CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响

合集下载

三七提取物对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响

三七提取物对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响周建国;曾耀英;黄秀艳;李海仙;叶雪仪;于哲;臧宁【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2007(23)1【摘要】目的分析三七提取物(SE)对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响,探讨其免疫抑制作用机制。

方法分离小鼠淋巴结细胞,以CFSE染色,加入多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)或者佛波醇酯(PDB)和离子霉素(Ion)进行刺激,以流式细胞仪分析三七提取物对淋巴细胞增殖的影响;用碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期分布。

结果CFSE染色分析显示,SE对ConA或者佛波醇酯(PDB)和离子霉素(Ion)诱导的小鼠淋巴细胞增殖,具有明显的抑制作用(P<0.05),且呈剂量依赖性。

对细胞周期分析表明,随着三七提取物浓度的增加,均能明显阻止淋巴细胞进入S期和G2/M期,而处于亚二倍体峰的细胞数基本不变。

结论三七提取物对小鼠淋巴细胞的增殖有明显抑制作用,它能抑制淋巴细胞进入细胞分裂周期,这种抑制作用表现出明显的周期特异性。

【总页数】4页(P16-19)【关键词】三七;淋巴细胞;细胞周期;细胞增殖【作者】周建国;曾耀英;黄秀艳;李海仙;叶雪仪;于哲;臧宁【作者单位】暨南大学组织移植与免疫研究中心【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.TMB-8对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响 [J], 叶雪仪;曾耀英;黄秀艳;王通;臧宁;周建国;林长乐2.小檗碱对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响 [J], 杜丽蕊;何贤辉;徐丽慧;曾耀英;王青3.三七提取物对小鼠淋巴细胞活化、增殖和腹腔巨噬细胞产生NO的影响 [J], 周建国;曾耀英;黄秀艳;肇静娴;叶雪仪;臧宁;钱中清;何贤辉4.穿心莲内酯对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖及细胞周期的影响 [J], 赵晓慧;曾耀英;慕静静;宋兵5.鹰嘴豆芽素A对小鼠T淋巴细胞体外活化增殖和细胞周期的影响 [J], 林长乐;曾耀英;曾祥凤;赵令斋;黄秀艳;叶雪仪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

CFSE标记人T细胞亚群增殖反应及其在病毒感染性疾病中的应用

CFSE标记人T细胞亚群增殖反应及其在病毒感染性疾病中的应用彭巧丽;李海英;曹振环;田亚坤;陈新月;吴昊;计云霞【期刊名称】《中国病原生物学杂志》【年(卷),期】2008(3)12【摘要】目的探讨应用流式细胞术和活体染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人T细胞亚群增殖反应的方法学及其在病毒感染性疾病中的应用价值。

方法用不同浓度的CFSE标记新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC),分为未刺激组及刺激组。

未刺激组加入CD28,刺激组加入CD28及不同浓度PHA,将细胞培养5～7d后进行染色,采用流式细胞仪检测,观察CFSE、PHA标记的最佳浓度及最佳培养时间,采用CellQuest软件及ModFit软件分析T淋巴细胞各亚群的增殖情况,并对两种分析方法进行比较,在上述最佳实验条件下,采用相同的实验方法分析CMV-pp65肽刺激CMV-IgG(+)HLA-A2(+)者外周血单个核细胞(PBMC)后T细胞亚群增殖情况;结果CFSE标记人外周血单个核细胞(PBMC)的最佳浓度是0.5μmol/L,PHA的最佳刺激浓度为2μg/ml,在此浓度下,最佳培养时间为6d,PHA刺激培养6d后T细胞各亚群出现典型的增殖不同步现象,经CMV-pp65肽刺激后CD8+T细胞出现明显的增殖反应,采用CellQuest及ModFit软件联合分析,可实现淋巴细胞增殖分析的可视化及数量化。

结论CFSE染色结合荧光抗体标记和流式细胞术是分析淋巴细胞增殖的有力工具,可以有效检测出病毒抗原刺激后T淋巴细胞各亚群的增殖反应及增殖动力学,在探讨病毒感染性疾病的发病机制中具有重要价值。

【总页数】5页(P881-885)【关键词】T淋巴细胞;CFSE;增殖反应【作者】彭巧丽;李海英;曹振环;田亚坤;陈新月;吴昊;计云霞【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院【正文语种】中文【中图分类】R511【相关文献】1.T淋巴细胞亚群检测应用于肾移植术后排斥反应与巨细胞病毒感染鉴别中的价值分析 [J], 王晓勃2.T淋巴细胞亚群检测应用于肾移植术后排斥反应与巨细胞病毒感染鉴别中的价值分析 [J], 王晓勃;3.肝细胞生长因子及葡萄糖对人胰腺干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响/妊娠合并慢性骨髓增殖性疾病11例例临床分析/人端粒酶RNA基因荧光原位杂交检测在宫颈细胞学检查中的应用 [J],4.T淋巴细胞亚群检测在肾移植排斥反应与巨细胞病毒感染鉴别诊断中的应用 [J], 侯铸;夏成青;姜永光;韩修武5.流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应 [J], 王敏;张林杰;何金生;葛晓松;陈勇;李柏青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

CFSE标记结合流式细胞术检测单核细胞Siglec-1刺激CD4 +／CD8 +T细胞增殖

文献标识码：Ａ
文章编号：６３４３（０］１００ｌ７１０２１）１７３５６
ＣｏｂｎｅｐｐｌｃｉｎｏｍｉｄａｉａｔｏｆＣＦＳｌｂｅｉｇａｌｗｙｏｅｒｎｈｔｃｉｎｏｈｅＥａｌｎｎｄｆｏｃｔｍｔｙｏｔｅｄｅｅｔｏｆｔ
ｐｏｉｒｔｎｏｒｌｅａｉｆＣＤ４ＣＤ８。Ｔｃｌ．ｅｈｄＣＤ１ｍｏｏｙｅｎｐｒｈｒｌｂｏｄｏａｉｎｓｗｉｈａｕｅｃｒｎｒｙｄｏｅｆｏ／。ｅｌＭｔｏｓｓ４ｎｃｔｓｉｅｉｅａｌｏｆｐｔｔｔｃｔｏｏａｙｓｎｒｍｐｅ
患者Ｃ４Ｄ１单核细胞具有比健康人单核细胞更强的刺激Ｃ４Ｃ８Ｔ淋巴细胞增殖能力；用干扰素一（ＮＦａ刺激增强正常Ｄ／Ｄ当ａＩ）单核细胞Ｓｇｅ表达后，刺激Ｔ细胞增殖能力增强；ｉｌｃ１其用单抗阻断单核细胞Ｓｇｅ后，刺激Ｔ细胞增殖能力减弱。结论ｉｌ１ｃ其
（ＡＣＳ）ａｅｌｈｙｃｎｔｏｌｅｅｉｏａｔｄｂｙｍａｎｄｈａｔｏｒｓｗｒｓｌｅｇｎｅｉ— ｃｉａｔｄｃｌｓｒｉ（ＡＣＳ）ＣＤ４ａｔｃａｔｖｅｅｌｏｔｎｇＭ．ｎｄＣＤ８Ｔｅｌｒｍｅｈｈｙｈ）ｄｃｌｓｆｏｈａｂｏ
ｍｅｈｅｐｏｌｆｒｔｏｌｐｃｙｅｎｏｅｐｌｅｉｓｒｅｆｒｔｅｉｓｉｔｏｎｏｆｔｆｅｔｏｇｌｃ１ｎｎｏｎｙｅｎｔｎｔｏｆｔｒｉｅａｉｎｏｆＴｙｍｈｏｔｓａｄｔｘｏｒｔｏｌｏｈｎｖｅｔｇａｉｈｅｅｆｃｆＳｉｅ一ｉｌｏｃｌｓｏｈｅ

基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立

本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。

免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平孙元袁远仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。

方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。

结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。

对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。

结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。

[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。

过氧化氢和环磷酰胺对辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的作用

过氧化氢和环磷酰胺对辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的作用孟庆勇;徐美奕;高莉莉【期刊名称】《中国辐射卫生》【年(卷),期】2004(13)2【摘要】目的探讨化学因子对辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。

方法采用3H -TdR掺入法观察小鼠脾淋巴细胞增殖的变化。

结果与刀豆球蛋白A(ConcanavalinA ,ConA)同时作用于小鼠脾淋巴细胞的 10 - 6 mol L和10 -5mol L的H2 O2 对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖有明显的促进作用 ,H2 O2 在ConA作用于小鼠脾淋巴细胞 5 6h加入 ,H2 O2 对小鼠脾淋巴细胞增殖表现为抑制效应。

当环磷酰胺 (cyclophosphamide ,CP)浓度≥ 10 - 4mol L和≥ 10 -3mol L时 ,CP对脂多糖 (lipopolysaccharide ,LPS)和ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖分别表现为明显的抑制作用。

当H2 O2浓度≥ 10 - 6 mol L和CP浓度≥ 10 - 3mol L时 ,H2 O2 和CP对辐射损伤的小鼠脾淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用。

结论低浓度H2 O2 可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的适应性反应 ,而H2 O2【总页数】3页(P101-103)【关键词】过氧化氢;环磷酰胺;辐射损伤;小鼠;脾淋巴细胞;细胞增殖【作者】孟庆勇;徐美奕;高莉莉【作者单位】广东医学院分析中心【正文语种】中文【中图分类】R818【相关文献】1.当归注射液对辐射损伤小鼠脾细胞增殖的作用 [J], 孟庆勇;徐美奕;高莉莉;黄秀兰;刘玉兰2.养胃合剂对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠脾淋巴细胞体外增殖反应的影响 [J], 朱涛;郭仲之;沈英森3.破布木果提取物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 [J], 朱明;欧亮苗;何巧丽;哈木拉提·吾甫尔;田树革4.褪黑素对小鼠脾淋巴细胞电离辐射损伤的防护作用 [J], 张萱;龚守良;张铭;刘树铮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏

1 材料与方法
1. 1 主要试剂和仪器 CFSE 购自 Molecular Probes 公司; 植物血凝素( PHA) 购自 Sigma 公司; CD3 mAb ( OK3) 为美国宾夕法尼亚大学 Carding 博士惠赠; 结核杆菌低分子多肽抗原 ( Mtb Ag ) 由本室根据文献[ 3, 4] 自制。RPMI 1640 培养液( GIBCO 公司) 补充 2 mmol/ L L 谷氨酰胺、50 mol/ L 二巯基乙醇( 2 ME) 、 1 mmol/ L丙酮酸钠、50 mg/ L 庆大霉素和 100 mL/ L 新生小牛血清( NBS, 杭州四季青公司) 后为完全
[ Key words] Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; Proliferation; T cell subpopulations; Flow cytometry
检测淋巴细胞激活后的增殖反应是免疫学实验研究中的基本技术, 传统方法有同位素( 3H TdR) 掺入法和形态学方法, 也有用 MTT 法, 以及 BrdU 标记法等技术。这些检测方法均不能反映不同淋巴细胞亚群的增殖状态。1990 年, Weston 等用活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯 ( Carboxyfluo rescein diacetate, succinimidyl ester, CFDA SE ) , 也常简称为 CFSE, 标记淋巴细胞研究迁移活动[ 1] 。随后 Lyons 等[ 2] 用其检测淋巴细胞的增殖反应。CFSE 是非极性分子, 可自由扩散进入细胞, 在胞内酯酶水解后产生具有荧光特性的 CFSE, 并与胞内蛋白的赖氨酸等胺基发生不可逆偶联, 形成稳定的大分子荧光

流式细胞术检测细胞毒方法的建立

流式细胞术检测细胞毒方法的建立王晓祺;谭岩;段秀梅;刘玲丽;方艳秋;姜艳芳;许淑芬;刘力华【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2004(020)010【摘要】目的:建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法.方法:用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞,再用碘化丙碇(PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞.效靶比为100:1～6.25:1,共孵育时间为1～6小时,流式细胞仪收集1 000个靶细胞并测定被杀细胞的百分率.结果:CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料,18小时后也能很好地区分效靶细胞;靶细胞的自然死亡率低于5%;杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加.最佳效靶比为50:1～25:1,共孵育时间为2～4小时.结论:CFSE/PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点:避免放射性试剂的应用,敏感性增强,单细胞水平的分析.【总页数】4页(P704-707)【作者】王晓祺;谭岩;段秀梅;刘玲丽;方艳秋;姜艳芳;许淑芬;刘力华【作者单位】吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院肿瘤生物治疗中心,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院肿瘤生物治疗中心,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立 [J], 黄鹏程;周长慧;李申宁;常艳2.流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较 [J], 蔡思齐;邓志辉3.活细胞标记和流式细胞术应用于体外检测巨噬细胞吞噬活性的方法建立 [J], 王佳佳; 王磊; 宋兴辉; 李艳伟; 郭春; 黄莹莹; 刘丽4.Vero-E6细胞培养中汉坦病毒抗原流式细胞术检测方法的建立及与ELISA、IFA 方法的比较 [J], 邓海英;杨占秋;江珍玉;刘颖娟;陈文;刘媛媛5.流式细胞术检测体内细胞毒效应方法的研究 [J], 傅晓岚;杨空明;王莉;吴玉章因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

流式细胞仪检测P-selectin和t-PA的方法学评价及临床应用

［－Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅＰ — ｓｅｌｅｃｔｉｎａｎｄｔ－ＰＡＷｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＦＡＣＳＡｒｒａｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒ —
５５０００２，Ｃｈｉｎａ；２．ＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００１，Ｃｈｉｎａ）
［关键词］流式细胞仪；方法学评价；冠心病；Ｐ选择素；组织型纤溶酶原激活物［中图分类号］Ｒ３３１．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１６７１ — ８３４８（２０１６）３４ — ｇ／Ｌ，ｔ－ＰＡ的浓度范围为（９．５９－＿２４－．１３）～（２８．７２ ±２．１５）ｎｇ／ｍＬ，与对照组相比，差异有统计学意义（Ｐ＜ｏ．０５）。结论
ＦＡＣＳＡｒｒａｙ流式细胞仪检测系统检测血清Ｐ — ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ｔ－ＰＡ的分析性能符合规定的性能指标，能够满足实验室认可的需要。

CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响

◇实验方法学◇CFSE 示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T 淋巴细胞增殖的影响包晶晶,林海霞,马　璟(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心,上海　201203)收稿日期:2009-12-30,修回日期:2010-03-18基金项目:科技部“十一五新药创制”重大专项资助课题(No2008ZX093052006);上海市科委企业技术创新团队项目资助(No 08430516200)作者简介:包晶晶(1983-),女,硕士生,E 2mail:jjb19831@g mail .com;马　璟(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,通讯作者,Tel:0212508003332106中国图书分类号:R 2332;R 329.24;R 331.125;R 979.1;R 979.5文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)06-0828-05摘要:目的　利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu 2orescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。

方法　环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE 染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。

结果　对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27117h 和22188h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31153h 和43132h 。

结论　通过数学拟合法对CFSE 数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。

关键词:CFSE;定量分析;数学拟合;流式细胞仪;淋巴细胞增殖;环磷酰胺传统的测定淋巴细胞增殖的方法只能通过细胞数量的变化来反映细胞增殖的的变化,不能更深入的洞察细胞增殖是如何被改变的。

应用四色荧光标记流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的变化

应用四色荧光标记流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的变化鲍依稀;黄振国;祝绚;李进;林伟基【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2007(23)2【摘要】目的探讨四色荧光标记流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测鼻咽癌患者服用云芝丹参胶囊后外周血淋巴细胞亚群:辅助性T淋巴细胞(CD4+),抑制性和细胞毒T淋巴细胞(CD8+),B淋巴细胞(CD19+),NK(CD16+CD56+)细胞的绝对数和百分率等的变化。

方法收集鼻咽癌患者27例,设立中药组和安慰剂对照组,采用四色荧光标记流式细胞术对服用云芝丹参胶囊后的鼻咽癌患者外周抗凝全血的淋巴细胞亚群CD4+细胞、CD8+细胞、B细胞、NK细胞进行绝对计数和相对计数,并对两组结果进行比较分析。

结果四色荧光标记流式细胞术结果显示:接受放射治疗的鼻咽癌患者在服用云芝丹参胶囊16周后,外周血T淋巴细胞的绝对数和百分率,以及Ts、Th细胞绝对数的下降均明显低于安慰剂组(P<0.05);中药组和安慰剂组NK 细胞百分率的变化均显著增高(P<0.05);但两组NK细胞绝对值的变化不存在明显差异(P>0.05)。

结论云芝丹参能明显减轻放射治疗对鼻咽癌患者的淋巴毒性。

【总页数】3页(P202-204)【关键词】四色荧光标记流式细胞术;淋巴细胞亚群;鼻咽癌【作者】鲍依稀;黄振国;祝绚;李进;林伟基【作者单位】重庆医科大学免疫学教研室临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室;香港中文大学医学院化学病理学系【正文语种】中文【中图分类】R446.6;R285.6【相关文献】1.六色荧光标记流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用 [J], 杨晓红;庄宇;杨俊逸2.流式细胞术四色荧光分析人脐血和外周血树突状细胞的前体细胞亚群的设门方法[J], 史敦云;汪明春;张琼丽;许蕴3.流式细胞术双色免疫荧光标记观察寻常性银屑病患者外周血淋巴细胞亚群 [J], 王禾;王萍;徐佳4.流式细胞术检测慢性再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及临床意义 [J], 林静华;焦晓阳;蔡应木;李微;王雪华5.应用流式细胞检测技术检测肺炎支原体患者外周血T淋巴细胞亚群的变化 [J], 靳一姬;尤绍函因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化

素（ＰＨＡ）和佛波酯（ＰＭＡ）培养７２ｈ对淋巴细胞分裂与增殖的影响．并采用ＥＬＩＳＡ法检测不同刺激剂
对淋巴细胞上清ＩＦＮ￣／质量浓度的影响．０．１２５ｍＬ的抗ＣＤ３／２８抗体和５或１Ｏｇ／ｍＬ的ＰＨＡ可
ｏｆＮｏｎ—ＣｌｉｎｉｃｌａＤｒｕｇＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｎｄａＰＫ／ＰＤＳｔｕｄｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ
中图分类号：Ｒ４４６
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２— ０９４６（２０１７）０２— ０１２９— ０６
ＣＦＳＥ— －ｌａｂｅｌｅｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｓｓａｙｓｆｏｒａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＴｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ
Ｖｏ１．３３Ｎｏ．２
Ａｐｒ．２０１７
ＣＦＳＥ法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化
薛妮娜坤，董凯，来芳芳，黄蕊，陈晓光ｈ
（１．中国医学科学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室／创新药物非Ｉ临床药物代谢及ＰＫ／ＰＤ研究北京市重点实验室，北京１０００５０；２．天津红日药业股份有限公司，天津３０１７００）

流式细胞仪筛选环磷酰胺诱导骨髓嗜多染红细胞微核的技术方法

流式细胞仪筛选环磷酰胺诱导骨髓嗜多染红细胞微核的技术方法刘仕杰;方展强【摘要】Objective To discriminate whether chemical compounds are micronuclei-inducing by counting the ratio of bone marrow micronucleus polychromatic erythrocytes ( MNPCE) dyed with a single fluorescence reagent ( acriding organe, AO) by single-laser flow cytometry.Methods Treating male KM mice and SD rat with cyclophosphamide ( CP) respectively, and counting their frequencies of micronucleated polychromatic erythrocytes ( MNPCE) as well as frequencies of micronucleated normochromatic erythrocytes ( MNNCE ) in bone marrow by AO and a single_laser flow cytometer (FCM), comparing and analyzing the results from different methods.Results The results showed that, along with increasing dose of CP, the ratio of MNPCE also corresponding increase, suggesting significant quantative-efficiency correlation.MNPCE were also counted manually by fluorescence microscopy, and the results showed no significant difference with that by flow cytometry.Conclusions AO_FCM fully automated detection method for the detection of MNPCE and MNNCE in mice and rat bone marrow micronucleus rate is reliable.%目的：利用单一荧光试剂吖啶橙（ acridine orange， AO）和简单的单激光流式细胞仪（ FCM）计数骨髓嗜多染红细胞的微核率，达到了解化合物诱导微核作用的目的。

环磷酰胺对小鼠B、T淋巴细胞及巨噬细胞活力的影响

环磷酰胺对小鼠B、T淋巴细胞及巨噬细胞活力的影响
王彩英;邢善田;周金黄
【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】1984(000)001
【摘要】近十多年来，对环磷酰胺（CY）免疫药理作用进行了广泛的研究并取得了明显的进展，如发现它是一高效免疫抑制剂，特别是对B淋巴细胞具有明显抑制作用。

【总页数】4页(P56-59)
【作者】王彩英;邢善田;周金黄
【作者单位】第三军医大学药理教研室;军事医学科学院药理毒理研究所;第三军医大学药理教研室;军事医学科学院药理毒理研究所;第三军医大学药理教研室;军事医学科学院药理毒理研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.饲喂酸奶不同时间对小鼠巨噬细胞和脾T淋巴细胞功能的影响 [J], 范志红;宋锦萍;汪涛;钟萍;南庆贤
2.佛手多糖对环磷酰胺造模小鼠巨噬细胞的影响 [J], 黄玲;邝枣园;张敏;李苑
3.环磷酰胺对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响 [J], 张艳芬;许重洁;杨保胜;张光谋
4.刺玫果与环磷酰胺对小鼠巨噬细胞功能的影响 [J], 王永兰;李玉清
5.鼠白细胞介素-12质粒联合小剂量环磷酰胺对荷瘤小鼠NK及巨噬细胞功能的影响 [J], 潘毅;邵传森;沈建根
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化

CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【摘要】研究不同刺激剂对人外周血淋巴细胞增殖与活化的影响.采用密度离心法分离人外周血淋巴细胞,并采用1μmol/L 的CFSE进行标记,通过流式细胞术技术检测刺激剂抗CD3/28抗体、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培养72 h对淋巴细胞分裂与增殖的影响.并采用ELISA法检测不同刺激剂对淋巴细胞上清IFNγ质量浓度的影响.0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体和5或10 μg/mL的PHA可以显著诱导CFSE绿色荧光逐渐递,形成类似"五指峰"样图谱,说明这两者具有很强的诱导淋巴细胞分裂与增殖的作用.相比之下,单用PMA促进淋巴细胞分裂与增殖的作用较弱.此外,抗CD3/28抗体、PHA和PMA均可增加淋巴细胞IFNγ的分泌,但其作用强度如下:抗CD3/28抗体>PHA>PMA.采用CFSE标记法检测淋巴细胞增殖的实验,得出抗CD3/28抗体和PHA是高效的淋巴细胞活化刺激剂,而且最佳质量浓度分别为0.125 μg/mL和10 μg/mL.%The aim of this pa per is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human peripheral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentratio n of 1μmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phytohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNγ content that reflects the acti vation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125μg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10μg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a "Multi-peak" pattern inflow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNγ secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNγ in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell function, this paper concluded that both anti-CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 μg/mL and 10 μg/mL, respectively.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(033)002【总页数】6页(P129-134)【关键词】淋巴细胞增殖;CFSE;干扰素γ;流式细胞术【作者】薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【作者单位】中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室,北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R446肿瘤免疫治疗己成为继手术、化疗和放疗之后的第四种常用的肿瘤治疗方法.肿瘤免疫治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫能力，从而控制和杀灭肿瘤细胞.而效应T淋巴细胞是诱发有效的抗肿瘤免疫反应的主要执行者，行使对肿瘤细胞的识别和消灭作用[1].在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过上调一些免疫检查点分子的配体，与T淋巴细胞表面这些共抑制性受体(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，从而抑制T细胞的增殖与活化，形成肿瘤免疫逃逸微环境[2-3].目前，绝大多数上市或处于临床研究阶段的抗肿瘤免疫药物都是通过抑制T细胞的负性调控信号，通过激活T淋巴细胞的增殖和活性，强化T细胞的免疫应答，最终达到抵御肿瘤细胞增长的目的.因此，T淋巴细胞的增殖与活性水平的检测是细胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗肿瘤免疫药物研发中一个重要的考察指标[4].氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法被广泛用于淋巴细胞增殖的检测.但是其需要使用放射性同位素标记，具有潜在的污染，并且不容易大批量操作.其次，还有一些研究者采用MTT或MTS的方法检测淋巴细胞增殖.虽然MTT或MTS的操作方法相对简单，但灵敏性不高，且此方法不适合检测一些具有氧化还原性作用的药物，这类药物可直接与MTT反应，造成假阳性.此外，3H-TdR掺入法和MTT/MTS法均是以细胞的数量来反应增殖的变化，不能反应细胞的分裂情况，且无法测定不同亚群淋巴细胞的增殖情况[5-6].羧基荧光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE)染色是一种有效的检测淋巴细胞分裂与增殖的方法.CFSE可穿过细胞膜，不可逆地与细胞内的氨基共价结合偶联到细胞内蛋白.在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记的荧光可平均分配到两个子代细胞中，出现连续的荧光强度递减现象，在流式细胞术检测过程中出现类似“五指峰”的特征[7-8].抗CD3/28抗体、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小鼠脾或人外周血T淋巴细胞增殖.目前，文献中尚未对这些刺激剂促进T淋巴细胞增殖的强度进行比较.而且报道的这些刺激剂的最佳有效剂量也不尽相同.因此，本文采用CFSE标记法检测不同刺激剂诱导人外周血淋巴细胞分裂与增殖的活性，为验证肿瘤免疫药物的活性提供有效的评价方法.1.1 全血健康志愿者的抗凝血购自中国食品药品检定研究院.1.2 主要试剂人外周血淋巴细胞提取分离液购自达科为生物技术有限公司.CFSE、PMA、和PHA购自Sigma公司，人源抗CD3、CD28抗体购自美国Miltenyi?Biotec公司.人源IFN γ 的ELISA检测试剂盒购自cloud-clone公司.RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公司.1.3 主要仪器FACSVerse流式细胞仪为美国BD公司产品，Synergy H1多功能酶标仪为美国Bio-Tek公司产品，CO2培养箱为日本三洋公司产品，冷冻离心机为美国Sigma 公司产品.2.1 淋巴细胞的制备将健康志愿者的抗凝血与PBS混合，再缓慢加至淋巴细胞分离液中(这三者的终体积比例为1∶1∶1)，室温，800 r/min离心30 min.小心吸取中间的一层薄而致密的白膜(淋巴细胞层)至另一层离心管中，用PBS重悬洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×107/mL.2.2 CFSE标记淋巴细胞在上述淋巴细胞悬液中加入CFSE染液(CFSE，终浓度为1 μmol/L)，37 ℃避光孵育10 min，每5 min混匀细胞.加入预冷的2 mL灭活牛血清冰上终止2 min，1 500 r/min离心5 min，用预冷的含10%灭活胎牛血清的PBS洗涤2次.离心，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，计数，将细胞调整为3×106/mL，加入96孔圆底板，每孔100 μL，洗涤及离心过程中注意避光.2.3 流式细胞术检测淋巴细胞增殖活性向上述接种至96孔圆底板的淋巴细胞中分别加入100 μL含不同剂量的刺激剂的RPMI1640完全培养基：抗CD3/28抗体(终质量浓度：0.125、0.5、1、1.5μg/mL)、PHA(终质量浓度：1、5、10 μg/mL)和PMA(终质量浓度：1、5、10 ng/mL).每组实验做三个平行孔，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中继续孵育72h.离心，收集细胞上清，冻于-80 ℃冰箱保存.将细胞用预冷PBS洗涤2次，并用200 μL PBS重悬，采用流式细胞检测仪(BD FACS Verse)检测淋巴细胞的分裂和增殖情况，并采用Flowjo 7.6软件计算淋巴细胞增殖情况(CFSE荧光强度减低的细胞百分比)和分裂指数(CFSE荧光强度减低的细胞百分比与CFSE荧光强度不变的细胞百分比的比值).2.4 ELISA法检测淋巴细胞上清IFNγ质量浓度取上述条件下淋巴细胞上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.操作步骤参照试剂盒说明书.简要步骤如下：1)加入100 μL倍比稀释的人源IFNγ标准品及淋巴细胞上清原液，室温静置1 h；2)充分弃上清，分别加入1∶100稀释的IFNγ的一抗，室温静置1 h；3)弃上清，洗涤三次后，加入1∶100稀释后的IFNγ的二抗，室温静置30 min；4)弃上清，洗涤5次后，加90 μL底物(TMB)显色，室温避光放置15 min；5)加50 μL的硫酸终止反应；6)酶标仪450 nmol/L下检测淋巴细胞培养上清液中IFNγ的含量.2.5 统计分析数据采用Mean±SD表示，用SPSS17.0软件对实验数据进行显著性分析，P≤0.05具有统计学意义.3.1 CFSE法淋巴细胞增殖实验中细胞门的确定采用Flowjo 7.6软件对淋巴细胞分裂与增殖进行分析.根据前向散射角(FSC)和侧向角散射(SSC)显示图，发现排除了细胞碎片群外，在正常条件下，淋巴细胞主要分布为左下群，均一度较好的一簇细胞群.在接受不同刺激剂活化后，左下的淋巴细胞群开始往右上方移动，且出现比较散在的细胞群.根据流式细胞术的原理，我们认为在刺激剂活化淋巴细胞后，淋巴细胞出现不同程度的分裂和增殖，其细胞大小和均一度都发生改变，从而显示在右上方散在的细胞群.我们把原始淋巴细胞命名为R1门，刺激剂活化后的淋巴细胞命名为R2门(如图1(A)～(B)所示).且在正常条件下，R1门的细胞具有强的CFSE染色荧光(单峰)；在刺激剂作用下，R2门内增殖的淋巴细胞出现逐渐递减的CFSE染色荧光(多峰)(如图1(C)～(D)所示).3.2 抗CD3/28抗体对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响抗CD3和CD28抗体分别在体外模拟特异性T淋巴细胞活化的第一信号和第二信号，是T淋巴细胞活化常用的刺激剂.我们采用CFSE染色，通过流式细胞术检测抗CD3和CD28抗体对淋巴细胞增殖的影响.如图2(A)～(B)所示，抗CD3/28抗体可以强效地诱导绿色荧光强度逐渐递减，形成类似“五指峰”样图谱，说明抗CD3/28抗体可以显著促进淋巴细胞分裂和增殖.且在0.125～1.5 μg/mL剂量范围内，抗CD3/28抗体诱导的“五指峰”图几乎重叠.对其增殖指数和分裂指数进行统计，如图2(C)～(D)所示，0.125～1.5 μg/mL 的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞增殖百分比基本可达到75%(P≤0.001)，其诱导淋巴细胞分裂指数可达3倍(P≤0.001).但随着抗CD3/28抗体质量浓度的增加，1.5 μg/mL的抗CD3/28抗体诱导淋巴细胞分裂指数反而有所下降.因此，在诱导淋巴细胞增殖实验中，选用终质量浓度为0.125 μg/mL的抗CD3/28抗体即可.3.3 PHA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PHA是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞.对PHA的不同质量浓度进行分析表明，PHA可以剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖.1 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为40.9%和0.69倍.当质量浓度为10 μg/mL 时，PHA促进淋巴细胞增殖的效果最为明显，淋巴细胞增殖和分裂指数为85.7%和4.7倍(如图3所示).3.4 PMA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PMA是PKC信号的激活物，PKC信号在T淋巴细胞活化中占据重要地位.所以PMA也是T淋巴细胞活化常用刺激剂之一.对PMA的不同质量浓度进行分析表明，虽然PHA也可剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖，但其诱导淋巴细胞增殖能力较弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA诱导淋巴细胞增殖指数才到达20%，此剂量下的分裂指数才达到0.2倍(如图4所示).3.5 不同刺激剂对淋巴细胞IFNγ分泌的影响收集不同刺激剂培养淋巴细胞72h后的上清液，采用ELISA法检测IFNγ的质量浓度.如图5所示，0.125 μg/mL抗CD3/28抗体、10 μg/mL PHA和10 ng/mL PMA均可显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌(P≤0.001).但其增加淋巴细胞IFNγ分泌量的顺序是抗CD3/28抗体>PHA>PMA.淋巴细胞增殖实验是评价机体免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年来广泛代替3H-TdR掺入法和MTT显色法的一种快速、无污染的检测淋巴细胞增殖的方法.CFSE染色结合流式细胞术技术能在不同淋巴细胞亚群及单个细胞水平上动态的分析淋巴细胞增殖情况[9-11].小分子药物单独作用在体外几乎不刺激淋巴细胞增殖，需要在淋巴细胞活化的基础上，进一步评价小分子药物调节淋巴细胞增殖的作用.因此，采用CFSE法，寻找不同刺激剂活化淋巴细胞的最佳剂量，是评价调节淋巴细胞增殖的小分子药物的必要前提.本实验采用人外周血提取获得淋巴细胞，在不同剂量的抗CD3/28抗体、PHA和PMA作用下，观察淋巴细胞的增殖和分裂指数.实验中发现，比以往报道用量更低的抗CD3/28抗体(0.12 5μg/mL)即可高效的刺激T淋巴细胞的分裂与增殖[12].5 μg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为75%和3倍，这与Fulcher D等研究者的报道一致[7].由于PHA可以剂量依赖性地增加淋巴细胞增殖与分裂，可根据需要活化的淋巴细胞的强弱选择合适的PHA的剂量，同时，PHA 又便宜.因此，PHA可用于调节淋巴细胞增殖的化合物的大量筛选.相比之下，PKC 信号的激动剂PMA促进淋巴细胞增殖的能力较弱.可能是因为T淋巴细胞的活化需要PKC信号和Ca2+信号共同参与，因此单一的PMA对淋巴细胞的活化作用较弱，需要与离子霉素联用(Ca2+激动剂)可能对显示出更强的促进淋巴细胞增殖的活性.这与Castagna M等人的研究相一致[13].IFNγ是T淋巴细胞活化的重要指标[14-15].实验发现抗CD3/28抗体、PHA和PMA都能显著增加淋巴细胞IFNγ的分泌，也证明了这三类刺激剂对T淋巴细胞的活化作用.并且这三种刺激剂增加IFNγ的分泌的程度与其诱导淋巴细胞分裂与增殖的程度相对应.后续将进一步研究这些刺激剂对不同亚群T淋巴细胞的促增殖作用.【相关文献】[1] LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF A W, et al. Chimeric antigen receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced potential for toxicity in vivo [J]. Cancer immunology research, 2013, 1(1): 43-53.[2] YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation [J]. Nature reviews Drug discovery, 2013, 12(2): 130-146.[3] NIRSCHL C J, DRAKE C G. Molecular pathways: coexpression of immune checkpoint molecules: signaling pathways and implications for cancer immunotherapy [J]. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research, 2013, 19(18): 4917-4924.[4] BOCHAROV G, LUZYANINA T, CUPOVIC J, et al. Asymmetry of Cell Division in CFSE-Based Lymphocyte Proliferation Analysis [J]. Front Immunol, 2013, 4(264): 1-7.[5] 王玲, 王宏, 刘越坚, 等. 利用CFSE标记检测CD8+淋巴细胞增殖[J]. 大连医科大学学报, 2004, 26(4): 262-264.[6] 季宇彬, 冯小燕, 高世勇, 等. 甜菜碱对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版, 2008, 24(4): 385-388.[7] FULCHER D, WONG S. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory[J]. Immunol Cell Biol, 1999, 77(6): 559-564.[8] POPMA S H, KRASINSKAS A M, MCLEAN A D, et al. Immune monitoring in xenotransplantation: the multiparameter flow cytometric mixed lymphocyte culture assay [J]. Cytometry, 2000, 42(5): 277-283.[9] VENKEN K, THEWISSEN M, HELLINGS N, et al. A CFSE based assay for measuringCD4+CD25+ regulatory T cell mediated suppression of auto-antigen specific and polyclonal T cell responses [J]. J Immunol Methods, 2007, 322(1-2): 1-11.[10] GANUSOV V V, MILUTINOVIC D, DE BOER R J. IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data[J]. J Immunol, 2007,179(2): 950-957.[11] 包晶晶, 林海霞, 马璟, 等. CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2010, 26(6): 828-831.[12] THOMAS A K, MAUS M V, SHALABY W S, et al. A cell-based artificial antigen-presenting cell coated with anti-CD3 and CD28 antibodies enables rapid expansion and long-term growth of CD4 T lymphocytes [J]. Clin Immunol, 2002, 105(3): 259-272. [13] CASTAGNA M, TAKAI Y, KAIBUCHI K, et al. Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase by tumor-promoting phorbol esters [J]. J Biol Chem, 1982, 257(13): 7847-7851.[14] 严俊, 姚堃, 周瑶玺. T细胞活化、活化信号和IFN-γ诱生的关系研究[J].免疫学杂志, 1992,8(2): 95-98.[15] MCNANARA M J, HILGART-MARTISZUS I, BARRAGAN E D M, et al. Interferon-gamma production by peripheral lymphocytes predicts survival of tumor-bearing mice receiving dual PD-1/CTLA-4 blockade [J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(8): 650-657.。

环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制作用研究.doc

环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制作用研究[摘要] 研究环磷酰胺对Hela细胞增殖的抑制作用。

采用MTT法测定50、100、200、400μg/mL的环磷酰胺对Hela细胞增殖的影响，结果表明环磷酰胺对Hela 细胞增殖具有抑制作用，且随着环磷酰胺浓度的增加，细胞增殖抑制率也是逐渐增大的。

[关键词]环磷酰胺；MTT法；Hela细胞前言宫颈癌是威胁女性生命健康的妇科肿瘤之一，在全世界范围内发病率和死亡率居妇科恶性肿瘤的第1位，严重威胁着全球妇女的生命安全[1]。

目前晚期宫颈癌多采用保守治疗，环磷酰胺是其化疗较为有效的药物，本研究借助体外培养技术，以不同浓度的环磷酰胺刺激人宫颈癌HeLa细胞，测定其细胞增殖抑制率，为进一步探讨环磷酰胺的作用机制，指导宫颈癌临床用药提供理论依据实验。

1材料Hela 细胞系(人宫颈癌细胞)2 实验方法2.1 普通MTT法实验步骤2.1.1 稀释细胞：用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞，用含5%～10％胎牛血清的培养液将细胞吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度约为5⨯105个/ml；取100μL加入900μL的培养液内，得到浓度约为5⨯104个/ml作为原初浓度的细胞。

对原初浓度的细胞进行1：1倍比稀释，分别得到1：2、1：4和1：8的稀释细胞（细胞浓度约为2.5⨯104个/ml、1.25⨯104个/ml和0.625⨯104个/ml）。

2.1.2 接种细胞：取上述的各浓度的细胞各200μL，接种到96孔板内；一般同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验。

同时，将未知浓度的细胞200μL作为待测样品同样加到96孔板的4个孔内。

2.1.3 培养细胞：同一般培养条件，培养3～5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

2.1.4 呈色：培养3～5天后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20μL，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO150μL，振荡30min，使结晶物充分融解。

活体染料CFDA_SE在淋巴细胞增殖研究中的应用

文章编号:1007-8738(2003)02-109-03活体染料CFDA 2SE 在淋巴细胞增殖研究中的应用肇静娴,曾耀英,何贤辉,王　南,狄静芳,曾　山(暨南大学组织移植与免疫中心教育部重点实验室,广东广州510632)收稿日期:2002-07-24;　修回日期:2002-10-15基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(No.G 1999054303)国家自然科学基金重点资助项目(No.39930230)国家自然科学基金资助项目(No.39670690)作者简介:肇静娴(19752),女,黑龙江鹤岗人,博士生.Tel.(020)85220723,Email :ozms @通讯作者:曾耀英.Application of vital dye CFDA 2SE to study lymphocytic proliferationZHA O Ji ng 2xian ,ZEN G Y ao 2yi ng ,H E Xian 2hui ,W A N G N an ,DI Ji ng 2f ang ,ZEN G S hanK ey Laborotary of Ministry of Education for Tissue T rans plantation and Immunology ,Jinan University ,G uangzhou 510632,ChinaAbstractAIM :T o explore the application value of vital dye CFDA 2SE to study of lymphocytic proliferation.METH ODS :CFDA 2SE staining ,fluorescence antibody labeling ,flow cytometry and related software were used to detect the fluorescence intensity and analysis the pro 2liferation kinetics of lymphocytes and their subsets after stimulation with polyclonal stimulators.RE SU LT S :Lymphocytes divided after stimulation of PDB +ionomycin or ConA for 48h ,manifesting the serial halving of fluorescence intensity.CsA inhibited the prolifera 2tive effect of ConA on lymphocyte s and no CFSE fluore scence halving were seen.Proliferation of CD4+T cells and CD8+Tcells were asynchronous after ConA stimulation for 48h ,which became more obvious at the time of 72h.Proliferation 2related indexs got ten from ModFit T M software showed that the prolifera 2tive effect of ConA on CD8+T cells was stronger than that on CD4+T cells.CONC L USION :CFDA 2SE staining combined with fluore scent antibody labeling and cytometry were powerful tools for analysis of lymphocytic proliferation.K eyw ords :CFDA 2SE;lymphocyte ;proliferation摘要目的:探讨活体染料CFDA 2SE 在淋巴细胞增殖研究中的应用价值。

环磷酰胺实验报告

一、实验目的本研究旨在探讨环磷酰胺在体外对肿瘤细胞的抑制作用，为环磷酰胺在临床肿瘤治疗中的应用提供实验依据。

二、实验材料1. 实验细胞：人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株SGC-7901、人乳腺癌细胞株MCF-7。

2. 实验药物：环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）。

3. 实验试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、DMSO（二甲基亚砜）。

4. 实验仪器：CO2培养箱、酶标仪、倒置显微镜、离心机等。

三、实验方法1. 细胞培养：将人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株SGC-7901、人乳腺癌细胞株MCF-7分别接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁生长至对数生长期时进行实验。

2. 药物制备：将环磷酰胺用DMSO溶解，配制成一定浓度的环磷酰胺溶液。

3. 实验分组：将细胞分为对照组、环磷酰胺低浓度组、环磷酰胺中浓度组、环磷酰胺高浓度组。

4. 实验步骤：（1）取对数生长期的细胞，用RPMI-1640培养基洗涤两次，调整细胞浓度为1×10^5细胞/mL。

（2）将细胞按分组分别加入相应的药物溶液，对照组加入等体积的DMSO。

（3）将细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。

（4）采用MTT法检测细胞增殖抑制率。

5. 数据处理：采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据以均值±标准差（±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。

四、实验结果1. 环磷酰胺对A549细胞的抑制作用：随着环磷酰胺浓度的增加，A549细胞的增殖抑制率逐渐升高，呈现剂量依赖性。

环磷酰胺低浓度组、中浓度组、高浓度组的增殖抑制率分别为（29.2±3.5）%、（49.3±5.2）%、（72.1±6.8）%。

2. 环磷酰胺对SGC-7901细胞的抑制作用：随着环磷酰胺浓度的增加，SGC-7901细胞的增殖抑制率逐渐升高，呈现剂量依赖性。

基于CFSE和PI的流式细胞术测定CTL杀伤率方法的建立及优化

基于CFSE和PI的流式细胞术测定CTL杀伤率方法的建立及优化徐然然1，卫江波2，郑秀玉2，付志浩1，饶春明1，王军志1*（1中国药品生物制品检定所，北京100050；2北京市生物制品研究所，北京100024）【摘要】目的：建立一种基于CFSE和PI的流式细胞术的CTL测定方法。

方法：首先使用CFSE标记靶细胞，利用TNFαTNF模拟靶细胞杀伤, PI染色，流式检测，确定CFSE和PI的浓度及作用时间。

然后利用已确知有较强细胞免疫作用的治疗性乙肝疫苗免疫小鼠，从靶细胞的标记，效应细胞培养时间，效靶作用时间，效靶比几个方面进行研究优化，并最终确定具体实验方法和操作流程。

结果：细胞分为四个组群，可以达到较好的区分活细胞和凋亡细胞。

结论：该方法客观，准确性好，具有创新性，能用于CTL检测。

【关键词】羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯；碘化丙啶；流式细胞术；细胞毒杀伤作用∗通讯作者：王军志（010）67095782, Email: *****************.cnDevelopment and optimization of a novel assay for assessment of cytotoxicity by multiparameter flow cytometry.Xu ranran1，Wei jiangbo2，Zheng xiuyu2，Fu zhihao1，Rao chunming1,Wang juinzhi1* （1 National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products，beijing 100050；2 National vaccine &serum institure，beijing 100024）【Abstract】 Objective: To develope and optimize of a novel assay for assessment of cytotoxicity by multiparameter flow cytometry. Method:To ascertain the concentration and cultured times, firstly, we label the target cell by CFSE and imitate the cytotoxic effect of cytotoxic killer cell to the target cell., then detection on the FCM after stained with PI. Inoculate the mouse with the vaccine which were satisfactory of cytotoxic effect in vitro. After optimizing the requirement of the stained of target cells, the stimulating time of effector cell, action time between target cells and effector cell, we finally confirm theexperimental method and operation procedure.Results: The cells were divided into four groups, dead target cells was well distinguished from the other cells. Conclusion: The method is objective,accurate,innovative，and it can be used to assay the cytotoxic effect in vitro.【Key words】CFSE；PI；flow cytometry；cytotoxicity细胞毒效应的的评价目前主要采用ELISPOT方法测定IFN-γ等细胞因子的标记和LDH（乳酸脱氢酶）释放法进行评价。