污染问题的，共同呵护环境。
参考内容
一、常用的细胞培养方法
细胞培养是一种广泛应用于生物学、医学和生物技术领域的技术。细胞培养 是指将活细胞种植在适宜的基质中，通过提供适宜的营养和环境条件，使细胞在 体外繁殖和生长。常用的细胞培养方法包括悬浮培养和贴壁培养。
1、悬浮培养：悬浮培养是将细胞悬浮在培养液中，通过搅拌或振荡使细胞 均匀分布，并保持悬浮状态。这种方法适用于大多数类型的细胞，包括一些难以 贴壁的细胞。
黑胶虫污染细胞的表现
黑胶虫污染细胞的表现
黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还是可以用的。
污染现象：常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
处理办法：数量不多的时候对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。
使用“黑胶虫”清除培养基3天之后即可见清除效果，连续使用12到14天即可将“黑胶虫”清除，若“黑胶虫”污染较为严重，可延长处理3到5天。
杀灭和抑制组织培养中“黑胶虫”的特殊培养基的制备和使用方法[
专利名称：杀灭和抑制组织培养中“黑胶虫”的特殊培养基的制备和使用方法
专利类型：发明专利
发明人：田海梅,张伟
申请号：CN200510085462.9
申请日：20050721
公开号：CN1900266A
公开日：
20070124
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明首次公开了一种特殊培养基的制备和使用方法。
它在通用组织培养基的基础上，添加腐胺、转铁蛋白、胸腺嘧啶、脲嘧啶、庆大霉素、四环素、罗氏芬、阿米卡星、两性霉素B、制霉菌素、脱氧胆酸钠等物质，经0.22μm过滤除菌制得此特殊培养基。
该培养基对细胞污染物“黑胶虫”具有杀灭和抑制作用。
该特殊培养基的使用可以挽救被污染细胞，使科学研究得以顺利进行，节约大量的人力并降低成本。
申请人：张伟,田海梅
地址：100021 北京市朝阳区潘家园南里17号生物学检测中心
国籍：CN
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培养细胞出现很多小黑点是怎么回事？怎么处理？
霉菌、细菌、酵母菌、杂菌......这些菌菌过来串门的时候，是不是感到瑟瑟发抖......养细胞就是一件耗时耗力的事情。
最常见的，就是一不小心，会慢慢发现细胞出现了一些不知何物的小黑点，各位师弟，且听师姐来分析分析：这些讨厌的小黑点到底是什么呢?有可能是：1.细胞碎片细胞生长状态不好，吹打过多或者多次吹打导致碎片，加大血清浓度，降低离心速度养两代试试。
碎片一般会离心出去。
这就是细胞碎片2.黑胶虫黑胶虫污染，黑胶虫一般小而且密。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡。
3.支原体污染支原体污染不易发现，很多细胞即使支原体污染，在没有出现猛烈爆发时细胞形态也不会有明显的变化，因此支原体污染经常被人们所忽视。
但是支原体污染对细胞的伤害比人们想象的要大得多，会直接对您的实验结果产生影响，包括以下几个方面：①严重降低细胞的基因转导效率：无论是病毒载体还是脂质体介导的基因转导，细胞都会因为支原体的污染而导致效率低下。
②严重影响细胞的功能表型：支原体严重影响细胞的分化方向，扰乱细胞的增殖、活力与代谢水平，造成实验中极其不稳定的细胞表型结果。
那么出现这些情况之后细胞怎么“挽救”呢?好物推荐——Procell 支原体清除培养基支原体清除培养基是Procell在市面上已有的支原体清除培养基基础上开发的新一代产品，含有清除“支原体”的特殊成分(一种混合制剂，可通过抑制DNA 和支原体生长所必须的相关蛋白合成来取得良好的支原体清除效果，最大程度上挽救珍贵的细胞，减少因支原体污染带来的损失)。
本产品经过了数十种细胞的测试和长期的实验验证，对细胞无害，对清除“支原体”污染效果显著，能够很好的抑制和杀灭“支原体”。
细胞养不好？这些技巧快收好
细胞养不好？这些技巧快收好在我们实验中，养细胞是所有实验的基础，肿瘤细胞培养过程中，总会遇到这样那样的麻烦，以下几种情况，你是否遇到，如何解决，大师兄给你指明一二三。
如何判断细胞污染了？状态1：细胞培养液变浑浊了，经常见到是米汤样，黄色液体，一般认为细菌污染。
状态 2：细胞培养基内含有能动的小黑点，一般认为是黑胶虫。
状态3：胞培养基清亮，但是能看到飘在培养液带有毛毛的白色的菌状物质，有可能就是真菌感染。
策略：细胞污染了就直接扔了，还得把培养箱用酒精棉球擦干净，并用紫外照射半小时，防止再次污染。
同时建议细胞培养时，在培养基中加入青链霉素 (尤其是初学者)细胞培养过程中，细胞周围包括细胞上有很多小黑点，怎么办?策略1：用胰酶消化下来后，低速短时间离心，不同实验室不一样，如果平时是 1 000 转 5 min 的话，就可以改为 700 转 3 min，用新的培养瓶培养细胞，细胞收集是少一点，但是一般都能干净很多。
多传几代就好多了。
策略2：如果多次尝试之后还是不干净，就怀疑是否存在支原体污染了，用抗支原体药就 OK 了。
一般用上 3～5 天，细胞就干干净净了。
细胞培养过程中，发现贴壁细胞表面沾了很多死细胞，传代过程中一直存在怎么破？有一招屡试不爽，那就是用PBS 洗两遍之后，加胰酶进去，晃一晃，迅速将胰酶倒出，再用PBS 洗一下，再加胰酶正常消化。
死细胞由于粘附能力很弱，第一次加胰酶进去以后会掉下来，第二次加胰酶下来的细胞才是活性比较强的细胞。
整完一次之后，再次传代方法同上，一般 2～3 次之后，细胞就完好如初了。
细胞胞质疏松，状态不好，养不起来，怎么办?策略1：一般情况下，从血清下手就行，要么换好血清，要么提高血清浓度，血清浓度提高到 15%～20% 培养 48 h，换成正常 10% 的浓度，用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性。
策略2：血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法，从培养瓶换到六孔板，12 孔板等，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。
黑胶虫污染
黑胶虫污染
“黑胶虫”主要为支原体污染，部分为未知的增殖不明显的细菌污染。
“黑胶虫”污染常见表现：
1、培养液不浑浊，但在低倍镜下，“黑胶虫”呈黑色颗粒状或片状；在高倍镜下，黑色颗粒在原地进行“布朗运动”，并且“黑胶虫”与细胞数量呈负相关，且随着细培养时间的延长“小黑点”逐渐增多，更换培养液或洗涤细胞不能将其去除；
2、“小黑点”污染的细胞，营养消耗快，需要频繁更换培养液；
3、“黑胶虫”污染的细胞生长缓慢，细胞状态差，空泡化严重，甚至还可能导致细胞形态的改变。
处理方法：
若细胞状态尚可，添加黑胶虫/支原体抑制剂培养2-3代即可转阴；若细胞状态很差，建议消杀后丢弃。
关于细胞培养中的污染
【整理总结】关于细胞培养中的污染有关细胞技术的热门话题——细胞培养中的污染细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
污染是细胞培养的大敌 细胞培养基本技术
污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。
他们在细胞培养中污染的特点如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。
常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。
对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。
4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。
他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。
这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
6、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
普诺赛黑胶虫清除剂说明书
普诺赛黑胶虫清除剂说明书产品概述“黑胶虫”及其分解复合物是一种常见的细胞污染物，与细胞共生，随细胞传代而传代，通常抗生素对其无效。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长，对细胞生长不利，严重时导致细胞死亡。
目前很多细胞存在被“黑胶虫”污染的现象，对细胞培养及其后续实验造成了极大地影响。
“黑胶虫”污染的细胞常见的特征有以下几点：（1）培养液不浑浊，但在显微镜下观察细胞时，细胞周围和培养液中有很多“小黑点”，且随着细培养时间的延长“小黑点”逐渐增多，更换培养液或洗涤细胞不能将其去除；（2）“小黑点”污染的细胞，营养消耗快，需要频繁更换培养液；（3）“黑胶虫”污染的细胞生长缓慢，细胞状态差，空泡化严重，甚至还可能导致细胞形态的改变。
“黑胶虫”清除培养基是本公司在Biomocin产品的基础上开发的新一代产品，含有清除“黑胶虫”的特殊成分。
本产品经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证，对细胞无害，对清除“黑胶虫”污染效果显著，能够很好的杀灭和抑制“黑胶虫”。
产品信息产品使用方法1、根据所培养细胞的特性，将“黑胶虫”清除基础培养基配制成相应的完全培养基。
2、将50～100万个细胞铺到60 mm的细胞培养皿内，加入4 ml“黑胶虫”清除完全培养基孵育细胞，（也可以与细胞正常培养方法相同，直接将“黑胶虫”清除完全培养加入到培养器皿中孵育细胞）。
3、次日更换新鲜的“黑胶虫”清除完全培养基，并更换新的培养器皿；之后每2～3天更换1次培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1～2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化）。
4、使用“黑胶虫”清除培养基3天之后即可见清除效果，连续使用12～14天即可将“黑胶虫”清除，若“黑胶虫”污染较为严重，可延长处理3～5天。
5、因环境中可能依然存在污染源，为避免细胞再次受到“黑胶虫”的污染，建议您在“黑胶虫”清除以后继续使用“黑胶虫”清除培养基，以达到预防的效果。
细胞中常见的污染
一、常见的污染如下：1. 细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理。
2. 霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作。
3. 支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma 公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
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细胞培养中的黑胶虫问题
1.我们实验室最近一次的情况:
我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。
可以发现如下的特点：
（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；
（2）对抗生素无效；
（3）可能通过培养箱空气进行污染；
（4）单用培养液及血清培养没发现问题。
（5）换掖冲洗后也无效。
以下是论坛里我找来的相关帖子内容
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。
“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。
所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。
该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题
关于是什么的问题的讨论
A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）
B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法
C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
D. 有人说是纳米级的细菌
其他的特点
（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，
（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。
（3）细胞内好像也有存在，
（4）但并不引起培养液混浊
（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡
大家的处理：
1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。
2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。
若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。
加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。
3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。
5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。
6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。
杀灭黑胶虫的一种方法
估计养细胞者，很多人遇到过所谓的“黑胶虫”。
最近养细胞，不幸的是，也中奖了，看到培养瓶里仿佛一夜之间冒出来的密密麻麻的小黑东西，真是有苦难言，因为曾在园子里看过有关“黑胶虫”的帖子，不好对付，没有有效的杀灭方法，据说有专杀培养基，但又有什么好的方法可以消除实验室和培养箱内的污染呢？紫外照射、甲醛高锰酸钾熏蒸------这些方法不知其对“黑胶虫”的确切效果，有些对人有毒害，有没有一种方法，即能杀死“黑胶虫”，对人的毒性又较小呢？我想到了试试新洁尔灭（苯扎溴铵）是否可以，新洁尔灭是外用皮肤消毒剂，我们实验室常规用来擦洗手及工作台面的。
首先说明这种东西在低倍下呈黑色点状，在高倍下呈杆状，确实是在不停地运动的，有些战友不相信它会动，也有人不相信有这种所谓的“黑胶虫”，只要静下心来仔细盯住一点，你就会能注意到它确实在运动，我也录了一段相，足以可以证明，太大，160多M。
题目：杀灭、处理黑胶虫的一种新方法
目的：找到一种高效且低或无毒的杀灭处理“黑胶虫”的方法。
方法：取有“黑胶虫”污染的六孔板，每孔内有2ml培养液，向有污染的孔内分别加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新洁尔灭原液，边加边在倒置显微镜下观察。
结果：加入新洁尔灭时，培养液内逐渐变得有些混浊，且会有絮状的东西形成（肉眼看是白色的），这实际上是由“黑胶虫”聚集而成（见下面的图），约2-3分钟后，“黑胶虫”慢慢停止了运动。
为了进一步观察其效果，把六孔板放入37度培养箱继续培养，第二天观察发现：有些仍成团絮状但不会动；有些贴在瓶壁上也不会动；有些已由杆状变成了圆球状，象是发生了水肿一样，更不会动了，估计“黑胶虫”已死亡。
这几种剂量的新洁尔灭效果是一样的。
结论：新洁尔灭与水或培养基的比例为1：4时即可杀死“黑胶虫”（更低的浓度没有试，当时杀虫心切，就想多用点，反正也不贵，一瓶新洁尔灭才7块多钱）。
可以喷洒或擦洗用于实验室或培养箱内消毒；若细胞不珍贵且不想要了，也可以用来杀灭其中的“黑胶虫”。
若细胞珍贵，不要轻易尝试，除非你不想要了；你试了，本人概不负责。