细胞培养中的黑胶虫问题

细胞培养中的黑胶虫问题

1.我们实验室最近一次的情况:

我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。

同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。

后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。

可以发现如下的特点：

（1）与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；

（2）对抗生素无效；

（3）可能通过培养箱空气进行污染；

（4）单用培养液及血清培养没发现问题。

（5）换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容

“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。

目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题

关于是什么的问题的讨论

A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）

B. 据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法

C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。

D. 有人说是纳米级的细菌

其他的特点

（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，

（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。

（3）细胞内好像也有存在，

（4）但并不引起培养液混浊

（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡

大家的处理：

1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。

2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。

3.换用进口的一次性塑料培养瓶。

4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。

5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。

6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。

杀灭黑胶虫的一种方法

估计养细胞者，很多人遇到过所谓的“黑胶虫”。最近养细胞，不幸的是，也中奖了，看到培养瓶里仿佛一夜之间冒出来的密密麻麻的小黑东西，真是有苦难言，因为曾在园子里看过有关“黑胶虫”的帖子，不好对付，没有有效的杀灭方法，据说有专杀培养基，但又有什么好的方法可以消除实验室和培养箱内的污染呢？紫外照射、甲醛高锰酸钾熏蒸------这些方法不知其对“黑胶虫”的确切效果，有些对人有毒害，有没有一种方法，即能杀死“黑胶虫”，对人的毒性又较小呢？我想到了试试新洁尔灭（苯扎溴铵）是否可以，新洁尔灭是外用皮肤消毒剂，我们实验室常规用来擦洗手及工作台面的。

首先说明这种东西在低倍下呈黑色点状，在高倍下呈杆状，确实是在不停地运动的，有些战友不相信它会动，也有人不相信有这种所谓的“黑胶虫”，只要静下心来仔细盯住一点，你就会能注意到它确实在运动，我也录了一段相，足以可以证明，太大，160多M。

题目：杀灭、处理黑胶虫的一种新方法

目的：找到一种高效且低或无毒的杀灭处理“黑胶虫”的方法。

方法：取有“黑胶虫”污染的六孔板，每孔内有2ml培养液，向有污染的孔内分别加入0.5ml、1ml、2ml、3ml的新洁尔灭原液，边加边在倒置显微镜下观察。

结果：加入新洁尔灭时，培养液内逐渐变得有些混浊，且会有絮状的东西形成（肉眼看是白色的），这实际上是由“黑胶虫”聚集而成（见下面的图），约2-3分钟后，“黑胶虫”慢慢停止了运动。为了进一步观察其效果，把六孔板放入37度培养箱继续培养，第二天观察发现：有些仍成团絮状但不会动；有些贴在瓶壁上也不会动；有些已由杆状变成了圆球状，象是发生了水肿一样，更不会动了，估计“黑胶虫”已死亡。这几种剂量的新洁尔灭效果是一样的。

结论：新洁尔灭与水或培养基的比例为1：4时即可杀死“黑胶虫”（更低的浓度没有试，当时杀虫心切，就想多用点，反正也不贵，一瓶新洁尔灭才7块多钱）。可以喷洒或擦洗用于实验室或培养箱内消毒；若细胞不珍贵且不想要了，也可以用来杀灭其中的“黑胶虫”。若细胞珍贵，不要轻易尝试，除非你不想要了；你试了，本人概不负责