基于水稻内含子长度多态性开发禾本科扩增共有序列遗传标记
论水稻全基因组测序技术在育种中的应用研究
论水稻全基因组测序技术在育种中的应用研究第一章：引言水稻是世界上最重要的粮食作物之一，它的全基因组测序技术的应用研究有助于深入了解水稻的遗传基础和提高水稻的产量、品质等方面的育种。
第二章：水稻全基因组测序技术的发展在2002年，水稻的第一个基因组测序项目启动了，这个项目的目标是寻找全基因组序列的大多数部分。
之后，随着技术的不断进步，全基因组测序技术得到了广泛应用。
目前，水稻的全基因组测序技术已经进入了第三代测序时代。
第三章：水稻全基因组测序技术在育种中的应用3.1 遗传多样性的研究全基因组测序技术可以比较全面地揭示水稻中的遗传变异，这对于研究种质资源的多样性以及保护和利用这些资源具有重要意义。
例如，对水稻大豆囊性线虫病的研究表明，全基因组测序技术可以帮助研究人员准确地识别相关基因，从而寻找到水稻的抗性，这对于育种具有重要意义。
3.2 基因功能研究在水稻全基因组测序技术的帮助下，研究人员可以深入研究不同基因的功能，进而研究不同基因对水稻产量、品质等方面的影响。
这些研究可以有助于选育更有利的水稻品种。
3.3 基因图谱构建水稻全基因组测序技术可以产生可靠的基因图谱，为水稻的基因组学研究提供强有力的支持。
例如，在2010年，中国科学家们利用全基因组测序技术建立了水稻的高密度遗传图谱，这对于研究水稻的复杂遗传特性有很大的帮助，也为育种提供了有力支持。
3.4 规模化选择育种水稻全基因组测序技术可以帮助研究人员了解水稻的遗传基础，在此基础上，可以进行基因标记辅助选择和精细定位来实现预选优良基因型。
这在规模化的选择育种中特别有效，可以大大提高水稻的育种效率。
第四章：水稻全基因组测序技术在未来的应用展望水稻全基因组测序技术的发展势头强劲，随着新技术的不断涌现，它的应用前景也将变得更加广阔。
例如，随着单细胞测序和纳米孔测序等新技术的应用，可以预见，水稻全基因组测序技术的精度和速度将得到进一步提高，从而可以更好地适应不同的育种需求。
水稻基因组和遗传育种的研究进展
水稻基因组和遗传育种的研究进展水稻，作为世界上最为重要的粮食作物之一，一直以来都受到人们的重视。
为了提高水稻的产量和质量，科学家们不断探索水稻的基因组和遗传育种，取得了许多研究进展。
第一部分：水稻基因组的研究进展1.1高质量水稻基因组测序和注释2002年，国际水稻基因组组织(IRGSP)启动了水稻基因组测序工作，历时十年，于2012年公布了高质量水稻基因组序列。
该项目不仅提供了水稻基因组的底图，也为全球的水稻研究工作提供了重要的资源。
除了基因组测序，对基因组的注释也至关重要。
2018年，中国、日本、美国等国的科学家们联合发表了一篇名为“HostPathogen”(Waxman)，通过整合多种表达组学数据，对水稻基因组的注释进行了更新，共发现了14614个新的基因，有效地促进了水稻基因组研究的深入。
1.2水稻基因组结构和功能特点的研究水稻基因组大小为389Mb，包含大约4.29万个基因。
其中，基因密度比拟其他植物要大，基因的组织分布也呈现出显著的区分。
此外，水稻的基因序列中还含有许多支配了基因表达和基因功能的调控因子，如调控元件、非编码RNA等。
这些结构和特点的研究有助于更深层次的解析水稻的遗传机制。
第二部分：水稻遗传育种的研究进展2.1利用基因编辑技术改良水稻水稻主要遗传特征的研究为利用基因编辑技术改良水稻提供了核心思路。
近年来，科学家们通过CRISPR-Cas9等基因编辑技术，针对水稻各个方面的遗传特征进行了深入的研究。
其中具有代表性的成果有：（1）使水稻茎粗略化的“SNU-16”基因的敲除，使其茎干更粗壮，抗风能力更强；（2）针对水稻的“脱粒非白化”基因进行靶向基因编辑，在保持其他基因不变的情况下，成功实现了水稻产量的提升。
2.2水稻病虫害抗性的研究水稻的病虫害是影响水稻丰产的主要因素之一。
研究表明，水稻的病虫害抗性主要由多个基因共同作用而得。
因此，为了实现水稻病虫害抗性的提升，科学家们也探寻了许多新的遗传调控方法。
InDel标记的研究和应用进展
生物多样性 2016, 24 (2): 237–243 doi: 10.17520/biods.2015205 Biodiversity Science http: //・综述・InDel标记的研究和应用进展杨洁赫佳王丹碧施恩杨文宇耿其芳王中生*(南京大学生命科学学院, 南京 210023)摘要: InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion-deletion), 是同源序列比对产生空位(gap)的现象。
InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。
InDel 多态性分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记, 其本质仍属于长度多态性标记, 可利用便捷的电泳平台进行分型。
InDel标记准确性高、稳定性好, 避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。
此外, InDel标记能扩增混合DNA样品和高度降解的微量DNA样品, 并进行有效分型。
InDel标记目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。
随着位于功能基因上InDel 标记的开发, 结合染色体步移和基因精细定位, 可将这些标记应用于相关物种经济性状的功能基因的筛选, 有利于优良基因的进一步开发和利用。
关键词:分子标记; InDel; SNP; SSRProgress in research and application of InDel markersJie Yang, Jia He, Danbi Wang, En Shi, Wenyu Yang, Qifang Geng, Zhongsheng Wang*School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210023Abstract: InDel indicates insertions or deletions (insertion-deletion) of nucleotide fragments of different siz-es at the same site in the genome sequence between the same or closely related species and is a gap in se-quence derived from alignment of the homologous sequence. InDel is widely distributed across the genome and occurs in a high density and large numbers in a genome. The InDel polymorphic molecular marker is a PCR-amplified marker that is based on specific primers designed from both sides of the site of sequence of insertion / deletion. It is essentially a length polymorphic marker still, and one can use the convenient elec-trophoresis platform for genotyping. InDel molecular markers have the advantage of high accuracy and good stability, which help to avoid confusion in subsequent analysis due to marker specificity and complexity, as is often seen in other length polymorphic markers. Furthermore, mixed or highly degraded DNA samples can be successfully amplified with InDel markers, and effectively typed. Because of its abundance, convenient typing platform and other advantages, InDel molecular markers have been applied to genetic analyses of an-imal and plant populations, molecular assisted crops and farmed animal breeding, human forensic genetics, medical diagnostics and other research areas. The development of the InDel molecular marker located on functional genes, combined with chromosome walking and fine gene mapping, has enabled the application of these molecular markers in the screening of genes related to important economic traits, which is conducive to the further development and utilization of these valuable genes. In this review, on the basis of an overview of the InDel marker development and applications, we discuss some of the technical limitations of the develop-ment and limited efficiency of genetic analysis, as well as potential future applications in the fine mapping and genetic structure of large numbers of individuals.Key words: molecular marker; InDel; SNP; SSR插入/缺失(insertion-deletion, InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序——————————————————收稿日期: 2015-07-15; 接受日期: 2015-12-17基金项目: 国家自然科学基金(31100270)∗通讯作者Author for correspondence. E-mail: wangzs@238 生物多样性 Biodiversity Science第24卷列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失, 即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al, 2002)。
基于PCR扩增技术的水稻优质染色体鉴定及应用研究
基于PCR扩增技术的水稻优质染色体鉴定及应用研究随着人们对高质量生活的追求，优质农产品也成为了人们越来越关注的话题。
而水稻作为我国的重要粮食作物，其品质的高低也直接关系到我国的粮食安全。
然而，在实际生产中，水稻优质染色体的鉴定仍然是一个相对困难的问题。
本文将介绍一种基于PCR扩增技术的水稻优质染色体鉴定方法及其应用研究。
1. PCR扩增技术简介PCR全称为聚合酶链反应，是一种基于DNA聚合酶的体外DNA扩增技术。
PCR扩增技术的发明者Kary Mullis在1983年首次提出了该技术，他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR扩增技术是一种高灵敏、高特异和高效率的DNA扩增技术，已经广泛应用于生物学研究、医学诊断、法医学和基因工程等领域。
2. PCR扩增技术在水稻优质染色体鉴定中的应用PCR扩增技术已经成为一种有效的鉴定水稻优质染色体的方法。
通过对水稻栽培品种的遗传分析和核型分析，人们已经确定了许多与水稻优质染色体相关的DNA标记。
其中，GBSSR（Genotyping-by-sequencing derived SSR markers）是一种快速、经济和高效的基因标记技术，可以在很短的时间内鉴定水稻的优质染色体。
3. 水稻优质染色体鉴定的PCR扩增方法（1）提取样本DNA首先，需要提取水稻样本的基因组DNA。
可以使用各种不同的提取方法，如CTAB法、SDS法和膨胀法等。
（2）PCR扩增操作PCR扩增操作一般包括以下步骤：1.将所需试剂加入PCR反应管中，包括模板DNA、引物（primers）、酶和反应缓冲液等；2.将反应管放在热循环仪中，进行不同的温度处理，包括变性、退火和延伸等；3.重复以上步骤多次，通常可进行20-40个循环，每个循环的时间一般为30秒到2分钟不等；4.最后，将PCR产物分离并进行电泳分析，以确定DNA扩增是否成功。
（3）结果分析PCR扩增反应成功后，可以对扩增产物进行分析，以鉴定与水稻优质染色体相关的DNA标记。
水稻转录因子与长穗性状相关基因的克隆及功能鉴定
水稻转录因子与长穗性状相关基因的克隆及功能鉴定水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的经济作物之一，其是许多人口众多的亚洲国家的主要粮食作物。
长穗性状在水稻生长发育中起着重要作用，这是因为长穗可以使水稻生产更多的籽粒，进而提高水稻的产量。
因此，对于长穗性状的研究具有重要的理论意义和应用前景。
本文主要阐述了水稻中与长穗性状相关基因的克隆及功能鉴定。
一、水稻转录因子与长穗性状在水稻中，转录因子（Transcription factor，简称 TF）在调控基因表达方面起着重要作用。
这些因子可以诱导或抑制基因的转录，从而控制诸如生长发育、代谢、胁迫响应等生命过程。
在过去的十几年中，基于水稻基因组数据和遗传学实验研究，已克隆了一系列与水稻长穗有关的转录因子，如OsMADS22、OsMADS55、OsMADS50、OsMADS56、OsMADS61、OsMADS57等。
这些转录因子编码的蛋白在不同的生长阶段和组织中有不同的表达模式，并参与了水稻的长穗发育。
二、长穗性状相关基因的克隆和表达谱分析随着生物技术的不断发展，逐渐出现了一些新的高效实验手段，如全基因组测序、基因芯片技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术等，这些技术不仅可以检测全局基因组的表达谱，更可以破译单个基因与性状相联系的物质、细胞和生理过程。
通过蛋白质组学、转录组学和代谢组学的手段，研究人员揭示了长穗性状调控中的关键基因以及相关的代谢途径和基因网络。
例如，Wang 等人 [1] 通过转录组学手段分析了长穗水稻品种和短穗水稻品种的基因表达谱，发现了一批与长穗发育相关的基因，这些基因中包括了一些编码转录因子、激素合成酶、代谢相关酶、信号传递器和RNA修饰因子等。
这些基因与长穗性状的形成和发育密切相关。
三、克隆和功能鉴定OsMADS22OsMADS22编码的TF在水稻的生长发育中起着重要作用，特别是在长穗的形成和发育过程中扮演着有重要的角色 [2]。
基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展
基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展作者：李萌姜恭好段海燕来源：《南方农业·上旬》2021年第12期摘要基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术或过程。
总结了近年基因编辑技术在提升水稻育种速度和效率、实现水稻的生长发育调节、载体构建和突变体创制、水稻抗病目标改变、水稻品质提升等遗传改良方面的应用进展。
简要介绍了一代ZFNs基因编辑技术、二代TALENs基因编辑技术和三代CRISPR/Cas9基因编辑技术，重点介绍了CRISPR/Cas9的工作原理、优缺点、类型和相关技术。
最后对基因编辑技术在水稻遗传改良方面的发展方向进行了展望。
关键词基因编辑;CRISPR/Cas9;水稻;遗传改良;应用进展中图分类号：Q789 文献标志码：A DOI：10.19415/ki.1673-890x.2021.34.002基因编辑，又称基因组编辑或基因组工程，是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术或过程。
基因编辑技术通过插入和敲除基因、定点突变和碱基替换等对基因组靶位点进行一系列的人工修饰，以获得新的功能或表型，甚至创造新的物种，在基因研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力，尤其是在植物遗传改良和新品种培育方面应用十分广泛。
1 基因编辑技术在水稻遗传改良中的应用进展1.1 提升水稻育种速度和效率近年将基于CRISPR/Cas9系统的基因组定点编辑技术不断应用于水稻，用来深入研究水稻基因功能和精准培育水稻品种，而传统基因组编辑技术只可对水稻基因片段随机删除或插入，精准插入效率不高。
Yuming Lu等用硫代修饰和磷酸化修饰供体片段，成功提升敲入靶向的效率，对约1 400株植株进行编辑，成功效率平均值为25%，高者可达47%;此方法还能够在4个位点进行靶向敲入，改进该方法得到重复片段介导的同源重组方法，能够精准有效融合原位标签蛋白并实现片段的替换，该效率约为11%[1]。
水稻全基因组R基因鉴定及候选RGA标记开发
论文第50卷第11期 2005年6月水稻全基因组R基因鉴定及候选RGA标记开发汪旭升①吴为人①②*金谷雷②朱军①(①浙江大学农业与生物技术学院生物信息学研究所, 杭州 310029; ②福建农林大学作物科学学院, 福州 350002.*联系人, E-mail: wuwr@)摘要用45个已知功能的植物抗病(R)基因序列对粳稻全基因组序列进行搜索, 共找出2119个R基因同源序列或类似物(RGA), 表明RGA在水稻基因组中成簇存在, 呈非随机分布. 采用隐马尔柯夫模型(HMM), 将这些RGA按其功能域分成了21类. 将粳稻的RGA与籼稻的基因组序列进行比较, 共找到702个两亚种间等位的RGA, 并发现其中有671个(占95.6%)RGA的基因组序列(包括编码区和非编码区)在两亚种间存在长度差异(InDel), 表明水稻RGA在两亚种间存在很高的多态性. 通过在InDel两侧设计引物并进行e-PCR验证, 共开发出402个基于PCR的、表现为共显性的候选RGA标记. 这些候选标记在两亚种间的长度差异在1~742 bp之间, 平均为10.26 bp. 有关数据均可从我们的网站(/RGAs/index.html)上获得.关键词水稻抗病基因RGA多态性分子标记植物抗病(R)基因是决定寄主植物对病原菌专化性识别并激发抗病反应的基因, 与病原菌的无毒基因互补. 经典遗传学认为, 植物与病原菌间相互作用的遗传机制是“基因对基因”, 并提出了配体-受体模型来解释这一学说[1,2]. 自1992年以来, 利用图位克隆和转座子标签法, 已经在水稻、拟南芥、玉米、烟草、亚麻等植物中克隆了40多个R基因[3]. 研究发现, 这些R基因存在一些共同的结构. 根据其蛋白结构及在细胞中的位置, R基因大致可分为5类[4,5]: (ⅰ) NBS-LRR, 是含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的胞内受体蛋白基因, 包括2个亚类: (1) TIR-NBS-LRR, 以拟南芥的RPP5基因、烟草的N基因及亚麻的L6和M基因为代表; (2) CC-NBS-LRR, 以拟南芥的RPS2和RPM1基因、番茄的I2基因及大麦的Mla1基因为代表. (ⅱ) 细胞间的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶(PK)基因, 包括番茄的Pto基因和大麦的Rpg1基因. (ⅲ) LRR-TM, 是N端存在一个胞外LRR, C端具有由疏水氨基酸组成的跨膜区的受体蛋白基因, 包括番茄抗叶霉病的基因Cf-2, Cf-4, Cf-5和Cf-9等. (ⅳ) PK-LRR-TM, 除含有LRR-TM结构外, 还具有PK结构, 包括水稻的Xa-21基因和拟南芥的FLS2基因. (ⅴ) SA-CC, 包括拟南芥的RPW8.2和RPW8.1基因. 此外, 还有玉米的Hm1及Hsl Pro-1和Asc等其他结构域的R基因.R基因是一个庞大的基因家族. 尽管已经克隆了40多个R基因, 但对R基因的了解还非常有限. 目前, 对拟南芥和水稻的基因组测序工作皆已基本完成. 水稻籼、粳2个亚种的基因组草图已经完成[6,7], 而且粳稻的1号、4号和10号3条染色体已经发布了精细图[8~10]. 这些成果为在整个基因组水平上研究R基因提供了契机. 利用拟南芥基因组的测序结果, Meyers等人[11]分析了NBS-LRR型R基因在拟南芥基因组中的分布. 对水稻基因组序列的初步分析显示, 水稻基因组中存在大量的R基因[6~7], 且往往成簇存在[12~14]. Monosi等人[15]发现在水稻中存在近500个NBS-LRR的基因, 但没有发现TIR的基因. Chelkowski等人[16]和Koczyk等人[17]利用18个已知的R基因分别对拟南芥和粳稻基因组序列进行分析, 发现拟南芥和水稻分别存在549和1744个R基因, 其中水稻的R基因中有597个属于NBS-LRR类型. 可以看出, 目前这些基于基因组序列的研究主要都集中在对NBS-LRR型R基因的分析上.分子标记是现代遗传学研究的有力工具. 自1980年首次提出分子标记的概念以来[18], 分子标记已广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、基因克隆、基因组比较、遗传多样性分析、标记辅助育种等领域的研究[19~21]. 利用R基因类似物(RGA)作探针, 可以检测相应座位上的限制性片段长度多态性(RFLP), 从而开发成为RFLP标记, 常称为RGA标记. 由于RGA本身可能就是潜在的R基因, 而且R基因常常成簇分布于基因组中, 因此RGA标记对于R基因的克隆和标记辅助选择可能具有特别的应用价值. 但是, 由于RGA标记是基于RFLP分析技术的, 操作上比较麻烦, 因此目前应用得并不多.第50卷第11期 2005年6月论文本研究利用已公布的籼稻和粳稻的基因组序列, 采用生物信息学的方法, 通过收集目前所有已知的R 基因序列, 对水稻基因组中RGA的数目、分布和类型进行了更为详尽的分析, 以期在全基因组水平上加深对水稻R基因的了解. 同时, 对RGA在水稻2个亚种间进行了遗传多态性(SNP和InDel)比较、引物设计和e-PCR验证, 为开发方便实用的基于PCR 技术的新型RGA标记奠定基础.1材料与方法(ⅰ) 基因组及蛋白质序列的来源. 从TIGR网站(/)和北京基因组学研究所网站(/)分别下载粳稻(Nipponbare)和籼稻(93-11)的基因组及蛋白质序列, 它们的更新时间皆为2004年4月. 所有数据的处理和分析皆在IBM P650的服务器上完成, 使用IBM AIX的Unix 操作系统.(ⅱ) 水稻RGA的搜索. 搜集已报道的45个R 基因, 然后用它们对粳稻蛋白质数据库进行BLASTP[22]搜索(参数E<+10−10, 最小长度为该基因的80%), 获得所有粳稻的RGA序列. 去除粳稻数据库中存在的克隆重复, 建立一个粳稻RGA蛋白数据库. 同时, 根据每个BLASTP搜索中匹配最好的结果, 得到这些粳稻RGA的核苷酸序列. 为了进一步验证得到的RGA, 我们进行候选RGA序列与TIGR发布的CDS序列进行比较, 去除不符的序列.(ⅲ) 水稻RGA的结构分类及其在染色体上的分布. 利用Hmmer程序[23]中的hmmsearch部分, 采用前面建立的功能域列表, 在新建立的数据库中搜索基因序列所包含的功能域. 利用pepcoil程序[24]分析序列中CC结构的可能性, 数值大于90%的认为具备该结构. 运用TM-HMMer[25]分析TM跨膜功能域. 依据功能域分布的情况, 对RGA进行分类, 分别统计各类RGA在不同染色体上的分布情况.(ⅳ) 2个亚种间RGA多态性的鉴定和开发. 将所有粳稻的RGA序列分别与籼稻基因组数据库进行TBLASTN[22]联配, 以确定籼稻中对应的等位基因. 为消除非等位联配, 在TBLASTN搜索中采用了严格的判别标准, 将E值设为1×10−20. 对初筛到的籼、粳稻RGA等位基因, 进一步用sim4程序[26]进行联配分析, 去除匹配率≤85%且2条序列同时间断200 bp以上的结果. 接着运用diffseq程序[27]分析SNP和InDel在RGA的基因组序列中的分布情况, 将存在InDel的作为候选的RGA标记. 以粳稻的基因组序列为模板, 在InDel位置的两侧各取100 bp的序列, 连接成一条200 bp长的模板序列, 然后利用ePrimer3程序1)在模板序列上设计引物. ePrimer3程序一般给出5对候选引物, 我们选取其中设计最合适的一对, 并要求正、反向引物分别位于InDel的左、右侧, 且扩增出的目标片段长度不大于1000 bp. 最后, 通过电子PCR(e- PCR)[28]进行验证. 对得到的水稻RGA标记进行命名,规则为以OSR开头, 后跟4个数字, 例如: OSR0255.上述步骤主要通过编写perl脚本程序来实现.2结果与分析2.1粳稻中RGA的数目、密度及其在染色体上的分布通过对粳稻蛋白质数据库的搜索, 共获得2119个RGA(表1). 它们在各染色体上的数量变化在113(3号染色体)~333个(1号染色体)之间, 平均为176个,以1, 2, 11号染色体最多. 单条染色体上RGA的平均密度变化在0.66~2.42或2.68~9.44 个/Mb之间. 无论是遗传图密度还是物理图密度, 都是以11号染色体最多, 3号染色体最少. 根据TIGR发布的拼接好的水稻基因组序列, 分析RGA在染色体上的分布情况,发现大部分RGA都以成簇形式存在(多数情况下每簇包含2~12个RGA), 如在1号染色体的AP003209克隆上发现有10个RGA.表1 粳稻中RGA在各染色体上的数量和密度染色体长度 RGA平均密度染色体/cM /MbRGA数目/cM−1 /Mb−12 157.9 39.9217 1.37 5.443 166.4 41.1110 0.66 2.684 129.6 38.2195 1.50 5.105 122.3 33.2134 1.09 4.046 126.3 31.7190 1.50 5.997 118.6 35.0125 1.05 3.578 121.2 27.6158 1.30 5.729 93.5 21.6133 1.42 6.1610 83.8 25.7113 1.35 4.4011 117.9 30.2285 2.42 9.4412 109.5 30.6126 1.15 4.12全基因组1528.8399.12119 1.395.31 2.2水稻RGA的结构分类通常将R基因分为5大类, 其中NBS-LRR是最1) /论 文第50卷 第11期 2005年6月多的一类[4,5]. 我们根据R 基因的结构与功能域, 将水稻RGA 进行了更细致的分类, 共分为21类(图1). 其中PK 类RGA(Pto , Fen , Lr10)数目最多, 占26.7% (566/2119). 第2大类是TM-LRR, 占总数的20.5% (435/2119). 需要指出的是, 在本研究中, 具有NBS 或LRR 功能域的RGA 被分成了9类, 即TM-LRR, PK-LRR, NBS-LRR, CC-NBS-LRR, CC-LRR, CC- NBS, PK-NBS-LRR, PK-NBS 和CC-PK-LRR, 因此每一类都不是最多的, 但若将它们皆计为NBS-LRR 类型, 则其数量占水稻RGA 的半数以上(1091/2119). 第1个被克隆的玉米抗圆斑病基因Hm1所代表的毒素还原酶类RGA 共发现了77个. 这类基因还与CC 结构相结合成为CC-Hm1类, 共发现3个该类型的成员. PK-NBS, CC-PK-LRR, TIR, Hs1和Pad4这几类RGA 在水稻中皆只存在一个成员, 对这些基因进行结构分析后显示, 其中大部分是假基因或没有功能的基因. Pan 等人[29]研究认为, 在双子叶和单子叶植物的分化过程中, NBS-LRR 分化成TIR-NBS-LRR 和CC-NBS-LRR 共2大类. 本研究显示, 水稻中不存在TIR-NBS-LRR 类的RGA, 这与甜菜相似[30], 但在拟南芥中已发现117个这类基因[19]. 本研究发现的水稻RGA 的有关数据可以从我们的网站(. cn/RGAs/index.html)获得.图1 水稻中RGA 的类型及其数量分布PK, 苏氨酸-丝氨酸蛋白激酶; TM, 跨膜蛋白; LRR, 富亮氨酸重复; CC, 卷曲螺旋结构; NBS, 核苷酸结合位点; Hm1, 玉米Hm1基因; CHORD, 富半胱氨酸-组氨酸结构域; TIR, 白细胞介素-1受体; Mlo,Asc, Hs1, Pad4分别代表各自基因的特有结构域2.3 RGA 在水稻亚种间的多态性通过用粳稻RGA 序列对籼稻基因组序列进行TBLASTN 联配, 在籼稻上找到1860个 R 基因的同源序列. 经过人工分析后去除重复的或匹配不好(匹配序列长度＜80 bp, 一致性＜40%)及与TIGR 数据库中CDS 序列不符的同源序列, 得到861个同源序列. 进一步去除位于不同染色体的非等位基因, 最终获得了702个在籼、粳间等位的RGA. 用sim4程序对这702个RGA 序列进行分析, 发现有671个(占95.6%)在籼、粳间存在InDel 的现象, 说明在籼粳亚种间RGA 存在很高的长度多态性. 用ePrimer3程序在InDel 两侧设计PCR 引物, 并进行e-PCR 验证, 选出能够获得惟一预期扩增产物的引物对, 最终得到402个候选的水稻亚种间RGA 标记. 有269个多态的RGA 未能开发成候选标记, 其原因可能是: (ⅰ) 一些RGA 间的结构相似性, 使得引物的特异性不强, 不能得到惟一的扩增产物; (ⅱ) 我们将e-PCR 产物的长度限制在1000 bp 以内, 有些RGA 的扩增产物可能过大而不能入选; (ⅲ) 引物是依据粳稻Nipponbare 的基因组序列设计的, 有些在籼稻93-11上未能完全匹配. 这些候选RGA 标记的有关信息(包括标记的引物、序列、所在粳稻Nipponbare 的BAC 克隆和籼稻93-11的Scaffold 等)都在我们的网站(. cn/RGAs/index.html)上发布. 根据TIGR 发布的拼接好的水稻基因组序列, 对候选RGA 标记进行了物理定位. 结果显示, 跟全体RGA 的情况一致, 候选RGA 标记在基因组中的分布也是非随机的, 表现为“成簇”分布的现象(图2). 有些染色体区域(如1号染色体的长臂)出现大片的空缺.候选RGA 标记的等位基因间长度差异(LD)变化在1~742 bp 之间, 平均长度为10.15 bp, 呈指数分布, 大部分(68.16%)＜5 bp; 24.88%落在5~30 bp 之间; 仅6.96%＞30 bp(图3). 值得指出的是, 我们发现有14个RGA 在2个亚种间的长度差异超过1 kb, 其插入序列都具有独立完整的基因结构. 同源性分析显示, 这14个插入序列的基因功能与受体蛋白密切相关. 由于R 基因本身就是一类受体蛋白, 因此这种在R 基因中插入与受体蛋白相关的基因的现象是否隐含着某种重要的生物学机制, 是一个令人感兴趣的问题.3 讨论本研究通过序列同源性比较结合功能域位点分析, 共发现了2119个RGA, 说明水稻基因组中R 基因的数量是十分丰富的, 是一个非常庞大的基因家族. 当然, 在这些RGA 中, 除了包含R 基因外, 还可能包含没有功能的基因或假基因. 为了鉴定其中哪些是真正的R 基因, 我们把所有的RGA 同已发布的第50卷 第11期 2005年6月论 文图2 候选RGA 标记在水稻基因组上的分布横坐标是物理图位置, 纵坐标是每Mb 所含RGA 的个数. 两斜杠表示染色体终止的位置表示着丝粒的位置32127个水稻全长cDNA [31]进行BLAST 分析, 结果有1851个RGA 能够很好地与cDNA 匹配, 因而可以认为它们可能是真正的R 基因(当然不排除其中有些可能是可表达的假基因). 剩余的268个RGA 可能存在3种情况: (ⅰ) 是cDNA 数据库中未包括的基因, 因为水稻中报道有约5万个基因; (ⅱ) 是不表达的假基因; (ⅲ) 是特定病原菌诱导表达的基因. 随着水稻全长cDNA 数据库的不断充实和完善, 这部分RGA 的身份将得到进一步的鉴别. 将来的挑战是对水稻中所有R 基因的功能阐明. 利用生物信息学的方法在全基因组范围内获取RGA 的有关信息, 将大大促进对R 基因的功能研究.论 文第50卷 第11期 2005年6月图3 候选RGA 标记在2个亚种间的长度差异(LD)的频率分布其中LD ＞26的30个标记未标出传统的RGA 标记是一种RFLP 标记, 应用上不方便, 而且由于开发上成本较高, 所以数量上十分有限. 本研究利用水稻籼、粳亚种的基因组测序数据和生物信息学手段, 开发出了基于PCR 技术的候选RGA 标记, 这将使RGA 长度多态性成为一种实用的分子标记. 我们用相似的方法已成功开发出水稻内含子长度多态性(ILP)标记(结果未显示). 经实验分析, 发现水稻ILP 标记具有明显的亚种特异性. 据此推测, 本研究基于籼、粳亚种间序列比较而开发的候选RGA 标记也将具有较高的亚种特异性. 该特性可望使RGA 标记在水稻亚种间杂交育种和亚种间杂种优势利用方面具有重要的应用价值. 另外, 已知RGA 在水稻基因组中呈簇状非随机分布, 而本研究开发出来的候选RGA 标记在基因组上的分布对全体RGA 的分布具有很好的代表性(图3). 而且, RGA 标记本身就是候选的R 基因. 因此, 利用RGA 标记将有助于快速定位R 基因, 加快R 基因定位和图位克隆的进程.致谢 本工作为国家高技术研究发展计划(批准号: 2003AA207160, 2002AA234031)和福建省自然科学基金(批准号: B9910011)资助项目.参 考 文 献1Flor H H. 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Nature, 420: 316~32010 The Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium. In-depth viewof structure, activity, and evolution of rice chromosome 10. Science, 2003, 300: 1566~156911 Meyers B C, Kozik A, Griego A, et al. Genome-wide analysis ofNBS-LRR encoding genes in Arabidopsis. Plant Cell, 2003, 15: 809~83412 Meyers B C, Dickerman A W, Michelmore R W, et al. Plantdisease resistance genes encode members of an ancient and diverse protein family within the nucleotide-binding superfamily. Plant J, 1999, 20: 317~33213 Bai J, Pennill L A, Ning J, Lee S W, et al. Diversity in nucleotidebinding site-leucine rich repeat genes in cereals. Genome Res, 2002, 12: 1871~188414 Meyers B C, Kozik A, Griego A, et al. Genome-wide analysis ofNBS-LRR–Encoding genes in Arabidopsis . Plant Cell, 2003, 15: 809~83415 Monosi B, Wisser R J, Pennill L, et al. Full-genome analysis ofresistance gene homologues in rice. Theor Appl Genet, 2004, 109: 1434~144716 Chelkowski J, Koczyk G . 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水稻基因图谱的构建及应用
水稻基因图谱的构建及应用现代农业技术的发展给人类的粮食生产增产增效带来了新的机遇和挑战。
水稻作为我国主要的粮食作物之一，其品种的研发一直是国内农业科技研究领域的一个热门话题。
在过去几十年的研究过程中，人们逐渐发现了水稻中许多关键的基因，这些基因的研究和遗传改良已经成为水稻研究的重点之一。
本文将重点介绍水稻基因图谱的构建及应用，以期为该领域研究者提供参考和借鉴。
一、水稻基因图谱的构建1.1 定义及意义水稻基因图谱，即水稻整个基因组的图谱，包括水稻基因组的物理地图、遗传图谱和基因功能图等。
搭建水稻基因图谱是研究水稻基因结构和功能的一项基础性工作，对于揭示水稻生命活动的机理，加速水稻育种进程，提高水稻产量和品质有着重要的意义。
1.2 构建方法水稻基因图谱的构建采用了一系列的生物技术手段，其中包括基于不同克隆方法产生的一系列分子标记、GenBank中的EST、已注册的基因等。
这些分子标记、基因和EST可以方便地通过计算机处理以建立各种类型的遗传图谱。
通过建立这些遗传图谱，既可以帮助解决水稻基因组中的基因：- 精细定位基因的位置及特点，- 发现突变形式，- 评估单个基因驱动的phenotypic effects。
此外，还可以建立水稻物理地图来精确定位基因的位置。
我们可以使用不同的克隆方法建立不同的分子标记，如RAPD、SSR、AFLP、RAD等方法。
这些标记可以在基因组上独立或一起使用，从而形成一个可生成水稻基因型的连锁图谱。
通常，这些连锁图谱会用来与整个基因组上的候选基因进行匹配，以更好地了解这些基因的位置及其环境。
1.3 近年来的进展近年来，随着高通量测序技术的不断发展，研究者们已经建立了越来越多的水稻基因组测序数据，使得水稻基因图谱的构建工作取得了许多重要的进展。
目前已经建立的水稻基因图谱很大程度上反映了水稻基因组的全貌，并且能够应用于水稻基因功能研究及育种。
二、水稻基因图谱的应用2.1 基因组学研究水稻基因图谱可用于鉴定新的基因位点，这些新的位点可以帮助基因工程师们对植物进行基因改造和选择育种过程中进一步地获得新的品种资源。
水稻基因组序列的生物信息学分析
水稻基因组序列的生物信息学分析水稻是全球最重要的粮食作物之一，为了更好地理解水稻的基因组和基因功能，水稻基因组序列的生物信息学分析在近年来成为了研究的热点。
同时，水稻的基因组序列数据也为水稻育种和改良提供了更广泛的基础。
水稻基因组序列数据源对于生物信息学分析而言，首先需要收集数据。
水稻基因组序列的数据可以来源于GenBank、Ensembl Plants、Gramene等数据库，这些数据库中收录的水稻基因组数据具有较高的准确性和可靠性。
基因组注释基因组注释是指将序列上的信息以可识别的形式进行描述和标注，其中包括基因定位、基因结构、启动子区域、编码序列和非编码序列等。
水稻基因组注释早已有较为完善的结果，并且此外，大量的转录组数据也为基因功能识别和分析提供了更多的信息。
目前，水稻是全球拥有最齐全和全面的基因组注释和基因功能信息的农作物之一。
基因家族分析基因家族是指具有相似序列和保守功能的基因集合。
水稻基因组中大量的基因家族的分析对于理解水稻基因功能及其演化，以及水稻与其他物种基因组之间的关系具有关键作用。
例如NBS-LRR家族被广泛研究并被归属于水稻抗病基因家族之一。
基因家族的分析可以为水稻品种改良提供指导，从而增加其抗病性和生产力。
微卫星和SNP分析微卫星和单核苷酸多态性（SNP）是常见的分子标记方式，它们被普遍用于物种分类、进化和基因定位。
其中，微卫星序列在水稻中比较常见，并作为生物的DNA指纹来应用。
同时，SNP可以对现代育种和种质资源管理提供帮助。
微卫星和SNP分析可以用于水稻种质资源的变异程度评估和亲缘关系分析。
差异表达基因分析差异表达基因（DEGs）是指在不同生物学状态下，在两个或多个组织或物种中表达量不同的基因。
对于水稻而言，如未受到逆境处理的基因表达模式与受到逆境处理后的差异表达模式将会不同。
由于DEGs分析有助于识别水稻中与逆境响应相关的基因，因此可作为提高水稻逆境抗力的重要依据。
基于高密度遗传图谱的水稻糙米籽粒大小QTL定位
收稿日期：2023-10-07基金项目：国家自然科学基金（32260497）；贵州省基础研究（自然科学）项目（黔科合基础-ZK〔2023〕一般178）；贵州省科技计划项目（黔科合平台人才〔2018〕5263）；贵州省科技计划项目（黔科合支撑〔2022〕重点028）作者简介：彭强（1986-），男，博士，副研究员，研究方向为水稻分子育种，E-mail：********************通信作者：朱速松（1966-），男，博士，研究员，研究方向为水稻分子育种，E-mail：*****************广东农业科学2023，50（12）：96-103Guangdong Agricultural SciencesDOI:10.16768/j.issn.1004-874X.2023.12.009彭强，徐海峰，宫彦龙，吴娴，吴朝昕，吴健强，朱速松. 基于高密度遗传图谱的水稻糙米籽粒大小QTL 定位［J］. 广东农业科学，2023，50（12）：96-103.基于高密度遗传图谱的水稻糙米籽粒大小QTL 定位彭 强，徐海峰，宫彦龙，吴 娴，吴朝昕，吴健强，朱速松（贵州省农业科学院水稻研究所，贵州 贵阳 550006）摘 要：【目的】籽粒大小是影响水稻产量的主要农艺性状之一。
采用籼稻品种V20B 与细长型爪哇稻品种CPSLO17衍生的重组自交系开展水稻糙米籽粒大小QTL 定位研究，挖掘遗传稳定的主效QTL，为优质高产稻品种培育提供新的基因资源和科学依据。
【方法】基于V20B/CPSLO17遗传背景的高密度遗传连锁图谱，结合150份重组自交系在4种环境（2019年贵州贵阳、2020年贵州贵阳、2021年贵州贵定、2021年海南三亚）中的糙米籽粒大小表型数据，采用IciMapping 4.0软件的ICIM-ADD 方法进行QTL 扫描。
【结果】亲本V20B 的糙米籽粒大小显著大于CPSLO17，重组自交系的糙米籽粒大小在4种环境间差异显著，均表现出连续的单峰分布。
什么是简单重复序列(SSR)
生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列（Tandem Repeats Sequence，TRS）和散布重复序列（Dispersed Repeats Sequence，DRS）。
其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、成串排列而成的。
目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成的（如rRNA和组蛋白基因）；另一类是由无功能的序列组成的。
根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。
微卫星DNA又叫简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下。
研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。
在植物中通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的，如在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位（AC）n和（GA）n在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。
在小麦中估计有3000个（AC）n序列重复和约6000个（G A）n序列重复，两个重复之间的距离平均分别为704 kb、440 kb，而在水稻中，（AC）n 序列重复约有1000个左右，（GA）n 重复约有2000个，重复之间的平均距离分别为450 kb、225 kb。
另外在植物中也发现一些三核苷酸和四核苷酸的重复，其中最常见的是（AAG）n、（AAT）n。
在单子叶和双子叶植物中SSR数量和分布也有差异，平均分别为64.6 kb和21.2 kb中有一个SSR。
研究还发现，单核苷酸及二核苷酸重复类型的SSR主要位于非编码区，而有部分三核苷酸类型位于编码区。
DNA分子标记及其数据库：indel标记
本文以水稻Indel标记的开发为例
水稻是最重要的粮食作物，也是单子叶模式植物。水稻重要基因的 精细定位和克隆已成为当前植物功能基因组学研究的热点之一，而功能 基因克隆的最基本和最重要的方法是图位克隆。图位克隆的关键是寻找 与目标基因紧密连锁的分子标记，然而，目标基因周围已有的分子标记 密度常常不能满足需要。因此，合理地利用亲本之间DNA 序列的多态性 来发展新的分子标记，是提高图位克隆效率的重要方法。双亲间DNA序 列的多态性是发展分子标记的基础，基于PCR的共显性分子标记是现在 最常用的标记类型。通常用于发展这类分子标记的DNA序列多态性有3 种基本的形式：简单序列重复长度多态性(simple sequence repeat length poly—morphism，SSR)、插入缺失长度多态性 (insertiondeletionlength polymorphism，InDel)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，由这3种基本的多态性产生的分子标 记分别为SSR标记、InDel标记和SNP标记。
假说可用不同物种的基因组作参照系加以检验，并得到多种检验结果的支持。
田大成解释说，基因突变主要是指DNA中核苷酸顺序、种类和数量的改变，而DNA序
列中普遍存在的点（碱基）突变是遗传变异的基本来源。点突变又分为自发突变和诱发突
变。长期以来，学术界对自发突变机制的经典认识是，自发突变受一系列因素的影响，是 一系列变化的结果，具有随机性和稀有性。但随着上个世纪90年代以来DNA测序技术的突 破性进展，研究者们对自发突变在基因组中的数量和分布有了精确估计，并普遍认为“自发 突变在基因组中不是随机分布的，突变热点普遍存在于基因组中”。这一结论对传统的自发 突变随机性和稀有性的认识形成巨大挑战，而这种现象也引起了各国科学家的极大关注， 但遗憾的是始终没有找到一种普遍的机制来解释这一重大的科学疑问。
水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化
水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化水稻是全世界最主要、最重要的粮食作物之一，也是全球人口的主要粮食来源。
水稻在生长发育过程中会受到各种外界环境因素的影响，比如干旱、寒冷、盐碱等，这些因素都会影响到水稻的产量和质量。
提高水稻的抗逆性是参与水稻产量和质量提高的重要途径之一。
OsTZF3基因是水稻中一个重要的转录因子，它在水稻的生长发育过程中起着重要的调控作用。
通过对OsTZF3基因进行敲除和过量表达，可以进一步揭示其在水稻生长发育中的作用机制，为培育具有更高抗逆性的水稻品种提供理论依据。
本文将介绍水稻OsTZF3基因敲除和过量表达载体的构建与遗传转化的方法与过程。
一、 OsTZF3基因的克隆与分析1. 提取水稻总RNA，并进行cDNA合成从水稻幼苗的叶片中提取总RNA，然后通过逆转录酶逆转录成cDNA。
将所有实验操作在RNAase-free环境中进行，以避免RNA的降解。
2. 克隆OsTZF3基因的全长cDNA利用cDNA作为模板，设计引物进行PCR扩增OsTZF3基因的全长cDNA。
然后将扩增产物进行电泳检测，筛选出目的片段。
3. 构建OsTZF3基因的敲除载体将目的片段连接到敲除载体上，并通过酶切鉴定确认连接是否成功。
然后将重组的质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增纯化。
二、水稻遗传转化1. 水稻愈伤组织的筛选与培养选用水稻的愈伤组织作为遗传转化的材料，通过对愈伤组织的筛选和培养，获取较好的愈伤组织,为后续的遗传转化做好准备。
2. 遗传转化载体的导入将构建好的OsTZF3基因敲除和过量表达载体导入到愈伤组织中。
常用的方法有生物弹射法、冷冻共转化法等，将质粒导入到愈伤组织细胞内。
3. 筛选转化株系通过对转化后的愈伤组织进行筛选，通过PCR或Southern blotting等技术鉴定出携带了目的基因的愈伤组织细胞。
4. 愈伤组细胞再生植株将转化的愈伤组织进行再生培养，得到植株。
通过对再生植株进行PCR鉴定，最终得到携带 OsTZF3基因敲除和过量表达载体的转基因水稻。
各种分子遗传标记简介2
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动物遗传标记课程作业
SSCP的应用
➢ 基因点突变的监测
➢ 大量样本的筛选 ➢ cDNA的筛查
➢ 检测人类遗传性疾病 ➢ 病毒的分型和分类
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微卫星DNA的优点
① 数量多且均匀分布在基因组中； ② 具有丰富的多态性；
③ 等显性遗传，因此检测可以显示纯合子和杂合子； ④ 检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。
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分子遗传标记的分类
Southern杂交为核心的分子标记，如RFLP
分子 标记
PCR技术为基础的分子标记，如RAPD 核酸序列为基础的分子标记，如SNP
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其它分子标记技术，如mtDNA
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主要的分子遗传标记
1、RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism）
随着大量代谢通路和上百万SNPs的确认，SNP作为新一代
遗传标记在人类疾病研究中显示出极高的潜在价值。 SNP研究与药物设计
随着SNP的研究与药物基因组学的结合，根据特定的基因 型来设计药物将成为可能。
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7、mtDNA标记
➢ mtDNA（Mitochondrial DNA）：线粒体DNA
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2 Oryza sativa ssp. indica var. 93-11 籼稻
3 Zea mays var. F683 玉米
4 Zea mays var. F743 玉米
5 Setaria italica var. 4a 粟
6 Setaria italica var. No.21 粟
7 Hordeum vulgare ssp. distichum 二棱大麦
1 材料与方法
1.1 候选标记的筛选和引物设计 利用笔者已开发的 5 800 多个水稻候选 ILP 标记
的有关信息（包括引物序列、所在位置、扩增片段长 度、两亚种间长度差异等；DNA Research，已接受）， 并从 GenBank（/）下载小麦、大 麦和玉米的 cDNA/EST 序列。将所有内含子长度在 400 bp 以下的水稻候选 ILP 标记引物对小麦、大麦和 玉米的 cDNA/EST 库进行 BLASTN 搜索，选取错配 碱基数＜4 的保守引物。对初选的水稻 ILP 标记，进 一步在其内含子两侧的外显子上用 ePrimer3 软件[15] 重新设计引物，以提高引物的保守性。对设计的引物 还在籼、粳稻基因组序列中进行了 e-PCR[16]检验，要 求只产生单一扩增产物。由此即获得候选的 ACGM 标 记。所有数据的处理和分析皆在 IBM P650 的服务器 上完成，使用 IBM AIX 的 Unix 操作系统。 1.2 植物材料
采用 CTAB 法[17]提取植物叶片 DNA。PCR 反应体
表 1 用于 ACGM 标记分析的植物材料
Table 1 Plant materials used for ACGM analysis
编号
植物材料
染色体组
No.
Material
1 Oryza sativa ssp. japonica var. Nipponbare 粳稻
Key words: Amplified consensus genetic marker; Intron length polymorphism; ACGM; Gramineae
0 引言
【本研究的重要意义】分子标记是现代遗传学研
究的有力工具。自 1980 年首次提出分子标记的概念以 来[1]，分子标记已广泛应用于遗传图谱构建、基因定 位、基因克隆、基因组比较、遗传多样性分析、标记
禾本科是一个十分重要的大科，主要粮食作物（如 水稻、小麦、玉米、高粱）和牧草多为禾本科植物。 开发禾本科通用型 ACGM 标记，对禾本科比较基因组 研究、同源基因克隆、分子标记辅助育种等无疑具有 非常重要的理论和实际意义。水稻籼、粳两个亚种的 基因组序列草图皆已完成[9,10]，而粳稻最近还发布了 全基因组精细图[11]。水稻两个亚种基因组测序的完 成，使得人们能够直接用生物信息学的手段比较两亚 种间的 DNA 序列多态性，这为开发水稻分子标记提 供了极大的便利[12]，同时，这也为开发禾本科通用型 ACGM 标记提供了契机。Fourmann 等[8]研究发现， ACGM 的多态位点多位于内含子区域。真核生物基因 组中散布着大量的内含子[13,14]。由于内含子为非编码 序列，受到的选择压力较小，因而更容易积累变异。 笔者利用已公布的水稻两亚种（籼稻 93-11 和粳稻 Nipponbare）的基因组序列[9~11]，借助生物信息学的方 法，开发了 5800 多个候选的水稻内含子长度多态性 （ILP）标记，并通过试验从中开发出 173 个在水稻中 普遍适用的 ILP 标记（DNA Research，已接受）。【本 研究的切入点】上述研究表明，水稻亚种间存在丰富的 内含子长度多态性。可以预见，那些在水稻籼、粳亚种 间存在内含子长度多态性的基因很有可能在其它禾本 科物种中也存在内含子长度多态性，因此，有可能将它 们开发成禾本科通用型 ACGM 标记。【拟解决的关键 问题】本研究利用笔者在水稻中已开发的候选内含子长 度多态性标记和已公布的小麦、大麦和玉米的 cDNA/EST 序列，对开发禾本科通用型 ACGM 标记的 可行性进行了探讨。
关键词：扩增共有序列遗传标记；内含子长度多态性；ACGM；禾本科
Development of Amplified Consensus Genetic Markers in Gramineae Based on Rice Intron Length Polymorphisms
LU Yong-quan1,2, WANG Xu-sheng1, HUANG Wei-su1, XIAO Tian-xia1, ZHENG Yan1, WU Wei-ren1,3
收稿日期：2005-10-25；接受日期：2005-12-13 基金项目：国家“863”计划项目（2003AA207160）和福建省重大科技专项（2004NZ01-2） 作者简介：卢泳全，汪旭升对该文有同等贡献。卢泳全（1974-），女，黑龙江人，博士，研究方向为植物分子生物学；汪旭升（1978-），男，浙江人，
（1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029; 2Biotechnology Research Center, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Haerbin 150086; 3College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002）
中国农业科学 2006,39(3):433-439 Scientia Agricultura Sinica
基于水稻内含子长度多态性开发禾本科扩增 共有序列遗传标记
卢泳全 1,2，汪旭升 1，黄伟素 1，肖天霞 1，郑 燕 1，吴为人 1,3
（1 浙江大学农业与生物技术学院，杭州 310029；2 黑龙江省农业科学院生物技术研究中心，哈尔滨 150086； 3 福建农林大学作物科学学院，福州 350002）
8 Hordeum vulgare ssp. tetrastichum 四棱大麦
9 Triticum macha 莫迦小麦
10 Triticum spelta 斯卑尔脱小麦
11 Phyllostachys atrovaginata 毛芽竹
12 Phyllostachys propinqua 早园竹
13 Echinochloa crusgalli Beauv 旱稗草
硕士，研究方向为生物信息学和基因组学。通讯作者吴为人，Tel: 0571-86971910; E-mail: wuwr@
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中国农业科学
39 卷
辅助育种等方面的研究[2～5]。利用一个物种的分子标 记对另一物种进行遗传或物理作图称为比较作图，是 比较基因组研究的主要方法，可以揭示不同物种在基 因组结构和进化上的关系。【前人研究进展】关于比 较作图研究已有许多报道[6]，但这些研究多采用限制 性片段长度多态性（RFLP）标记，技术上比较麻烦。 Brunel 等[7]提出了一种基于 PCR 技术且适合于比较作 图的分子标记，称为扩增共有序列遗传标记（ACGM）。 该技术是根据一种植物中已知功能基因的保守编码序 列设计引物对另一种植物进行 PCR 扩增。Fourmann 等[8]开发出 32 个可以在拟南芥和油菜之间共用的 ACGM 标记，并利用这些标记构建了油菜的遗传连锁 图谱。但是，在不同物种间开发具有一定通用性的 ACGM 引物是比较困难的，目前仅见拟南芥和芸苔属 之间的研究报道。
摘要：通过在多态位点两侧的保守编码序列上设计引物，可以开发出在不同物种间通用的基于 PCR 的分子标记， 称为扩增共有序列遗传标记（ACGM）。【目的】探讨利用已公布的水稻籼、粳两亚种的基因组序列开发禾本科 ACGM 的 可行性。【方法】根据水稻两亚种间的内含子长度多态性，开发了 38 对 ACGM 引物。用这些引物对玉米、粟、大麦、 小麦、竹子、旱稗草和大米草 6 个属共 12 个不同材料进行 PCR 实验。【结果】几乎所有引物都可在至少 1 种材料中 扩增出特异条带，而 1/3 以上的引物可以在全部供试材料中获得特异扩增产物。在每一种供试材料中，平均大约有 2/3 的引物可以成功扩增出目的条带。这些引物在各属内不同种、亚种或品种（系）之间的多态性比例在 24.1%～90.3% 之间，平均为 44.6%。【结论】利用水稻基因组序列信息开发禾本科通用型 ACGM 是可行的。
选用禾本科 8 个属的 14 份植物材料（表 1），其 中 Nipponbare 和 93-11 是基因组已测序的粳稻和籼稻 品种；F683 和 F743 是 2 个玉米自交系（由浙江大学 育成）；粟 4a 和 No.21 是生产上常用的 2 个优良品系； 大麦、小麦和旱稗草采自浙江大学农场植物标本园； 早园竹和毛芽竹采自杭州植物园；大米草采自福建罗 源湾滩涂。 1.3 ACGigning primers in the conservative coding sequences flanking a polymorphic site, it is possible to exploit a PCR-based marker called amplified consensus genetic marker (ACGM), which is transferable among different species.【Objective】 The purpose of this study was to investigate the feasibility of developing ACGMs in Gramineae using the published genomic sequences of indica and japonica rice【. Method】Based on the intron length polymorphisms between the two rice subspecies, 38 pairs of ACGM primers were developed. Twelve accessions representing 6 grass genus including Oryza, Zea, Setaria, Triticum, Phyllostachys, Echinochloa crusgalli Beauv and Spartina anglica were used to verify the candidate ACGM markers【. Result】Almost all primers could acquire specifically amplified products in at least one accession. More than 1/3 primers could obtain specifically amplified products in all accessions. For each accession, about 2/3 primers on average could obtain specifically amplified products. The proportion of polymorphisms between species or subspecies within genus was 24.1%-90.3%, with an average of 44.6%. 【Conclusion】These results showed that developing ACGM in Gramineae using rice genome data is feasible.