仪器分析概论 3 液相色谱

的液流，而使用高压输液泵。
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(2) 梯度淋洗（洗提）装置
和气相色谱中的程序升温一样，给分离带来很大的方便。 流动相中含多种不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序 连续改变流动相中溶剂的配比和极性，通过极性的变化来改变被
分离组分的容量因子k 和选择性因子，以提高分离效果。
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实现方式 ：
内梯度: 利用两台高压输液泵，将两种 不同极性的溶剂按一定的比例送入 梯度混合室，混合后进入色谱柱。
适用范围：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性。
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3、离子交换色谱（ion-exchange chromatography）
固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
基本原理：基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相
同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据溶质离子对交换剂具有不 同的亲和力而将它们分离。 阳离子交换：树脂—SO3Na + M+ = R—SO3M + Na+ 阴离子交换：树脂—NR4Cl + X- = R—NR4X + Cl-
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第三节 液相色谱的固定相与流动相
一、液相色谱固定相（stationary phases of LC）
略
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二、液相色谱的流动相（mobile phases of LC）
1. 流动相特性
（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组 成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小 于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱；
作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起
正向作用。(2) 改变流动相极性和pH值也对分离起到 调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作 为流动相也可以增大分离选择性。
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3．操作条件区别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
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液相色谱仪（1）
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液相色谱仪（2）
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消除了本底
(700μS)
电位电导的
影响。 试样阴离子
H2SO4
Retention time
HF HCl
HNO3 H3PO4
转变为相应 的酸，提高 检测灵敏度
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Back Ground： H2CO3 (15μS) Retention time
4、空间排阻色谱（size-exclusion chromatography）
高效液相色谱法
（High Pertormance Liquid Chromatography）
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第一节、高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法：
特指一种以液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典柱色谱法基 础上，引入了气相色谱法的理论，在技术上采用了高压泵、高效分离柱 、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种的液相色谱分析法。 特点： 高压：150-350 105 Pa
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2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质。 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 柱 柱 速：1mL/min 温：50 º C 压：70 104 Pa
废液
抑制器
～ ～
Back Ground： Na2CO3 / NaHCO3
(700μS)
Retention time
NaF
NaCl
NaNO3 Na2HPO4
离子色谱未加抑制柱 Na2SO4
Conductivity ～ ～ Conductivity
Back Ground： Na2CO3 / NaHCO3

故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示：
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1.1 基础理论：

热力学理论：塔板理论 动力学理论：速率理论
高效液相色谱法的基本概念和基础理论与气相色谱法 是一致的，但也有不同，区别主要在流动相。
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1.2 提高柱效的途径
HPLC：H A C u （忽略纵向扩散项后）
高速：1~10 mL/min，一般< 1 h
高效：大于30000 塔板/米,(气相约1000) 高灵敏度：10-9 g （紫外检测）、10-11 g （荧光检测）；所需试样少， uL
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一、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别
GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高 沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对 大多数生化样品不可检测；
极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
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3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分 的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂 中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。
常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六 环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯 甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油 (最小)
应用范围：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。凡是在溶
剂中能够解离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
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离子色谱（ion chromatography）
双柱型离子色谱法： 与离子交换色谱的区别是其采用特制的、具有极低交换容量
的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检
测器，是分离测定混合阴离子的有效方法。 在离子色谱的基本结构组成中，与其他高效液相色谱的重要 不同就是抑制器和电导检测器。
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第三节、影响色谱分离的因素
（factors influenced separation）
1. 基本理论及影响分离的因素与提高柱效的途径
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则
速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，
即：GC：H=A+B/u+C u

HPLC：H=A+C u
电化学检测器
示差折光检测器 总体检测器 对试样和洗脱液总的物理 或物理化学性质有响应 介电最为广泛，约占70%）
工作原理：基于被分析试样组分对特定波长紫外线的选择性吸 收；组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。
优点： 灵敏度高；线形范围大； 对流动相的流速和温度变化 不敏感； 波长可选，易于操作； 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 缺点： 不适用于对紫外光完全不吸收的样品
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色
谱，非极性柱也称为反相柱。
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2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分；
按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗； 常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的
液液分配色谱已极少采用。
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2、液-固色谱（吸附色谱）
（liquid-solid adsorption chromatography）
基本原理：根据物质吸附作用的不同来进行分离 固 定 相：固体吸附剂；如硅胶、氧化铝等，较常使用的是
5～ 10μm的硅胶吸附剂。 流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)。 工作原理：按分子大小分离。小分子可 以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙 ，中速通过；而大分子被排斥在外，出 峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
相对分子质量介于上述两个极限之间
的化合物，将按照相对分子质量降低的 顺序被洗脱。
图 3-3
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淋洗液抑制技术
P74
举例：待检测物质为NaBr，其首先在分离柱中与阴离子树脂发生 阴离子交换 阴离子交换：树脂-OH- + Na+Br- = R-Br- + Na+OHNaOH溶液洗脱→Na+Br矛盾：洗脱液的浓度要高于Br–才可以洗脱，但同时洗脱液的本 底电位相对洗脱出来的Br–的电位太高，导致灵敏度差。 从分离柱流出的洗脱液，通过抑制柱：
外梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀，将两 种或多种不同极性的溶剂按一定的比例 抽入高压泵中混合。
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(3) 进样装置
将试样“浓缩”地瞬时注入色谱柱上端柱单体的中心，成一个小点。

注射器进样； 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，
结构如图所示： P85 色谱柱
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准备
工作
讨论： （1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）
u 1cm / s时，H u u H ，n 柱效 ，但t R
兼顾柱效和分析时间，选择u 1ml / min
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（2）结论
HPLC：H A C u （忽略纵向扩散项后）
1）液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故 降低传质阻力c 是提高柱效主要途径。 2）由速率方程知，降低固定相粒度(使A减小)可提高柱效。
树脂-H+ + NaOH →树脂-Na+ + H2O
树脂-H+ + Na+Br- →树脂-Na+ + H+Br大大提高所测阴离子的检测灵敏度 唯一快速、灵敏和准确分析多组分阴离子的方法。
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NaF,NaCl,NaNO3 Na2HPO4,Na2SO4