网上培养caco-2经验总结

上海细胞生物所。还有我们实验室也有，不知道卖不卖。如果需要和我e-mail联系：****************

求助：有谁培养过HepG2细胞和 Caco-2 细胞吗？

细胞, 培养, 求助细胞, 培养, 求助

欢迎您访问。提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

本人第一次养细胞，目标细胞是HepG2细胞和 Caco-2 细胞，现在在查文献，可是有不少东西都不懂，如我在网上找到的Caco-2 细胞的培养基是MEM,20%胎牛血清和NEAA，这个？没有量啊，到时怎么配呢？请养过这两种细胞的前辈指点经验啊！我在此多多感谢了！ [ 本帖最后由 liushen 于 08-6-16 22:13 编辑 ]

超级版主3#

发表于 08-6-18 16:19 | 只看该作者

MEM，胎牛血清，非必需氨基酸

欢迎您访问。提示：游客只能阅读部份内容，请注册或者登录后继续浏览全部信息，谢谢！

MEM是一种细胞培养液，你可以去公司网站去查，有卖的。有现成的MEM液体，也有MEM干粉，可以自己去配制。 20%胎牛血清，就是在MEM液体里面加入胎牛血清至终浓度为20%。 NEAA是非必需氨基酸吧。我们用的是Gibco公司的产品，买来的时候是10倍浓度的，用的时候10倍稀释到培养液中即可。

我有養過用DMEM+ FBS10% 含PS 0.05% 然後用trypsin 0.25% 去做subculture 就可以了!很好養!

Caco-2细胞培养的一点重要经验

这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述,又不懂的可留言问）,对生长的空间问题要求比较高。

在每一次传代消化的时候,要消化足够长的时间,要不停地在镜下观察细胞的消化状态。这个细胞长的比较厚,所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点,常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施,我一般是这样做的：

首先吸干净原培养基,加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗,快速润洗完细胞生长面后吸走,然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml）,进行充分的消化,保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中,大部分细胞边缘皱缩变清晰后,用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基,常规离心5分钟左右,离心完毕倾倒上清,加入新鲜培养基吹打均匀,然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打,细胞吹下来之后,适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传

代,原瓶加入新培养基继续培养。

很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离心后培养,这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞,Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。

caco-2细胞培养遇到的麻烦。。。

最近从上海细胞库引进一株caco-2（ATCC新引入，大概十代左右吧），在培养中遇到了不小的麻烦，所以来园子里问问各位达人。

简述一下我的操作吧：收到细胞以后，在孵箱里搁了一夜。第二天，换液（自配的培养基：DMEM 20％Gibco NCS 0.1mM EME），同时留一份自带的培养基；一天后，消化，吸去培液后，加PBS洗一遍（居然给冲下来一块细胞...很诡异），去PBS后再加入0.25％Trypsin 3ml，室温放置5min，镜下观察细胞仍粘连；去除大部分Trypsin后，放入孵箱，10min...20min...后，仍有相当数量的细胞紧密连接；加培养终止后，发现大部分细胞冲不下来；再进行第二次消化10min，总算能冲下细胞，且基本为单个。传了两盘，一份加自配的培液，另一份加随细胞自带的培液。一天后，观察：细胞贴壁的不多，且细胞碎片较多，换液处理（干净多了，呵呵）；两天后，观察：原来贴壁的细胞也死了不少，可能有密度依赖吧，稀了长不起来.......很头痛！

说明几点情况：

1.这次是火车运送（奥运的原因...），路上耽搁了三天吧；

2.0.25％Trypsin自配，用于消化其它的细胞，都没有问题；

3.没有染菌的迹象，呵呵...

高手们，给点意见吧，谢过先！

消化时间也太长了吧，可以试试消化一段时间后弃去培养基，然后拍打瓶子底部，看看细胞是否脱落，要不就买带EDTA的胰酶试试，消化时间太长，对细胞损伤很大

可用细胞刮子来刮，细胞消化太久不好的。不过caco-2算是比较好养的，消化个30min也不见得死，因为长的太结实了，细胞有融合，一定要消化成单个没什么意义。置于pbs冲洗脱落是很正常的，长成地毯状的细胞是容易被成片冲洗下来的，所以，培养基，pbs要预热，顺边缘加入，然后晃晃培养板。动作要轻。

还有一点，有点担心，你的血清浓度是不是太高了。我曾经用FBS10%（gibco），没问题，后来省钱，用了20%NBS，国产，就出现了很多网页上说的黑胶虫，麻烦的要死，细胞虽然状态不差，但是我还是全扔掉了，所以，建议你降低血清浓度，最好用胎牛。

感谢frankcai大牛的指教！

细胞刮，没用过，感觉太“粗暴”了吧.....^_^，好使么?

至于想消成单细胞，主要是觉得让一团细胞粘在一起，不利贴壁，可能会卦掉吧？

试剂预热，我一般只是让它平衡到室温而已，偷懒～呵呵

至于血清，我主要是参考了园子里的评论＋细胞库网页＋ATCC，可能20％保险一点吧，刚引进的细胞嘛...

谁都知道Gibco的FCS好，可是所有细胞都用的话，负担不起咯

主要是，我觉得控制不好消化的分寸，郁闷。。。

前段时间我在养Caco，也是中科院买的，Caco不太好培养。

要用胰酶-EDTA（要预热）消化的，25ml培养瓶加新鲜配置的消化液0.8ml，培养箱37度放2分钟。有时候这个细胞是不太好消化，细胞养了几代之后稳定了，应该还是比较好消化的。

Caco贴壁比较慢，所以一定要去除胰酶-EDTA，要用一次性培养瓶。高糖DMEM培养基添加10%血清（FBS、NBS无所谓）。

一两天内细胞贴壁形态不明显，两天之后才能看到细胞贴壁成块状，之后1-2天细胞生长迅速，4天差不多可以传代。

祝好运!

楼上的为什么要用一次性培养瓶啊，我们养的发现玻璃瓶比一次性的一直都长的好些，虽然细胞普遍长的不好~

谢谢summityoung！

摸索摸索咯～

我养的时候觉得Caco细胞用玻璃瓶养养，贴壁不好。

丁香园：ATCC建议用MEM+20%FBS，细胞长得也不快，1：4传代需要5-7天才可以传下一代。但是，细胞会出现很多分泌物，看上比较脏，形态不好看。如果你使用Gibco血清时，可以用逐渐降到10％FBS，一则省血清，二则减少细胞分泌物。国产血清就别省了吧。

国内的Caco-2细胞被驯化过了，可以在10％FBS的条件下长得不错。如果你是从中科院购买细胞，你可要注意了，尤其是使用进口的好血清时，一定要用10％FBS养，千万别用20％FBS，否则细胞会疯长。