转基因生物与基因打靶
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶是指在治疗疾病时，针对特定基因进行干预，以达到治疗效果的方法。
以下是相关名词解释：
1. 基因：生物体中具有特定遗传信息的DNA序列单元。
2. 靶基因：待治疗的特定基因，对该基因进行治疗干预。
3. RNA干扰技术（RNAi）：利用人工合成的小RNA分子，
靶向性地沉默靶基因的表达。
4. 基因编辑技术：CRISPR-Cas9技术等，可以对基因进行切除、插入或修复，实现对靶基因进行精准编辑。
5. 药物靶向干预：通过设计特定的小分子药物，靶向地干预靶基因的表达和功能。
6. 基因表达谱分析：对疾病患者进行基因表达谱分析，寻找与疾病相关的靶基因，为基因打靶治疗提供依据。
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶技术 (Gene Targeting) 是一种分子生物学技术，建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术的基础上。
它通过将目的基因和与细胞内靶基因同源的 DNA 片段重组到载体 (或质粒) 上，构建打靶载体 (基因表达载体),然后利用限制酶将打靶载体线性化，以提高重组率。
通过显微注射技术将打靶载体导入胚胎干细胞，这样打靶载体和与细胞内靶基因同源的区段就有机会发生同源重组。
为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。
最后，通过 DNA 分子杂交技术鉴定同源重组的细胞，获得大量打靶成功的细胞。
这些细胞可以注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被修饰过的基因和未被修饰的基因。
如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被修饰过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被修饰过的小鼠。
基因打靶技术及其应用前景
基因打靶技术及其应用前景摘要：基因打靶是近年来发展起来的对细胞基因组中的某一基因进行定点操作的生物技术。
综述了基因打靶的筛选系统，影响基因打靶效率的几个主要因素及其解决方法，总结了基因打靶在各个学科领域中的应用。
基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体 DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。
它产生于70年代末和80年代初，最初应用于酵母细胞，80年代中期应用于培养的哺乳动物细胞。
此后，科学家将此技术与胚胎干细胞操作技术相结合，使其得到迅猛的发展，并在生物学、医学和畜牧学等学科领域的研究和应用中展现出广阔的前景。
基因打靶的原理和技术路线虽不复杂，但是，由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA 序列发生同源重组的机率非常低，所以要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来将是一种非常困难的工作，所以，筛选和富集中靶细胞就成为基因打靶技术中的关键一环。
基因打靶筛选系统选择标记基因定点突变的筛选以犹它大学Capecchi教授的实验为例，介绍选择标记基因定点突变的筛选方法。
首先，在HPrt 序列的第8外显子处插入一个新霉素抗性基因（neo r）作为选择标记，然后用电击转移法将打靶载体导人ES细胞中，通过G418和6-TG（6- thioguanine，6-巯基鸟嘌呤）两种药物的双筛选，得到了既抗G418又抗6-TG的细胞克隆。
从理论上推测，这些细胞克隆都应是对靶细胞Hprt基因进行了定点突变的克隆，因为如果外源基因没整合入靶细胞基因组，靶细胞（Neo--/Hprt+）在G418和6- TG的任何一种选择培养基中都将全部死亡；如果打靶载体只是随机整合入靶细胞基因组，则该 Neo+/Hprt+细胞在6-TG选择液中将全部死亡。
所以，只有通过同源重组，使Hprt位点发生了定点突变的克隆（Neo+/Hprt-）才能在两种选择培养基都存在的情况下存活。
正向选择法（positive lection）正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。
转基因生物和基因打靶
– 在α-螺旋上的氨基酸发生了替代 – α1β1接触面上的氨基酸发生置换 – 氨基酸缺失
• 结果：血红素脱下，排出；珠蛋白，亨 氏小体，溶血性贫血
• 血红蛋白M病
– 高铁血红蛋白（Hb M）：珠蛋白点突变， His被Tyr取代，氧亲和力下降，紫绀
• 伴有红细胞增多症的异常血红蛋白病
– 位于α1β2接触面上的氨基酸发生取代
– 位于珠蛋白肽链羧基端的氨基酸间不能形成 盐桥
– 氨基酸取代影响β链与2 ,3-二磷酸甘油酸 (2,3-DPG)的结合
– “血红素口袋”四周的氨基酸被取代
基因结构变异与地中海贫血
• 地中海贫血：珠蛋白肽链合成受到抑制 所引起的溶血性贫血
基因结构异常的分子机制
• DNA一级结构变异的分子机制
– 自发突变；诱发突变 – 诱变因素：诱变剂
* 碱基和核苷类似物：5-氟尿嘧啶；6-巯基嘌呤 * 烷化剂：氮芥、环磷酰胺；活性烷基 * 抗生素类：放线菌素D * 染色剂：吖啶黄 * 亚硝酸盐 * 电离辐射和紫外线照射
诱变剂的作用机制
• 碱基类似物诱发突变
基因结构变异与血友病甲
• “经典”血友病：X染色体连锁，自发性 出血
• 病因：因子Ⅷ活性缺乏，因子Ⅷ基因的 缺陷
– 基因缺失 – 插入突变 – 点突变 – 基因重排
基因结构变异与血友病乙
• 性连锁遗传性出血性疾病，因子Ⅸ缺乏 • 因子Ⅸ基因缺陷
– 基因缺失 – 基因插入 – RNA剪接部位突变 – 无义突变 – 错义突变
• 农杆菌介导的基因转移：
– 冠瘿瘤 Ti质粒(tumor-in-ducing plasmid) 转移 DNA(transfer DNA,T-DNA)
基因打靶技术的研究进展
01 引言
目录
02 研究现状
03 传统基因打靶技术
04 新兴DNA纳米技术
05 应用领域
06 基因功能研究
07 疾病治疗
目录
08 研究方法
09 基因打靶效率的评估
010 挑战与展望
011 结论
引言
基因打靶技术是一种通过定向改造生物体基因组来实现基因功能研究与疾病 治疗的新兴技术。自20世纪80年代初以来，基因打靶技术不断发展，为科学研究 与医学实践提供了强有力的工具。本次演示将综述基因打靶技术的研究现状、应 用领域、研究方法以及挑战与展望，以期为相关领域的研究人员提供参考。
新兴DNA纳米技术
近年来，随着DNA纳米技术的不断发展，出现了一种基于DNA纳米结构的新型 基因打靶技术。该技术利用DNA自组装纳米结构，将基因打靶与纳米药物输送相 结合，具有更高的靶向性和细胞内活性。此外，DNA纳米技术还可用于基因编辑、 疫苗研发等领域，为基因打靶技术的发展开辟了新途径。
应用领域
挑战与展望
尽管基因打靶技术具有广泛的应用前景，但仍面临许多挑战和问题需要解决。 其中，靶向序列的设计和制备是关键的挑战之一。目前，靶向序列的设计主要依 赖于计算机辅助软件，但这些软件的准确性和可靠性仍有待提高。此外，制备高 质量、大规模的靶向序列仍是一个挑战。未来，研究人员需要开发更加高效和准 确的软件和方法，以提高靶向序列的设计和制备水平。
2、DNA疫苗
DNA疫苗是一种将外源抗原编码基因导入机体，通过机体细胞表达抗原蛋白， 诱导机体产生免疫应答的疫苗。基因打靶技术可应用于DNA疫苗的研发，将抗原 编码基因导入机体细胞，提高疫苗的免疫原性和保护效果。
3、基因治疗
基因打靶技术可用于基因治疗，通过将外源正常基因导入患者体内，补偿缺 陷基因的功能，达到治疗疾病的目的。例如，利用基因打靶技术将正常β-珠蛋 白基因导入贫血患者的造血干细胞，可有效治疗地中海贫血。
转基因生物和基因打靶
精子载体法：
经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵
子结合，受精。
•12
6、接受外源基因的个体的产生 1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假
孕动物子宫→胚胎→个体。 2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中 分离多功能胚胎干细胞 →基因操作→注 射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合 个体
•13
•29
•同源重组 •随机整合
•30
3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌 合胚胎。
4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。
5 、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠 。常有的方法有：Southern印记、 Northern印记
•把细胞注入胚泡
•把胚胎注入 假孕小鼠
•Southern印 记
•31
可作为器官移植的供体
•19
第二节 转基因植物
概念 :指用人工方法将外源基因导入或整合 到基因组内，并能稳定传代的一类植物。
方法：获取目的基因→受体细胞培养→将目 的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转 化农杆菌，后者再转化受体细胞）→培养转 化细胞→筛选阳性细胞→培植阳性植株→转 基因植株的鉴定
6、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代 小鼠（+/+、-/-、+/-）。
7、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。
•（•（++/-/））
••（（++//-））
•）（•）（++/+/+
•（•（+/--/-） •（+/-•（+/- •（-/-）
）
））
•32
三 、基因打靶在医学中的应用
1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的 疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分 子机制。
基因转移技术和基因打靶技术
simplex virus) 胸腺嘧啶(mì dìnɡ)激酶 (thymidine kinase)
精品文档
一、胚胎干细胞系的建立 （一）胚胎的收集与胚泡的培养
精品文档
一、目的基因的制备和转基因载体的构建 （一）目的基因的制备 1、cDNA法扩增目的基因 2、双链DNA与载体连接(liánjiē)构建重组体 3、将重组体转入受体菌 4、筛选和鉴定重组体 5、扩增获得大量重组体
精品文档
（二）转基因载体的构建 载体通常由结构基因及其调控序列(xùliè)组
成。常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧光 蛋白等报告基因。
根据不同目的选择相应调控序列(xùliè)：如 观察外源基因表达的生物学效应，即选择表达 效率高而无组织特异性的强启动子如CMV、 pGK等。如观察外源基因再特定靶器官的功能， 即选择组织特异的启动子。
线性DNA分子比环形DNA分子更容易整合到
分离胚胎，体外培养胚胎形成(xíngchéng) 胚泡。 （二）内细胞团（ICM）的离散 （三）干细胞克隆的识别 （四）干细胞的收集与传代培养 （五）干细胞的冻存与复苏 （六）ES细胞系的特征 精品文档
二、基因打靶
基因打靶就是按照预定计划通过(tōngguò)外部打靶 DNA与内源性靶基因之间的同源重组对胚胎干细胞进 行遗传修饰。
瞬间
细胞
细胞膜核膜通透性增加(zēngjiā)
高压脉冲
DNA渗入细胞
精品文档
（五）体细胞核移植法
1997年，英国科学家Schnieke和Wilmut等通过体细胞 核移植技术成功克隆了“多莉”。 原理：
转基因、基因克隆与基因敲除技术
内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配
杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
黑色雌性大鼠
B 、 制 备 基 因 敲 除 动 物 （ 小 鼠 ）
来自褐色大鼠
1、Neor （neomycin-resistance gene)基因：阳性 筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。
1号发生位点同源重组，在G418培养基中生长；
2号为随机插入重组，带入tk基因，可在G418培养基中生长，但 在gangcyclovir培养基中被杀死；
3号未发生任何重组，为正常细胞，在G418培养基中被杀死。
抵抗G418的基因 1 2 tk基因 3
B、制备基因敲除动物（小鼠）
1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡 中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质） 2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。 3、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干细 胞来自褐色小鼠，正常胚胎来自黑色小鼠。 4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色 的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲 除。 5、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。
G418（也称遗传霉素）是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉 素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻 断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、 植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常 用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方 后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产 物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有 Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ,已在基 因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应 用。
分子生物学 基因功能研究1---基因打靶和转基因
•转基因技术（Transgenic technology）* ： 产生转基因生物的技术。
二、 转基因小鼠模型的建立
基本流程*：
•转基因载体的构建
Enhancer
P
transgenic gene
NeoR
二、 转基因小鼠模型的建立
事实上，目前至少500种基因已经获得了基因敲除小鼠！
基因敲除小鼠工程
2006年，
•美国NIH推出knockout Mouse Project (KOMP) •将系统敲除或破坏小鼠的2万个基因 •计划投入5200万美元建立小鼠基因组突变基因数据库 •此计划与加拿大North American Conditional Mouse Mutagenesis Project (NorCOMM)及European Conditional Mouse Mutagenesis Program (EUCOMM)合作，以避免重复工作
英国卡迪夫大学卡迪夫生命科学学院
马丁·埃文斯 Martin J. Evans
美国北卡罗来纳州大学教会山分校医学院 奥利弗·史密斯 Oliver Smithies
一、基因敲除的定义 *
•利用DNA同源重组的原理，在活体内将特定基因从染色体 上剔除的过程。
Genomic DNA: Targeting DNA fragment:
基本流程：
•转基因载体的构建 •将重组转基因导入受体细胞核内 •将转基因ES细胞移植胚泡中
一般认为，
•转基因是随机整合 到染色体上，因此， 转基因杂合子的几率 在10-20% 以下
•将嵌合胚泡、或转基因受精卵移植入假孕小鼠的子宫腔中
基因敲除技术与转基因技术的比较研究
基因敲除技术与转基因技术的比较研究生物技术的发展和应用为人类带来了巨大的利益。
然而，与此同时，也不可避免地带来了一些争议。
在生物技术领域，基因敲除技术和转基因技术是两个热门话题，它们的利用在不同领域具有巨大的应用前景。
本文旨在比较基因敲除技术与转基因技术，帮助读者更好地了解它们的区别和优劣之处。
一、基因敲除技术基因敲除技术是一种通过DNA重组实现基因灭活或剔除的方法。
它通常通过利用重组酶切，将合成的DNA序列植入到细胞中，可以导致目标基因在细胞内被敲除或被靶向沉默。
基因敲除技术的优势在于可以准确地控制目标基因，从而促进基因治疗的发展。
此外，它还可以为疾病基因的研究提供新的平台。
基因敲除技术在基础研究、药物研发、细胞修饰和癌症研究等领域有着广泛的应用。
例如，通过敲除恶性肿瘤细胞中的抑癌基因，可以阻止恶性肿瘤的发展；在研发新的药物时，可以通过基因敲除来验证药物的靶点，从而确定药物的作用机理；以及通过基因敲除来研究不同基因在特定生物过程中的作用，例如神经发育和心肌细胞的分化。
二、转基因技术与基因敲除技术不同，转基因技术针对的是在植物和动物等有机体中插入外来基因的技术。
转基因技术常用的几种方法包括随机插入、受控插入、基因扩增和胚胎基因修饰。
转基因技术可以实现“设计”生物体，也就是人为地改变其生物特性。
转基因技术在食品生产、医疗和工业生产等领域有着广泛的应用。
例如，经过转基因技术改造后的植物可以抵抗病虫害，提高产量和质量，从而为食品生产提供了可能；在医疗领域，转基因技术可以用于生产抗体和蛋白质药物，或者用于治疗癌症、糖尿病和多发性硬化等疾病。
此外，转基因技术还可以用于工业制造，例如用转基因植物生产生物燃料、革命纤维和生物塑料等。
三、基因敲除技术与转基因技术的比较基因敲除技术和转基因技术虽然都是生物技术领域的重要发展方向，但二者还是有所不同的。
基因敲除技术致力于通过切断DNA序列来消除不必要的基因，而转基因技术则是通过插入新的基因来增强或改变生物体的功能。
基因打靶技术
基因靶位操作技术还为人类遗传疾病的基因治 疗提供了有力手段。所谓基因治疗 基因治疗，即通过对缺陷 基因治疗 基因的修复，使病灶细胞重新获得正常功能。靶位 操作技术对缺陷基因结构进行精确改正，与功能弥 补性基因治疗不同，修复后的细胞表达正常蛋白， 不表达错误产物，因此它是一种理想的基因治疗策 略。
4 转基因动植物和生物反应器方面 转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动 转基因技术 植物体内，使外源基因与动植物本身的基因整合在 一起，实现体内表达，从而培养出转基因动植物的 技术。基因靶位操作技术的出现，使转基因动植物 和生物反应器研制更为精确。如果应用基因打靶技 术把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中，定 点改造原有基因的功能，使转基因动植物和生物反 应器的研制更为精确。
3 在病理模型和基因治疗方面 目前，越来越多的人类疾病被证实是由基因 缺陷所致，人类疾病的动物模型对病理学研究和 临床治疗都非常重要。自发或诱变病理模型需要 漫长的时间；应用转基因技术，外源基因在基因 组中的随机整合可能带来不确定的表型。而基因 靶位操作技术在很大程度上克服了上述局限，它 通过胚胎干细胞的体外转染、筛选和胚胎嵌合体 途径，获得含特定突变基因的模型小鼠，得到多 种病理模型。
基因打靶技术的原理
进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要 导入靶细胞的靶载体。该载体不仅含有需要插入 的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列 相同的核苷酸片段，即同源重组指导序列 同源重组指导序列。将此 同源重组指导序列 载体导入靶细胞，通过外源载体和内源靶位点相 同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA定 点整合到靶细胞的特定的基因座上。因此，同源 重组是基因打靶技术的分子生物学基础。
图2：正负选择载体的筛选原理
染色体DNA；Ⅰ、Ⅱ之间斜线部分为同源区； 之间斜线部分为同源区； Ⅰ：正负选择DNA；Ⅱ：染色体 正负选择 ； ； A、B：染色体上的两个基因 、 ： E：外源基因； ：外源基因；
基因打靶技术
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起来的。对 于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组整合到基因组内， 随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应
用于哺乳动物细胞，并得到进一步的发展和改进。
80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行模式试验，
基因打靶的基本环节
4 检测：
观察被击中细胞的生物学特性，并进行分子生物学检 测。可以用特异PCR 方法鉴定， PCR 引物一端以基因组 DNA 的特定基因座为模板，另一端以导入的外源基因为模 板，这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。 对经PCR 鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方法 来进一步确定同源重组克隆。
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究 (2) 建立人类疾病的动物模型 (3) 用于疾病的基因治疗 (4) 用于改造生物和培育新的生物品种
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究
后基因组时代主要任务就是研究大量新基因的功能。用体细胞 基因打靶技术通过定点改造基因组中的特定基因，有可能在细胞水平 上研究某一基因的功能及调控机制；从定点突变的干细胞获得基因突 变型个体，可在生物体整体水平上了解某些基因在体内的具体作用。 另外，胚胎发育是非常复杂的生命现象，在这一过程中包含着许多生 理、生化的复杂变化，尤其是要考察某一基因对某一组织器官发育的 影响，用传统的研究方法很难进行观察研究。基因打靶为这一领域的 研究提供了理想的方法
变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是 同源重组效率的关键因素，基因打靶载体的同源重组序目标的DNA 序列进行扩增得到。
7 8 neo 8
6
78
第12章转基因生物和基因打靶
第十二章转基因生物和基因打靶第一节转基因动物一、转基因动物（transgenic animal）：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
二、转基因动物的基本原理：是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因接合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的转录单位）。
由于哺乳动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引入报告基因（reporter gene）或报告序列（reporter sequence）。
构建外源基因时，可选择适当的顺式作用元件拼接；也可以将特定的目的基因与报告基因拼接成融合基因（fusion gene），并与顺式作用元件拼接成完整的基因。
顺式作用元件主要选用有较高表达活性的强启动子（有时包括增强子），或者直接选用目的基因的天然启动子序列。
目的基因可来自基因组片段或cDNA序列。
三、基本方法：导入基因的方式主要有显微注射法、胚胎干细胞法和逆转录病毒感染法。
线性DNA和环状DNA均可用于显微注射，但线性DNA整合效率比超螺旋DNA高出数倍，因为线性DNA可以首尾相连，然后整合到染色体上。
外源DNA的纯度亦十分重要。
1．显微注射（microinjection）是目前最常用的转基因方法之一。
用显微注射针将外源基因直接注入实验动物受精卵的原核，使外源基因整合入动物基因组中，从而得到转基因动物。
受精卵经显微注射后，约有60%左右的卵存活，由此发育成的小鼠中，有10%-40%的小鼠整合有外源基因：其中80%的基因整合发生在单细胞期，成为典型的转基因动物；20%在细胞分裂后整合，这部分动物并不是所有细胞中都有外源基因，称为嵌合动物（chimeric animal）。
基因打靶的注意事项
基因打靶的注意事项随着基因编辑技术的飞速发展，基因打靶（gene targeting）作为其中的一项技术，也越来越受到科学家的关注。
基因打靶技术是指通过人工的手段，在某个具体的基因上进行精准定位，从而实现对基因的编辑和修饰。
尽管该技术在理论上备受推崇，但是在实际操作中，需要遵循一定的注意事项，以避免不必要的风险和损失。
首先，要选择合适的目标基因进行打靶。
不同的基因具有不同的功能和作用，因此在选择目标基因进行编辑时，需要充分了解其在生理学、病理学及相关疾病中的作用及机制，以此来确保编辑的有效性和安全性。
同时，在选择靶点时，也需考虑靶点的选择范围（如外显子、内含子、启动子等）以及目的和后续操作可能产生的影响。
此外，在选择目标基因时，还需遵循伦理和法律的规范，不能涉及到基因的非自愿、非自由、非自主的被编辑和转移的情况。
其次，操作前需要充分准备和实施有效的实验方案。
基因打靶技术需要进行复杂的实验操作，包括人源或动源基因细胞的培养和处理、质粒构建和转化、基因编辑或修饰等步骤。
因此，在实验前要明确方案和操作步骤，以及确定相关试剂和设备，并进行必要的检测和验证，以确保实验的可重复性和准确性。
同时，在操作过程中，也要留意实验条件的细节，比如温度、空气湿度、操作时间等细节，以对结果的解读和分析具有参考价值。
另外，基因编辑的成功与否，关键取决于编辑效率和编辑准确性。
因此，我们需要通过实验来评估这两个指标。
编辑效率指在一定的底物浓度和时间内编辑目标基因发生的程度，其影响因素包括底物填充度、结构稳定性、外部环境等因素。
同时，编辑准确性评估则需通过Sequecnig 和质谱等技术手段来评估编辑效果，以此检验修饰方案在模拟或现实应用中的可靠性与适用性。
在实验中同时，需制定合适的留样及高清理图像录制策略方案予以保存的同时也可以帮助科学家对过程和结果进行评估。
最后，还要保证基因编辑的安全性和可靠性。
随着基因编辑技术的不断发展，出现由人工编辑引起的安全和风险的问题也越来越多。
基因打靶的注意事项有哪些
基因打靶的注意事项有哪些基因打靶是一种针对特定基因进行精确编辑和调整的技术，被广泛应用于基因组学研究和基因治疗领域。
在进行基因打靶时，有一些注意事项需要考虑，以确保实验的准确性和安全性。
首先，需要明确研究目的和研究对象。
在进行基因打靶前，需要明确研究目的和预期结果。
确定要编辑的基因以及编辑后的期望效果非常重要。
此外，需要确定适合进行基因编辑的细胞或生物体作为研究对象，以确保后续实验的可行性。
其次，需要选择适当的基因编辑技术。
目前常用的基因编辑技术包括锌指核酸酶（ZFN）、TALEN（转录激活样效应核酸酶）和CRISPR-Cas9系统。
不同的技术有其优势和局限性，因此需要根据实验要求选择合适的技术。
例如，CRISPR-Cas9系统具有简单、高效和经济的特点，但也有可能发生非特异性的剪切和编辑错误。
在设计靶点时，需要注意选择特异性高、靶点位点保守的区域。
对于每个基因，靶点的选择应该尽量避免靶向其他相关基因或重要的调控元件。
此外，需要评估靶点的位点是否在编码区域，以免不必要的影响基因的功能。
在实验过程中，需要进行合适的对照组设计。
对照组是一组没有进行基因编辑的样本，用于与编辑组进行比较，评估编辑的效果和引起的变化。
合适的对照组设计能够减少因其他因素引起的干扰，提高实验结果的可靠性。
此外，应采用适当的实验设计和数样本量。
合理的实验设计能够降低实验误差，提高实验的准确性。
根据实验的目的和需求，选择适当的样本量非常重要。
样本量过小可能导致结果不具有统计学意义，样本量过大则可能造成实验浪费。
在进行基因打靶实验时，需要遵守实验室安全操作规范。
使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑时，需要注意避免技术操作过程中形成的不必要的二级DNA结构。
此外，应遵循相关标准和规定，保障实验人员的个人安全并避免对环境造成污染。
最后，基因打靶实验中的数据分析也是十分重要的。
对于编辑效果的评估，常常需要使用测序技术检测目标基因位点的突变频率。
7生物化学
第七章 基因打靶与转基因动物 基因打靶（gene targeting）是利用同源重组定向改变生物遗传信息的技术，在突变的细胞或个体内研究基因、基因组的功能或者获得相关基因的突变体动物。
基因打靶具有定位性强、打靶后新的基因具有随染色体DNA稳定遗传的特点，主要包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。
相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获技术等。
利用基因打靶技术，科学家们能够精确瞄准任何一个基因，并对它进行深入研究。
基因打靶技术广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的制备以及经济动物的改良等。
第一节 基因打靶2007年10月，美国科学家马里奥·卡佩奇（Mario Capecchiand），奥立佛·史密斯（Oliver Smithies）与英国科学家马丁·埃文斯（Martin Evans），因在基因打靶方面的杰出贡献，共同获得诺贝尔生理学或医学奖（图1）。
这是一项在老鼠身上开展的“基因打靶”技术，极大地影响了人类对于疾病的认识，已被广泛应用在几乎所有生物医学领域。
这项技术也就是在胚胎干细胞的基础上，通过同源重组将动物的某个基因敲出，或者在动物的染色体上插入我们需要的基因，在动物体内稳定表达。
图1 2007年诺贝尔奖获得者什么是基因打靶？基因打靶就是利用胚胎干细胞技术和同源重组定向技术，定向改变细胞或动物遗传信息的技术。
在突变的细胞或个体内研究基因、基因组的功能或者获得相关基因的突变体动物。
基因打靶具有定位性强、打靶后新的基因具有随染色体DNA 稳定遗传的特点。
基因打靶主要包括：基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除，基因精细修饰等。
基因敲除（knock out）：使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧失正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
通过删除某个基因的外显子或删除它的启动子来实（图2）现，图中小鼠的瘦素基因被敲出，小鼠就长得肥胖。
12第十二章 转基因动物和基因打靶
延迟囊胚体外培养1～2周后，可在饲养层上出现滋胚层、上皮 样内胚层细胞和干细胞（EK细胞），据形态特征（体积小，具有一 个大核和1～2个核仁）挑选，培养传代，建立EK细胞系。 2.EK细胞的特性鉴定 （1）核型鉴定： EK细胞应有整二倍体的核型，呈XX或XY型，并 能在嵌合体中形成有功能的配子，小鼠EK细胞染色体总数为40。 （2）分化潜能的鉴定
（四）转基因生物成就 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的成就基础上 发展起来的。这种20世纪50年代发展起来的细胞核移植 技术，使人们可以从一个细胞中取出整个细胞核（含完 整的基因组），并将其转移到去核卵中，此卵可发育生 长成完整的个体，并带有外源性的全套基因。 1. 超级小鼠 1981年 Brinster和Palmiter将大鼠生长激素因子与 小鼠金属硫蛋白的基因连在一起，构成MT1GH基因－> 微注到小鼠受精卵中－>在植入假孕鼠子宫中－>发育生 长－>共产出21只小鼠，其中7只带外源基因，而其中6 只小鼠大1倍左右，这即著名超级小鼠或巨鼠。
五、转基因动物常用的方法 为使外源基因进入种系（germ line），将外源基因 转入受体（生殖）细胞，从导入基因方式划分，可有： （一）受精卵原核直接显微注射法 （二）胚胎多能干细胞介导法
（三）精子载体导入法
（四）逆转录病毒感染导入法 （五）电泳冲法 （一）（五）为直接法，（二）（三）（四）为间 接法，每一方法各有其优缺点，技术成熟程度亦不相同。
①在没有饲养条件，体外培养EK细胞呈悬浮生长，并聚集成许 多团块——简单类胚，随后形成囊胚，并出现神经、肌肉和软骨等 紊乱的细胞和结构。
②将EK细胞注入正常发育的囊胚中，EK将与受体的内细胞团一 起发育共同构成嵌合体。 ③将106～109个EK细胞皮下注射至同种小鼠的胁腹部，将在 3～6周形成由不同类型细胞形成直径达1～2cm的畸胎瘤。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
转基因动物模型
显微注射β淀粉样蛋白基因得到老年痴呆症的 转基因动物模型。 显微注射鼠REN-2肾上腺素基因的到原发性高 血压的转基因动物模型。
为什么要选鼠作转基因动物模型？
人类和鼠基因组同源度高，对它进行比较研究 可以得知很多关于人类疾病和生理机能的信息， 因此了解鼠非常有助于了解人类本身。
由于鼠的饲养成本较低、繁殖周期短，产仔数 多，基因整合率较高，因此成为转基因动物实 验的首选动物。
利用转基因动物反应器生产药用蛋白
转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液生物 反应器等。 抗凝血酶III：转基因绵羊的乳汁中。 β乳球蛋白 红细胞生成素 凝血因子VIII 凝血因子IX 生长激素
小鼠基因敲除和转基因
这两项技术是用来制备目的基因 失活和过度表达目的基因的小鼠。 优势：在体研究基因的功能。
小鼠基因功能的研究是最热的领域之一。 这些技术已使得遗传学、肿瘤学、免疫学、发育生物学等 学科取得了惊人的进步，这些研究潜在的商业性价值不可 估量。
应用和意义：
基因敲除（knock out ）和基因敲入（ knock in） KO过程也称基因打靶(gene targeting)，利用 DNA同源重组，在基因组中的某一特定部位进 行定点的基因置换，用无功能基因替换目的 基因或Delete目的基因。 根据需要（如验证A与B在功能上有某种关 联），在敲除基因A时，将有功能的基因B放 在A基因的位置，即A是KO，B是Knock in。
转基因动物的意义
研究手段：疾病的转基因动物模型。 改良生命：改良动物性状，如抗病性、 耐寒性等。 制造产品：抗体、疫苗等的生产。
基本原理
构建携带目的基因的载体。 导入外源基因：将目的基因通过显微注射等方 法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞 中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动 物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。
以及整合的位点和拷贝数。
转录水平：转基因的mRNA的存在与否以
及表达水平。
蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及
功能检测。
鉴定方法
PCR
Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot
基因转移鼠纯合鼠系的建立
第一节 转基因动物
转基因技术（transgenic technology):将外源基因 导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分 裂而遗传给后代。 转基因动物（transgenic animal ）：用转基因技 术培育出的携带外源基因并能稳定传代的动物。 特点：分子及细胞水平操作 组织及动物整体水平表达 转基因植物（transgenic plant)
正-负选择法筛选择正确整合的ES细胞, 相对较简单。
目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建
获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源DNA导入早期胚胎：
获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养
感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育成
携带外源基因的动物。
4）精子载体法
外源DNA 共育法 脂质体转染法
电穿孔法 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物
DNA 磷酸钙-DNA共沉淀法
DNA
逆转录病毒感染法
电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵 显微注射 四细胞 胚胎
胚胎干细胞
微注射 囊胚 转基因 动物
原肠胚
DNA
逆转录病毒感染 DNA
3. 下游—基因பைடு நூலகம்整合、表达检测 与细胞筛选 染色体基因水平：是否整合了外源基因
2) 胚胎干细胞法
小鼠胚泡发育期的胚胎细胞是可以人工培养 增殖的，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚 泡期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力，成为多能胚胎干细胞 （embryo stem cells, ES 细胞）。 ES细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分 化特性。
胚胎干细胞法
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
转基因的受精卵
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建 中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1、上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、
结构基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引
入易于检测的提示重组体存在的基因。GFP, LacZ, AP, LUC
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与
报告基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼 接成完整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 系
中游—基因转移、胚胎移植与建
DNA显微注射法的特点
快速。 DNA大小无限制，最大可达250Kb。 随机整合：在染色体上整合的位点是随机
的，整合的拷贝数也不一定。转入的基因 有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之 中，干扰该基因的正常表达，影响转基因 动物的正常发育和代谢。
总效率较低(实际成功率1/1000)。
人类疾病的转基因动物模型
各种人类遗传病的鼠模型，如：
老年性痴呆症(Alzheimer’sdisease)、 关节炎(arthritis)、 肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、 肿瘤发生(tumorigenesis)、 高血压(hypertension)、 神经退行性疾病(neurodegenenerative disorder)、 内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、 动脉硬化症及其他很多疾病。
转基因生物与基因打靶
研究基因功能的两个策略
• •
功能缺失(Loss of function)： KO, CKO, RNAi 获得功能(Gain of function)：Transgenic,
virus-based
•
在体 in vivo与离体 in vitro
•
•
描述性报告 vs 机理研究报告
研究设计：假说（可能性）—验证—总结（论文）
生殖系细胞中不 含转入基因
×
生殖系细胞中含 转入基因
转基因杂合鼠
未转基因鼠
子代多次交配可得到纯合 转基因鼠系
二、转基因动物的应用
分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源
基因的功能
建立人类疾病的转基因动物模型
基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器
人类疾病的转基因动物模型
完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发 展，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统 一有效的系统。帮助了解疾病的病因和发展过 程。 转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段。
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚
逆转录病毒感染
纯合体小鼠
嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒DNA插入宿主DNA的机制，将外源目的 基因整合到宿主基因组，呈单一位点单拷贝整 合，整合率高。
反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 DNA(＜10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。
Fertilization
The Zygote and the Blastocyst
DNA显微注射
DNA注射针
精原核 卵原核
持卵管
DNA显微注射
DNA显微注射到尚未发生核融合的受精卵的精 原核。显微镜下观察，精原核比卵原核大， 容易辨别。
线性DNA整合效率比超螺旋DNA高出数倍，因 而用于DNA显微注射的转入基因通常是去除载 体序列的线状DNA。
The dwarf little (lit) mouse is a model for the human hereditary disorder, isolated growth hormone (GH) deficiency type I. In these animals, dwarfism results from an autosomal recessively inherited gene mutation. The GH gene is present but production of GH mRNA is deficient, resulting in reduced serum GH and concomitantly decreased serum somatomedin. Growth retardation is evident by 15 days of age and adult animals reach approximately one-half normal size. Mutant mice of both sexes also exhibit a delayed onset of puberty, with males having a high degree of infertility. As administration of GH restores growth, we reasoned that growth failure in the mutant mice might be corrected by providing them with sufficient GH by gene therapy. Here we demonstrate that although the rat and human GH genes alone do not restore growth in transgenic mutants, a metallothionein-rat growth hormone fusion gene (MTrGH) does. Moreover, the fertility of transgenic mutant males is improved; however, female fertility is impaired.