β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达
蛋白核小球藻外源基因表达系统的初步建立及其优化
为了初步建立蛋白核小球藻外源基因表达系统并对其进行优化，可以采取以下步骤：
1.构建表达载体：选择适当的启动子和终止子，将外源基因插入
到表达载体中，构建成重组表达载体。
2.转化蛋白核小球藻：将重组表达载体导入蛋白核小球藻中，使
其成为转基因藻株。
可以采用基因枪法、电转化法等基因转移技术进行转化。
3.筛选阳性克隆：通过抗性筛选或荧光筛选等方法，筛选出含有
外源基因的阳性克隆。
4.鉴定和表达分析：通过分子生物学技术和蛋白质组学技术，对
转基因藻株进行鉴定和表达分析，验证外源基因是否成功表达。
5.表达优化：对外源基因的表达进行优化，包括启动子改造、基
因拷贝数增加等方法，以提高外源基因的表达水平。
6.稳定性分析：对转基因藻株进行多代培养和传代，分析外源基
因的遗传稳定性和表达稳定性。
通过以上步骤，可以初步建立蛋白核小球藻外源基因表达系统，并对其进行优化，提高外源基因的表达水平和稳定性。
这一系统有望应用于小球藻的遗传改良和生物能源等领域。
原核表达载体构建步骤
原核表达载体构建步骤构建原核表达载体就像是在微观世界里盖房子，而且是给那些超级小的生物分子住的。
咱得先找好“建筑材料”，也就是目的基因啦。
这目的基因就像是一颗特别的种子，我们要把它种到原核生物这个小花园里。
找目的基因有时候就像大海捞针，在基因的海洋里翻来翻去，直到找到那一颗闪闪发光的“金种子”。
然后呢，要有合适的“地盘”，这就是原核表达载体。
这个载体就像是一块神奇的土地，不过它可不是随随便便的土块，而是经过精心设计的，上面有各种功能区域，就像土地上划分好了不同的功能区一样，有启动子区，这就像是房子的大门开关，决定着基因能不能开始工作，还有终止子区，那是工作结束的信号，就像下班的铃声。
接下来要把目的基因和载体连接起来，这过程就像是用超级胶水把种子粘到土地上。
这个胶水就是连接酶啦，它特别神奇，能准确地把基因和载体紧紧地连在一起，就像把两根细细的线完美地缝起来一样。
在这之前，还得对载体和目的基因进行处理，就像给土地松松土，给种子去去壳。
我们要用限制酶在载体和目的基因上切出合适的口子，这限制酶就像一把超级小但无比锋利的剪刀，精确地剪出想要的形状。
构建好之后，还得检查一下有没有问题呀。
这就像是房子盖好了要验收一样。
要看看基因有没有正确地连接，就像检查房子的结构有没有稳固。
有时候如果出了差错，那就像盖歪了房子，一切就得重新来啦。
把构建好的原核表达载体送进原核细胞这个小家园，就像把种好种子的花盆放到温室里。
原核细胞会像勤劳的小园丁一样照顾这个载体，让目的基因开始表达，生产出我们想要的蛋白质。
这蛋白质就像是花朵或者果实，是我们精心构建载体的最终收获。
整个过程充满了各种惊喜和挑战，有时候一个小失误就像在蛋糕里放错了盐，整个味道就全变了。
但当一切顺利的时候，就像是在微观世界里创造了一个小奇迹，那些小小的分子按照我们的意愿开始工作，感觉自己就像一个微观世界的大魔法师呢。
原核表达载体构建虽然复杂又繁琐，但就像一场充满乐趣的微观冒险，每一步都充满了未知和期待。
A30Pα-synuclein原核表达载体的构建及表达
（ ｅ ｒ ｍ ｅ ｔｏｆＰａ ｈ０ｐ Ｄ ｐａ ｔ ｎ ｔ ｈｙｓ０ ｏ ｉ １ ｇｙ， Ｗ ｅｆ ｎｇ Ｍ ｅ ｉａｌＵ ｎｉ ｒ ｉｙ，Ｗ ｅｆ ｎ ６１ ３，Ｃｈｉ ） ｉａ ｄｃ ｖｅ ｓｔ ｉａ ｇ ２ ０５ ｎａ
济 宁 医学 院 学 报 ２ １ 年 ４月第 ３ ０２ ５卷 第 ２期
９ ７
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人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达
人雌激素受体β绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达李慧;安莲效;郭静;顾月清【摘要】目的构建人雌激素受体β(EBβ)绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体,并稳定转染乳腺癌MCF-7细胞.方法通过双酶切将pCMV5-hERβ中的人ERβ cDNA克隆到pEGFP-C3中,构建并鉴定重组质粒pEGFP-hERβ,然后转染乳腺癌MCF-7细胞,采用G418(500 μg/mL)筛选出稳定转染的细胞系,在荧光显微镜下观察融合蛋白质在真核细胞内的表达分布,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测ERβ的mRNA转录水平.结果成功构建重组表达载体pEGFP-hERβ,有效转染并筛选出稳定转染ERβ基因的MCF-7细胞系,外源性ERβ基因在MCF-7细胞中获得了有效转录,并在细胞质和细胞核中均广泛分布.结论建立了稳定表达ERβ的MCF-7细胞系,为筛选ERβ调节荆和进一步研究ERβ在乳腺癌中的作用及其机制奠定基础.%Purpose To construct a es trogen receptor β (ERβ) green fluorescent protein eukaryotic expression vector and to transfect stably MCF-7 breast cancer cells.Methods The cDNA of human ERβgene was cloned into pEGFP-C3 from pCMV5-hERβ by double digestion to create recombinant plasmid pEGFP-hERβ.The recombinant plasmid was identified and transfected into MCF-7 cells.Then stable transfectants were selected byG418.The expression and localization of ERβ in MCF-7 cells were assayed by fluorescence microscopy.The transcription of ERβ in the s tably transfected cells was also examined by RT-PCR.Results The ERβ green fluorescent protein eukaryotic expressio vector was successfully constructed and effectively transfected into MCF-7 cells.Then the stably ERβ-transfected MCF-7 cell line was screened.The transcription ofexogenous ERβ in transfected cells was confirmed, and the ERβ was abroad distributed in the cytoplasm and nucleus.Conclusion The stably ERβ-transfected MCF-7 cell line was established.It has provided an important basis for screening E Rβ modulators and furtherly investigating the involvement of ERβ in breast cancer as well as its mechanism.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2011(032)001【总页数】4页(P18-21)【关键词】雌激素受体β;载体构建;转染;MCF-7细胞【作者】李慧;安莲效;郭静;顾月清【作者单位】中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,江苏,南京,210009【正文语种】中文【中图分类】Q78乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%。
原核表达载体构建步骤
原核表达载体构建步骤一、前期准备1. 首先呢，咱们得把要用的材料都找齐喽。
像目的基因啦，原核表达载体还有各种酶，比如说限制性内切酶之类的。
这一步看起来简单，可千万别小瞧它哦！要是少了啥，后面就麻烦了。
我就有次忘记检查有没有足够的载体，结果做到一半才发现，那叫一个懊恼啊！2. 对了，关于目的基因，你得确定它的序列是正确的。
这一点真的很重要，真的！我通常会再检查一次，毕竟如果基因序列错了，后面做的可能都是白搭。
你是不是也担心这个问题呢？二、载体和目的基因的处理1. 接下来就要处理原核表达载体和目的基因了。
先用限制性内切酶去切割载体和目的基因。
这个过程得小心点儿哦！酶切的条件要设置好，像温度呀、反应时间啥的。
我一般会按照说明书上的推荐值来设置，不过有时候也会根据实际情况微调一下。
这一步其实还蛮关键的，如果酶切不完全，后面连接的时候就容易出岔子。
2. 酶切完之后呢，要对产物进行纯化。
这个纯化的步骤你可以根据自己实验室现有的设备和试剂来选择合适的方法。
我觉得只要能把想要的东西纯出来就行啦，不用太纠结具体用哪种方法。
三、连接反应2. 在这个连接反应进行的时候，要注意反应的环境。
温度要保持稳定，最好放在专门的恒温设备里。
不然的话，连接反应可能就不能很好地进行啦。
这一点大家一定要注意哦！四、转化1. 连接产物弄好之后，就可以进行转化了。
把连接产物导入到感受态细胞里面。
这个感受态细胞的制备也是个重要的事儿。
不过如果你不想自己制备的话，也可以买现成的。
导入的时候呢，要按照操作规程来，可不能马虎。
我记得我刚开始做的时候，就因为没严格按照步骤来，转化效率特别低，那个时候真是欲哭无泪啊。
2. 转化完了之后，要把细胞放到合适的培养基里面培养。
这个培养基的选择也要看你的细胞类型和实验需求哦。
在培养的过程中，要注意观察细胞的生长状态。
如果发现有什么异常，就得想想是不是前面哪个步骤出问题了。
五、筛选阳性克隆1. 等细胞长起来之后，就要开始筛选阳性克隆了。
稳定表达β-synuclein的SH—SY5Y细胞株的构建
ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｎ 对 帕 金 森 病 发 病 神 经 保 护 作 用 的研 究 奠 定 了 良好 的基 础 。
【 关键词 】 Ｂ － ｓ ｙ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｎ ； 帕金森病 ； 稳 定 表 达
【 中圈分 类号】Ｑ ９ ５ － ３ ３
【 文献标 识码】Ａ
【 文章编 号】１ ０ ０ ５ － ４ ８ ４ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ － ０ ０ ７ ５ ０３ －
２ ０１ ３ 年 ４月
中 国 实 验 动物 学报
ＡＣ ＴＡ ＬＡＢＯＲＡＴ ＯＲＩ ＵＭ ＡＮＩ ＭＡＬ Ｉ Ｓ ＳＣ Ｉ ＥＮ 【 Ａ Ｓ Ｉ ＮＩ Ｃ Ａ
Ａｐ ｉ ｒ ｌ ， ２ ０１ ３ Ｖ０ １ ． ２ｌ Ｎ ｏ． ２
第２ ｌ 卷
第 ２期
稳定表达 １ ３ － ｓ ｙ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｎ的 Ｓ Ｈ— Ｓ Ｙ ５ Ｙ细胞 株 的构 建
Ｄｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ５－ ４８ ４ ７ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ２ ． ０ ０ １ ６
Ｅｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈｍ ｅ ｎｔ ｏ ｆ ａ ｎｅ ｕｒ ｏ ｂｌ ａ ｓ ｔ ｏ ｍａ ＳＨ － Ｓ Ｙ５ Ｙ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎｅ ｓ ｔ ａ ｂｌ ｙ
ｃ ｉ ｎ ．Ｔ ｈ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｂ － ｓ ｙ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｈ ｉ ｓ ｔ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ，ｉ ｎ ｓ ｉ ｔ ｕ ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ ．
蛋白表达 载体构建
蛋白表达载体构建
蛋白表达是指通过转基因技术将感兴趣的蛋白基因导入到宿主细胞中，并使其在细胞中高效地表达出来。
载体构建是实现蛋白表达的关键步骤之一。
载体是指在转基因技术中承载外源基因并将其导入宿主细胞中的一种DNA分子。
常见的载体有质粒和病毒等。
载体构建主要包括以下几个步骤：
1. 选择合适的载体：根据蛋白表达的要求选择合适的载体，常用的质粒载体有pET、pGEX、pcDNA等，常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
2. 提取载体：从细菌或其他适当的宿主中提取合适的载体，通常通过菌落PCR 或限制性内切酶切割等方法获得目的载体。
3. 构建目的载体：将目的基因插入到载体的适当位点上，并将其连接起来。
此步骤可以通过PCR扩增得到目的基因片段，再经过连接酶作用与载体连接。
4. 归一化载体：经过构建后的载体需要通过测序和限制性内切酶切割等方法验证其正确性，确保目的基因已经成功插入到载体中。
5. 转化宿主细胞：将构建好的载体导入到宿主细胞中，可以通过化学方法、电穿孔、电转化等手段完成。
6. 选择和筛选：经过转化后的宿主细胞进行培养和筛选，通常使用抗性标记和报告基因等方法来筛选带有目的基因载体的细胞。
7. 表达和纯化：经过筛选后的细胞进行大规模培养，使目的基因在细胞中高效表达。
随后可以通过蛋白纯化的方法获得目的蛋白。
总的来说，载体构建是实现蛋白表达的重要步骤，通过合适的载体选择、目的基因插入和转化宿主细胞等步骤，能够实现外源基因的高效表达。
Exendin-4Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其纯化的开题报告
Exendin-4Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表
达及其纯化的开题报告
一、选题依据：
随着生物技术的发展，越来越多的融合蛋白被构建和应用于生物医学和工业生产领域。
Exendin-4Tβ4融合蛋白具有治疗糖尿病和愈合创伤的潜力，因此对其构建、表达和纯化进行研究具有重要意义。
二、研究内容：
本研究的主要内容包括：
1.设计Exendin-4Tβ4融合蛋白的基因序列，构建原核表达载体。
2.将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌中，进行表达。
3.对表达产物进行纯化的优化研究，找到最优的纯化条件。
4.对获得的纯化产物进行生化特性分析，包括分子量、活性和稳定性等方面的研究。
三、研究意义：
Exendin-4Tβ4融合蛋白是一种具有很高应用价值的重组蛋白，可在治疗糖尿病和促进创伤愈合等方面发挥作用。
本研究的结果将为其在生物医学和工业生产方面应用提供支持和参考。
四、研究方法：
1.基因合成和克隆：根据序列设计构建Exendin-4Tβ4融合蛋白的重组质粒。
2.转化及表达：将重组质粒转化到大肠杆菌，并通过诱导表达目标蛋白。
3.蛋白纯化：采用不同的纯化方法对重组蛋白进行分离纯化，并对
纯化后的样品进行鉴定和分析。
4.蛋白质特性分析：对获得的重组蛋白进行生物学特性、生化学特性、结构特性等方面的分析。
五、预期结果：
本研究预期利用原核表达系统构建出 Exendin-4Tβ4融合蛋白的重组质粒，并通过表达和纯化得到纯度高、活性强、稳定性好的重组蛋白。
同时，对其生化特性进行了深入研究，为其应用提供了实验数据和支持。
荧光蛋白真核表达载体的构建及其瞬时表达
荧光蛋白真核表达载体的构建及其瞬时表达孙婷婷a，高晓莲a，ba浙江理工大学生物工程所，浙江杭州（310018）b休斯顿大学生物学与生物化学研究所，美国TX77004-5001E-mail:suntingting1218@摘要：荧光蛋白易于和其他蛋白融合，且融合后的荧光蛋白仍能保持荧光激发活性的优点广泛地应用于细胞学，医学和分子学领域。
然而，随着荧光蛋白研究方法的发展对荧光蛋白的种类也提出了更多的要求。
而传统的获得荧光蛋白的方式主要局限于从生物体内直接提取或通过定点诱变和突变的技术获得，而对利用基因合成的方法合成新型荧光蛋白的研究则很少。
本文基于微流体芯片合成获得新型荧光蛋白的基础上，构建真核质粒载体pcDNA3.1(+)-G2-hexaHis，通过转染进入HeLa细胞内进行表达，结果显示G2在真核细胞中可以大量表达，且荧光强度很强，亚细胞定位结果显示荧光蛋白G2绝大部分存在于细胞质中，极少部分分布在细胞核中，故荧光蛋白G2将成为真核细胞质中蛋白的定位，细胞骨架标记和细胞分裂，胞质蛋白表达强度等同时也可以应用于细胞核中特异蛋白的标记及核质间物质运输应用中很有潜力的工具。
关键词：真核载体构建；转染；亚细胞定位荧光蛋白被证实是活体生物成像的良好工具，被广泛的应用于生物学的不同领域。
例如细胞骨架和细胞分裂，细胞器动力学和囊泡运输，细胞核和细胞质之间的物质运输，蛋白质之间的互作，蛋白质定位，基因转录强度等的测定[1-4]。
近几十年来，绿色荧光蛋白通过和其他蛋白融合标记不同蛋白的在亚细胞中的分布及动力学或标记细胞中的不同分区和器官[5,6]。
而且随着荧光蛋白变体类型和数量的扩充，其荧光蛋白涉及的新的应用技术也不断展现，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光双分子和多分子标记技术、双分子荧光互补技术、荧光双杂交技术（F2H）等[7-10]。
传统获得荧光蛋白变体的方法局限于通过从生物体直接提取或利用定点诱变和突变的方法获得，此方法不仅费时耗资金，且不能高通量获得目的荧光蛋白变体。
Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其纯化的开题报告
Exendin-4/Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表
达及其纯化的开题报告
尊敬的评委和各位专家：
本次开题报告介绍的是“Exendin-4/Tβ4融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其纯化”。
本项目的目的是构建Exendin-4/Tβ4融合蛋白原
核表达载体，并进行表达及纯化，为后续的生物学研究奠定基础。
Exendin-4是一种治疗2型糖尿病的药物，它通过增强胰岛细胞的胰岛素分泌来降低血糖。
Tβ4是一种多功能肽，具有促进细胞增殖、迁移、重生等生物学功能，且能够抑制炎症反应和细胞凋亡。
将Exendin-4和T β4融合在一起，可以发挥两种肽的生物学功能，具有治疗糖尿病和其他
疾病的潜力。
本项目将使用PCR技术构建Exendin-4/Tβ4融合基因，并将其克隆
到原核表达载体pET-28a中。
该载体具有强大的诱导表达能力，并且能
够添加His标签，方便后续纯化。
将构建好的载体转化到大肠杆菌中进行表达，通过SDS-PAGE等方法检测表达情况。
融合蛋白的纯化是本项目的重要环节。
我们计划使用His-Tag亲和
层析技术进行纯化，根据蛋白的理化性质和组分，选择适当的条件进行
纯化。
使用Western blot、质谱等逐步确认纯化效果，并对蛋白的生物学特性进行初步研究。
通过本项目，可以获得Exendin-4/Tβ4融合蛋白的原核表达和纯化
方法，并初步研究其生物学特性，为后续的研究奠定基础。
谢谢大家的听取！。
β-synuclein真核表达载体的构建
回收 ４ ９ｂ 大小的 目的片段 ， Ｂ ｍ Ｉ Ｘ ｏ 双 １ ｐ 与 ａ Ｈ 和 ｈＩ 酶切 的质粒 ｐＤ Ａ ． 用 Ｔ Ｄ Ａ连 接酶 连 接 ， 【 ｅＮ ３１ ４Ｎ ４ｃ ＝ 反应 １ 。转化 Ｄ ５ ６ｈ Ｈ ａ感 受 态 细 菌 ， 转 化 的菌 液 将
１３ 克隆载体 ｐ Ｕ —一一 ｎｃ ｉ ． Ｃ ｍ Ｔ８ｓ ｕｌ ｎ的构建、 ｙ ｅ 鉴定和 序列测定 Ｐ Ｒ产物与 ｐ Ｕ ． Ｃ Ｃ ｍ Ｔ载体按 ２ １ 摩尔 ：（
比） Ｔ Ｄ Ａ连 接酶 作 用下 进 行 连 接 ， 连 接 过 在 ４Ｎ ４℃ 夜 。取 ５ 连 接反应 液转 化 Ｄ ５ｔ 受 态 细菌 ， Ｈ ｃ感 将 转化 的菌液 涂 在 ｘ ｇｌ ＩＴ ．ａ 和 Ｐ Ｇ处 理 过 的含 有 氨 苄
山东 医药 ２ １ ０ ０年第 ５ 第 ｌ Ｏ卷 ５期
１ｓｎ ｃ ｉ ３ ｙｕｌ ｎ真核 Nhomakorabea 达 载体 的构 建 － ｅ
郭军 堂 ’ 苗新东 ， 同美 。 ， 刘 王 婷 。 安琪 。 晓栋 陈 崔 （ 潍坊 医学院 ， 东潍坊 ２ １５ ） 山 ６０３
摘要： 目的 克 隆人 １ｓｎ ｃ ｉ 因并构建 真核表达载体 ｐＤ Ａ ．－ ． ｎ ｃ ｉ， ３ ｙ ｕｌｎ基 一 ｅ ｅ Ｎ ３ １１ｓ ｕｌ ｎ 为帕金森病发病机制 的研究 ３ｙ ｅ 奠定基础 。方法 从人胎脑组织中提取总 Ｒ Ａ ， Ｒ －Ｃ Ｎ 用 Ｔ Ｐ Ｒ方法 获得人 Ｂｓｎ ｃ ｉ 因的全长 ｅ Ｎ 将其插 入 ． ｕｌ ｎ基 ｙ ｅ Ｄ Ａ， 经 限制性 内切 成 功构建 了 Ｂｓｎ ｃ ｉ 核表达 载体 ． ｕｌｎ真 ｙ ｅ ｐ Ｕ － 体中； Ｃ ｍ Ｔ载 序列 测定后 ， 重组携带 ｐｓｎ ｅ ｉ 因的表达载体 ｐ Ｄ Ａ ． ． ｙｕｌｉ。结果 ・ ｕｌ ｎ基 ｙ ｅ ｅ Ｎ ３ １Ｂｓｎ ｅ ｎ ｅ 酶酶切分析 、Ｃ Ｐ Ｒ和 Ｄ Ａ序列测定证 实 目的基因 已插人重组 质粒。结论 Ｎ ｐＤ Ａ ． － － ｎｅｅ ； ｅ Ｎ ３ １１ ｓ ｕｌｉ 该载体可用 于帕金森病的相关研究 。 ３ｙ ｎ 关键词 ： — ｎ ｅ ｉ 因 ； ｐｓ ｕｌ ｎ基 ｙ ｅ 帕金森病
Abd-Bcr／Abl原核表达载体的构建和表达
ａ ｌｃ ｂ ＤＮＡ ＮＭ
一
通信作者简介 ： 梁英民 ， 第四军 医大学 ， 唐都 医院 血液科 陕西 西
安 ７ ０ ３ ： － ｉ：ａ ｇｍ＠ ｆ ｕ ｅｕ ｃ ｏ １０ ８ Ｅｍａｌｌｎ ｙ ｉ ｍｍ ．ｄ ．ｎ
维普资讯
第 ８卷
第 ９期
２０ ０ ８年 ５月
科
学
技
术
与
工
程
⑥
Ｖｏ ． Ｎ ． Ｍａ ０ ８ １８ ｏ９ ｙ２ ０
１７ —８９ ２０ ） －３ １０ ６ １１ １ （０ ８ ９２ ３ —４
Ｓ ｅ ｃ ｃ ｎｏｏ ｙ ａ ｄ Ｅｎｇｎ ｅ ｉ ｃｉｎ ｅ Ｔｅ ｈ ｌｇ ｎ ｉ ｅ ｒｎｇ
研究 表 明 ， 蛋 白 对 白 血 病 的 生 成 具 有 促 进 作 该
用 ， 国外 大 量研 究 表 明 Ａ ｄ在 Ｂ ｒＡ ｌ Ｔ 介 导 ｂ ｃ／ ｂ Ｐ Ｋ
的 白血 病 生 成 中起 重 要 作 用 ｊ ｃ／ ｂ Ｐ Ｋ介 ，Ｂ ｒＡ ｌ Ｔ
导 的 白 血 病 生 成 活 性 依 赖 于 碳 末 端 的 Ａｄ 存 在 ， ｂ
占菌体 总蛋 白的 ６ ， ％ 纯化后达到 ７ ．％ ，Ｗｅｔ ｎｂ ｔ 测为特异性表达 ， ４３ ｓ ｒ ｌ 检 ｅ ｏ 为进 一步研究该 蛋 白对慢 性 白血病 细胞 的作用 奠
定 了分 子 基 础 。
关键词
慢性髓 细胞 性 白血 病
Ｂ ｒＡ ｌ 因 ｃ ｂ基 ／
肌 动蛋 白结合域 （ ｂ ） Ａ ｄ
载体 ｐ Ｔ２ ，构 建 ｐ Ｔ２ —ｂ 重 组 表 达 质 粒 ， 酶 切 、 序 鉴 定 ， 列 、 码 框 均 正 确 。 通 过 转 化 Ｅ ｃｌ Ｂ２１（ Ｅ ） 经 Ｅ ３ａ Ｅ ３ ａＡ ｄ 经 测 序 读 ｏｉ Ｉ Ｄ３ ，
SYN-B的构建与表达的开题报告
人α-突触核蛋白表位核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B的构建与表达的开题报告题目：人α-突触核蛋白表位核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B的构建与表达的开题报告一、研究背景和意义阿尔茨海默病是老年人常见的神经系统退行性疾病，其特征是神经元丧失、神经纤维缠结，脑内神经元紊乱和功能失调。
目前，阿尔茨海默病的治疗方法仍然非常有限，而且只能缓解病情而不能治愈病情。
因此，需要寻找新的治疗方法来缓解病情。
α-突触核蛋白是阿尔茨海默病的一个重要抗原，它在病理过程中扮演着重要角色。
α-突触核蛋白是突触形成和维持的神经元结构蛋白，在阿尔茨海默病中表达下降，导致神经元的病理性损失和认知功能障碍。
因此，α-突触核蛋白已成为阿尔茨海默病的新治疗靶标之一。
因此，本研究旨在构建一种人α-突触核蛋白表位核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B并探讨其在小鼠体内的表达，为阿尔茨海默病的治疗提供新的方法和思路。
二、研究内容和方案本研究将利用基因工程技术，构建一种人α-突触核蛋白表位核酸疫苗pVAX1-IL-4/SYN-B。
该疫苗的构建分为以下几个步骤：1.搜集α-突触核蛋白的表位序列利用生物信息学技术和已有的研究，搜集α-突触核蛋白的表位序列。
2. 合成表位核酸根据α-突触核蛋白的表位序列，利用化学合成技术人工合成表位核酸。
3. 构建表位核酸疫苗质粒通过PCR扩增表位核酸，将其克隆入表达载体pVAX1中，形成表位核酸疫苗质粒。
4. 加入IL-4和SYN-B基因序列将IL-4和SYN-B的基因序列扩增后，克隆到表位核酸疫苗质粒中，形成pVAX1-IL-4/SYN-B表位核酸疫苗质粒。
5. 鉴定和筛选将构建好的表位核酸疫苗质粒转染至细胞中，利用PCR、Western blot等方法进行鉴定和筛选，确定表位核酸疫苗质粒的构建成功。
6. 动物实验将成功构建的表位核酸疫苗质粒注射至小鼠体内，观察表位核酸疫苗质粒对小鼠免疫系统的影响及对α-突触核蛋白的免疫保护作用。
新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化
新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化周春芳;马石楠;陈云;李东升;于莉;王小莉;郭兴荣【摘要】Objective To construct the Prokaryotic expression vector of human betatrophin(h-betatrophin) gene and induce the expression of betatrophin recombinant protein,and purify target protein,which makes preparation of the production of Betatrophin protein polyclonal antibody and lies a foundation for research this gene's function.Methods Cloned Betatrophin cDNA sequence in vitro was inserted to PET 32 a (+) expression vector through double enzyme digestion and established the recombinant expression vector h-Betatrophin-PET 32 a.h-Betatrophin-PET 32 a vector was then transformed into E.coli BL 21 (DE 3).The expression of Betatrophin protein was induced with Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in BL 21,and confirmed by SDS-PAGE-commassie blue fast staining solution and western-blot analysis.In addition,the Betatrophin recombinant protein was purified by Ni-NTA His·Bind(R) Resin.Results The recombinant vector h-Betatrophin-PET 32 a was constructed.The epigenetic molecular weight of induced Betatrophin recombinant protein was correct,and high purity Betatrophin recombinant protein was successfully purified.Conclusion Recombinant expression vector h-Betatrophin-PET 32 a was transformed into BL 21 and could efficiently express h-Betatrophin recombinant protein.A large number of homogeneous h-Betatrophin proteins can be obtained by our purification methods.%目的构建人Betatrophin基因(h-Betatrophin)原核表达载体,诱导Betatrophin重组蛋白表达及纯化,为制备Betatrophin蛋白多克隆抗体及其功能研究打下基础.方法体外克隆Betatrophin cDNA序列,酶切后连接到PET32 a(+)原核表达载体上,构建重组载体h-Betatrophin-PET 32 a,然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色及Western blotting检测蛋白表达情况,然后用Ni-NTA His·Bind(R)Resin纯化目的蛋白.结果成功构建Betatrophin基因原核表达载体,诱导表达Betatrophin 重组蛋白表观分子量正确,经纯化后可以得到纯度较高的Betatrophin重组蛋白.结论重组载体h-Betatrophin-PET 32 a转入大肠杆菌BL 21后通过诱导及纯化可获取到纯度很高的Betatrophin重组蛋白,为后期研究Betatrophin基因功能奠定基础.【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2017(041)005【总页数】4页(P454-456,封3)【关键词】h-Betatrophin;载体构建;蛋白表达;蛋白纯化【作者】周春芳;马石楠;陈云;李东升;于莉;王小莉;郭兴荣【作者单位】湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属人民医院消化内科,湖北十堰 442000;湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室,湖北十堰 442000【正文语种】中文【中图分类】R91糖尿病是一种由于体内胰岛素绝对或相对不足以致高血糖为特征的内分泌代谢疾病，它可为分Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病等其他类型，其中Ⅱ型糖尿病所占的比例约为95%以上。
B细胞激活因子原核表达载体构建与纯化-分子生物学论文-生物学论文
B细胞激活因子原核表达载体构建与纯化-分子生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——B 细胞激活因子（ B cell activating factor,BAFF; 又称TNFSF13B,THANK,CD257,BLyS 或TALL1）是1999 年发现的肿瘤坏死因子家族中的一员，是与人体免疫有关的细胞因子[1-3].BAFF 由285 个氨基酸组成，其中1 ~ 46 位氨基酸为胞内区，47 ~73 位氨基酸为疏水的跨膜区，74 ~ 285 位氨基酸为胞外区。
BAFF 位于细胞内的N 端缺少信号肽，C 端在胞外，属于Ⅱ型跨膜蛋白[1-2.BAFF 主要表达在先天免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞及滤泡树突细胞等。
目前已知BAFF 可与3 种受体相互作用，分别是B 细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）[4-5]跨膜激活物与亲环素配体相互作用因子（transmembrane activator and CAML interactor,TACI）[6]及BAFF 受体（BAFF receptor3, BAFF-R, 也叫BR3）[7].其中，BR3 是BAFF 的特异性受体，而TACI 和BCMA同样也是TNF 超家族的另一成员APRIL 的受体。
BR3 是唯一可被可溶性sBAFF 三聚体激活的受体。
同许多TNF 家族成员一样，sBAFF 多以三聚体型式存在，与其受体相互作用，实现其生物学功能[8].在中性或碱性条件下，20 个三聚体型式的sBAFF可通过其Flap 区相互结合，形成类似病毒颗粒的60 聚体型式，并可在酸性条件下发生不可逆的分离[9-10].BAFF 的Flap环为其特有，其他TNF 家族蛋白没有此结构。
三聚体形式的配体与其受体结合并不一定会激活下游信号通路，尤其是对于TACI,只有60 聚体形式的BAFF 才能激活它介导的生物学效应[11].研究发现，BAFF 的异常表达与自身免疫性疾病密切相关。
重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达
重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达杨薇;吴红梅;李佳楠【期刊名称】《江汉大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(045)001【摘要】目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达.方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经KpnI、HindIII双酶切后插入pET-39b(+)载体,构建pET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达.结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中.结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础.【总页数】6页(P77-82)【作者】杨薇;吴红梅;李佳楠【作者单位】江汉大学生命科学学院,湖北武汉 430056;武汉海特生物制药股份有限公司,湖北武汉 430056;武汉海特生物制药股份有限公司,湖北武汉 430056;江汉大学生命科学学院,湖北武汉 430056【正文语种】中文【中图分类】Q81【相关文献】1.穿膜肽-TDRG1重组蛋白原核表达载体的构建 [J], 陈厚仰2.人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达 [J], 孙海涛;杨化强;杨璐军;李正阳;杜谋选;陈宇新;姜晓丹3.重组人可溶性Tim-3原核表达载体的构建及其重组蛋白的优化表达 [J], 白少云;卿吉琳;刘振;谭源福;陈治中4.重组奶牛神经肽Y基因的原核表达载体的构建、表达及纯化 [J], 吴笳笛;费东亮;张才5.抗菌肽PMAP37基因RT-PCR扩增、序列分析及重组原核表达载体构建 [J], 明双喜;刘艳;王沂蒙;江国托因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
糖尿病大鼠视网膜组织突触核蛋白家族的表达
糖尿病大鼠视网膜组织突触核蛋白家族的表达袁爱花;梅妍;周鸿鹰;羊惠君【期刊名称】《眼科新进展》【年(卷),期】2012(032)003【摘要】目的观察突触核蛋白( synuclein)家族三种同源蛋白基因α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在8周糖尿病大鼠视网膜组织中的表达情况,初步探讨其在糖尿病视网膜病变( diabetic retinopathy,DR)中的作用.方法采用限制性片段差异显示聚合酶链反应技术,建立正常和8周糖尿病大鼠视网膜基因表达谱,经生物信息学分析两者差异,初步确定α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein为DR相关基因,并以实时定量PCR和Western blotting方法分别从mRNA和蛋白水平上对三个基因的表达进行验证.结果限制性片段差异显示聚合酶链反应结果显示,糖尿病大鼠α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein表达明显强于正常大鼠；实时定量PCR结果显示,α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在糖尿病大鼠(1.41±0.14、1.30±0.18、1.47±0.15)的表达(相对Ct比值)高于正常大鼠(1.67±0.12、1.62±0.20、1.86±0.26),差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01)；Western blotting显示,糖尿病大鼠三种蛋白的表达(相对A值比值)分别为0.31±0.06、0.60±0.11、0.39±0.09,显著高于正常大鼠(0.19±0.07、0.44±0.09、0.29±0.08),差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01).结论α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein在糖尿病大鼠视网膜组织中表达显著升高,α-synuclein的表达升高可能在DR中起到神经毒性作用,而β-synuclein和γ-synuclein的高表达则可能对神经细胞起到保护作用.【总页数】4页(P215-218)【作者】袁爱花;梅妍;周鸿鹰;羊惠君【作者单位】200030 上海市,上海交通大学医学院附属精神卫生中心遗传研究室;610041 四川省成都市,四川大学华西医学中心基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室;610041 四川省成都市,四川大学华西医学中心基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室;610041 四川省成都市,四川大学华西医学中心基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室【正文语种】中文【相关文献】1.Nogo蛋白受体(NgR)基因沉默对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞密度及突触素表达的影响 [J], 刘文强;王玉波;梁汇珉;李赵伟;李铮;刘学政2.五味子醇甲对APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠脑组织突触素、α-突触核蛋白表达的影响 [J], 周妍妍;刘艳丽;董春雪;闫景东3.α-突触核蛋白在大鼠脊髓损伤后的表达及意义 [J], 钟占琼; 薛清彩; 刘晓芬; 许明珠; 向阳; 张晓4.乳酸菌干预对帕金森病大鼠α-突触核蛋白表达的影响 [J], 张萍; 邵靓; 蔡新勇; 肖斌; 梅松被5.氯胺酮对帕金森大鼠脑内突触素和α-突触核蛋白表达的影响 [J], 江康;陈德鹏;潘瑞华;王莹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达
β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达张爱红;徐雅飞;王建枝【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2006(027)002【摘要】目的构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,为进一步研究β-catenin在神经细胞内与其它蛋白质如tau、PS1的相互作用以及在阿尔茨海默病发病机制中的作用提供一种有用的工具.方法用亚克隆的方法将β-连环素基因插入到真核表达载体pEGFP-C1,重组质粒pEGFP-cat瞬时转染野生型鼠成神经瘤细胞株,并在荧光倒置显微镜下观察转染效率.结果酶切鉴定和测序结果证实编码β-catenin的重组质粒构建成功,免疫荧光技术和免疫印记结果显示β-catenin-GFP 融合蛋白在真核细胞中获得表达.结论成功构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在鼠成神经瘤细胞中表达了β-catenin-GFP融合蛋白.【总页数】5页(P70-73,77)【作者】张爱红;徐雅飞;王建枝【作者单位】同济大学高等技术学院医学技术与护理系,上海,200070;华中科技大学同济医学院病理与病理生理系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院病理与病理生理系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.T细胞衔接活化因子-绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及其在Jurkat细胞的定位 [J], 秦云;高美华;王冰;姬静;张蓓2.利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体 [J], 林朝贵;范林;陈良龙3.绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达 [J], 汪之沫;宁琴4.血管生成素与绿色荧光蛋白融合基因的构建、表达及生物活性 [J], 马百坤;徐东刚;王嘉玺;彭善云;李莉;王利红;邹民吉5.颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达 [J], 何永林;朱道银;伊正君;杨春;徐蕾;王瑜伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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中提 取 总 Ｒ Ａ ， Ｒ —Ｃ Ｎ 用 ＴＰ Ｒ方 法 获 得 人 １ｓｎ ｃ ｉ 因 ， 隆 至 ｐ Ｕ ． ３ ｙｕｌ ｎ基 － ｅ 克 Ｃ ｍ Ｔ载体 中 ，Ｃ Ｐ Ｒ筛选 阳性 克 隆 并 测 序 。将 酶
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【 中图分类号 】 ７２ Ｒ ４
【 文献标识码】Ａ
【 文章编 号】１０ ４ ４ （００ ０ －４５ ３ ０ ５ ８ ７ ２ １ ）６０ ９ － ０
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中 国 实验 动 物 学 报
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Ｄｅ ｅ ｅ ０１ ｃ ｍｂ ｒ２ ０
Ｖｎ ． ８ Ｎｏ ６ １１ ．
第 １ ８卷
第 ６期
１ｓｎｃ ｉ 白原核 表 达载 体 的构 建 与表 达 ３ ｙｕｌｎ蛋 － ｅ
ｐ ｏ ｅｌ ． Ｔｈ ｅ ｏ ｉ ａ ｔｆ ｉｎ ｐ ｏｅｎ ｗａ ｘ ｒ ｓ ｅ ｎ Ｅ．ｃ ｌ Ｂ１ ｒ ｐ ｒｙ ｅ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｕｓｏ ｒｔ ｉ ｓｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｉ ｏｉ ２１． Ｃｏ ｌ ｉ ｎ Ｔｈ ｏ ｒｏ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃ ｏ ｆ ｎｃｕｓｏ ｅｐｒｋａｙ ｔｅｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔ ｒｏ
Ｂ２ Ｌ １中 表达 了 ３ ｓｎｃ ｉ 白。 结 论 －ｙｕｌ ｎ蛋 ｅ
ｓｎｅ ｉ融 合 蛋 白 ， 进 一 步 研究 Ｂｓｎｅｅ ｙｕｌ ｎ ｅ 为 — ｕｌｉ 帕金 森 病 中的 作 用 奠 定 了 良好 的基 础 。 ｙ ｎ在
【 键词 】 ８ ｓｎｃｅ ；帕 金森 病 ；载体 构 建 关 一 ｕｌｉ ｙ ｎ
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陈安琪 刘 学杰 崔 晓栋 刘 江 月 张代 娟 郭 军 堂 ， ， ， ， ，
（ ． 坊 医 学 院基 础 医学 教 学 部 ， １潍 山东 潍 坊 ２ １５ ； ． 坊 医 学 院 附 属 医 院 ， ６０３ ２ 潍 山东 潍 坊 ２ １４ ） ６ ０ １
【 要 Ｊ 目的 摘
构 建人 １ｓｎ ｃ ｉ 因 的 原 核 表 达 载 体 ， 析 其 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 。 方 法 从 人 脑 组 织 ３ ｙｕｌ ｎ基 － ｅ 分
ｗａ ｂ ａｎ ｄ ｂ ｓｏ ｔ ｉｅ ｙ ＲＴ— ＰＣＲ ａ ｄ ｔ ｅ ｎｓ ￣ｅ ｉｔ ｎ ｈ ｎ ｉ ｅ ｄ ｎ ｏ ｐＣＵｍ － ｅ ｔｒｆ ｒｓ ｑｕ ｎ ｉ ． Ｔｈ ａｇ ｔｇ ｎ ｒ ｇ ｎ ｓ ｓ ｂ ｌｎ ｄ Ｔ ｖ ｃｏ ｏ ｅ ｅ ｃｎｇ ｅ ｔ ｒｅ ｅ ｅ ｆａ ｍｅ ｔｗａ ｕ ｅｏ ｅ ｉｔ ＧＥＸ・ ｎｏ ｐ ６Ｐ一 ｖ ｃｏ ｏ ｒ ｃｌ ｎ ｈｅ ｒｎｓｏ ｍｅ ｎ ｏ Ｅ．ｃ ｌ ２ １ Ｔｈｅ ｅ ｐｒｓ ｉｎ ｏ ｓ ｕ ｌｉ ｓ ｉ ｄ ｅ ｔ １ ｅ ｔ ｒｃ ｒｅ ｔｙ ａ ｄ ｔ ｎ ｔａ ｆｒ ｄ ｉｔ ｏ ｉＢＩ ． ｘ ｅ ｓｏ ｆＢ—ｙｎ ｃｅ ｎ ｗａ ｎ ｕｃ ｄ ｗｉｈ