CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响
三七提取物对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响
三七提取物对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响周建国;曾耀英;黄秀艳;李海仙;叶雪仪;于哲;臧宁【期刊名称】《免疫学杂志》【年(卷),期】2007(23)1【摘要】目的分析三七提取物(SE)对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响,探讨其免疫抑制作用机制。
方法分离小鼠淋巴结细胞,以CFSE染色,加入多克隆刺激剂刀豆蛋白(ConA)或者佛波醇酯(PDB)和离子霉素(Ion)进行刺激,以流式细胞仪分析三七提取物对淋巴细胞增殖的影响;用碘化丙锭(PI)染色分析细胞周期分布。
结果CFSE染色分析显示,SE对ConA或者佛波醇酯(PDB)和离子霉素(Ion)诱导的小鼠淋巴细胞增殖,具有明显的抑制作用(P<0.05),且呈剂量依赖性。
对细胞周期分析表明,随着三七提取物浓度的增加,均能明显阻止淋巴细胞进入S期和G2/M期,而处于亚二倍体峰的细胞数基本不变。
结论三七提取物对小鼠淋巴细胞的增殖有明显抑制作用,它能抑制淋巴细胞进入细胞分裂周期,这种抑制作用表现出明显的周期特异性。
【总页数】4页(P16-19)【关键词】三七;淋巴细胞;细胞周期;细胞增殖【作者】周建国;曾耀英;黄秀艳;李海仙;叶雪仪;于哲;臧宁【作者单位】暨南大学组织移植与免疫研究中心【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.TMB-8对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖和细胞周期的影响 [J], 叶雪仪;曾耀英;黄秀艳;王通;臧宁;周建国;林长乐2.小檗碱对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响 [J], 杜丽蕊;何贤辉;徐丽慧;曾耀英;王青3.三七提取物对小鼠淋巴细胞活化、增殖和腹腔巨噬细胞产生NO的影响 [J], 周建国;曾耀英;黄秀艳;肇静娴;叶雪仪;臧宁;钱中清;何贤辉4.穿心莲内酯对小鼠T淋巴细胞体外活化、增殖及细胞周期的影响 [J], 赵晓慧;曾耀英;慕静静;宋兵5.鹰嘴豆芽素A对小鼠T淋巴细胞体外活化增殖和细胞周期的影响 [J], 林长乐;曾耀英;曾祥凤;赵令斋;黄秀艳;叶雪仪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CFSE标记人T细胞亚群增殖反应及其在病毒感染性疾病中的应用
CFSE标记人T细胞亚群增殖反应及其在病毒感染性疾病中的应用彭巧丽;李海英;曹振环;田亚坤;陈新月;吴昊;计云霞【期刊名称】《中国病原生物学杂志》【年(卷),期】2008(3)12【摘要】目的探讨应用流式细胞术和活体染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人T细胞亚群增殖反应的方法学及其在病毒感染性疾病中的应用价值。
方法用不同浓度的CFSE标记新鲜分离的人外周血单个核细胞(PBMC),分为未刺激组及刺激组。
未刺激组加入CD28,刺激组加入CD28及不同浓度PHA,将细胞培养5～7d后进行染色,采用流式细胞仪检测,观察CFSE、PHA标记的最佳浓度及最佳培养时间,采用CellQuest软件及ModFit软件分析T淋巴细胞各亚群的增殖情况,并对两种分析方法进行比较,在上述最佳实验条件下,采用相同的实验方法分析CMV-pp65肽刺激CMV-IgG(+)HLA-A2(+)者外周血单个核细胞(PBMC)后T细胞亚群增殖情况;结果CFSE标记人外周血单个核细胞(PBMC)的最佳浓度是0.5μmol/L,PHA的最佳刺激浓度为2μg/ml,在此浓度下,最佳培养时间为6d,PHA刺激培养6d后T细胞各亚群出现典型的增殖不同步现象,经CMV-pp65肽刺激后CD8+T细胞出现明显的增殖反应,采用CellQuest及ModFit软件联合分析,可实现淋巴细胞增殖分析的可视化及数量化。
结论CFSE染色结合荧光抗体标记和流式细胞术是分析淋巴细胞增殖的有力工具,可以有效检测出病毒抗原刺激后T淋巴细胞各亚群的增殖反应及增殖动力学,在探讨病毒感染性疾病的发病机制中具有重要价值。
【总页数】5页(P881-885)【关键词】T淋巴细胞;CFSE;增殖反应【作者】彭巧丽;李海英;曹振环;田亚坤;陈新月;吴昊;计云霞【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院【正文语种】中文【中图分类】R511【相关文献】1.T淋巴细胞亚群检测应用于肾移植术后排斥反应与巨细胞病毒感染鉴别中的价值分析 [J], 王晓勃2.T淋巴细胞亚群检测应用于肾移植术后排斥反应与巨细胞病毒感染鉴别中的价值分析 [J], 王晓勃;3.肝细胞生长因子及葡萄糖对人胰腺干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响/妊娠合并慢性骨髓增殖性疾病11例例临床分析/人端粒酶RNA基因荧光原位杂交检测在宫颈细胞学检查中的应用 [J],4.T淋巴细胞亚群检测在肾移植排斥反应与巨细胞病毒感染鉴别诊断中的应用 [J], 侯铸;夏成青;姜永光;韩修武5.流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应 [J], 王敏;张林杰;何金生;葛晓松;陈勇;李柏青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
CFSE标记结合流式细胞术检测单核细胞Siglec-1刺激CD4 +／CD8 +T细胞增殖
文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ：６ ３４ ３ （０ ］ １ ００ ｌ ７ １０ ２ １） １７ ３ ５ ６
Ｃｏ ｂ ｎｅ ｐｐｌｃ ｉ ｎ ｏ ｍ ｉ ｄａ ｉ ａｔｏ ｆ ＣＦＳ ｌ ｂｅ ｉ ｇ ａ ｌ ｗ ｙ ｏ ｅ ｒ ｎ ｈ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｈｅ Ｅ ａ ｌ ｎ ｎｄ ｆｏ ｃ ｔ ｍ ｔ ｙ ｏ ｔ ｅ ｄｅ ｅ ｔｏ ｆ ｔ
ｐ ｏｉ ｒ ｔ ｎ ｏ ｒｌ ｅａ ｉ ｆＣＤ４ ＣＤ８。Ｔ ｃ ｌ ． ｅｈ ｄ ＣＤ１ ｍｏ ｏ ｙ ｅ ｎ ｐ ｒ ｈ ｒｌｂｏ ｄ ｏ ａｉｎ ｓｗｉｈ ａ ｕ ｅｃ ｒｎ ｒ ｙ ｄ ｏ ｅ ｆ ｏ ／ 。 ｅｌ Ｍ ｔ ｏ ｓ ｓ ４ ｎ ｃ ｔｓ ｉ ｅ ｉ ｅａ ｌｏ ｆｐ ｔ ｔ ｔ ｃ ｔ ｏ ｏ ａ ｙ ｓ ｎ ｒｍ ｐ ｅ
患者 Ｃ ４ Ｄ１ 单 核 细 胞 具 有 比健 康 人 单核 细 胞 更 强 的 刺 激 Ｃ ４ Ｃ ８ Ｔ 淋 巴 细胞 增 殖 能 力 ； 用 干扰 素 一 （ＮＦ ａ 刺 激 增 强 正 常 Ｄ ／ Ｄ 当 ａ Ｉ ） 单 核 细 胞 Ｓｇ ｅ 表 达 后 ， 刺 激 Ｔ 细 胞 增 殖 能 力 增 强 ； ｉｌｃ１ 其 用单 抗 阻 断 单 核 细 胞 Ｓｇｅ 后 ， 刺 激 Ｔ 细 胞 增 殖 能 力 减 弱 。 结 论 ｉｌ １ ｃ 其
（ＡＣＳ） ａ ｅ ｌｈｙ ｃ ｎｔｏｌ ｅ ｅ ｉｏａｔ ｄ ｂｙ ｍ ａ ｎｄ ｈ ａ ｔ ｏ ｒ ｓｗ ｒ ｓ ｌ ｅ ｇｎｅ ｉ— ｃ ｉａｔｄ ｃ ｌ ｓ ｒ ｉ （ Ａ ＣＳ） ＣＤ４ ａ ｔｃ ａ ｔｖ ｅ ｅｌ ｏ ｔｎｇ Ｍ ． ｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｅｌ ｒ ｍ ｅ ｈｈｙ ｈ）ｄ ｃ ｌｓ ｆｏ ｈ ａ ｂ ｏ
ｍ ｅ ｈｅ ｐ ｏｌｆ ｒ ｔｏ ｌ ｐ ｃｙ ｅ ｎ ｏ ｅ ｐｌ ｅ ｉｓ ｒ ｅ ｆ ｒ ｔ ｅ ｉ ｓ ｉ ｔｏｎ ｏｆｔ ｆｅ ｔｏ ｇｌｃ １ ｎ ｎ ｏｎ ｙ ｅ ｎ ｔ ｎｔｏｆｔ ｒ ｉｅ ａ ｉｎ ｏｆＴ ｙｍ ｈｏ ｔ ｓ ａ ｄ ｔ ｘ ｏｒ ｔ ｏｌ ｏ ｈ ｎｖｅ ｔｇａ ｉ ｈｅｅ ｆｃ ｆＳｉ ｅ 一 ｉ ｌ ｏｃ ｌ ｓ ｏ ｈｅ
基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立
本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。
免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平 孙 元 袁 远 仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘 要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。
方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。
结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。
对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。
结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。
[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。
过氧化氢和环磷酰胺对辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的作用
过氧化氢和环磷酰胺对辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的作用孟庆勇;徐美奕;高莉莉【期刊名称】《中国辐射卫生》【年(卷),期】2004(13)2【摘要】目的探讨化学因子对辐射损伤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。
方法采用3H -TdR掺入法观察小鼠脾淋巴细胞增殖的变化。
结果与刀豆球蛋白A(ConcanavalinA ,ConA)同时作用于小鼠脾淋巴细胞的 10 - 6 mol L和10 -5mol L的H2 O2 对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖有明显的促进作用 ,H2 O2 在ConA作用于小鼠脾淋巴细胞 5 6h加入 ,H2 O2 对小鼠脾淋巴细胞增殖表现为抑制效应。
当环磷酰胺 (cyclophosphamide ,CP)浓度≥ 10 - 4mol L和≥ 10 -3mol L时 ,CP对脂多糖 (lipopolysaccharide ,LPS)和ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖分别表现为明显的抑制作用。
当H2 O2浓度≥ 10 - 6 mol L和CP浓度≥ 10 - 3mol L时 ,H2 O2 和CP对辐射损伤的小鼠脾淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用。
结论低浓度H2 O2 可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖的适应性反应 ,而H2 O2【总页数】3页(P101-103)【关键词】过氧化氢;环磷酰胺;辐射损伤;小鼠;脾淋巴细胞;细胞增殖【作者】孟庆勇;徐美奕;高莉莉【作者单位】广东医学院分析中心【正文语种】中文【中图分类】R818【相关文献】1.当归注射液对辐射损伤小鼠脾细胞增殖的作用 [J], 孟庆勇;徐美奕;高莉莉;黄秀兰;刘玉兰2.养胃合剂对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠脾淋巴细胞体外增殖反应的影响 [J], 朱涛;郭仲之;沈英森3.破布木果提取物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 [J], 朱明;欧亮苗;何巧丽;哈木拉提·吾甫尔;田树革4.褪黑素对小鼠脾淋巴细胞电离辐射损伤的防护作用 [J], 张萱;龚守良;张铭;刘树铮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
流式细胞术检测CFSE标记人T细胞亚群增殖反应_王敏
1. 1 主要试剂和仪器 CFSE 购自 Molecular Probes 公司; 植物血凝素( PHA) 购自 Sigma 公司; CD3 mAb ( OK3) 为美国宾夕法尼亚大学 Carding 博士惠赠; 结 核杆 菌低 分 子 多 肽 抗原 ( Mtb Ag ) 由 本 室 根 据 文 献[ 3, 4] 自制。RPMI 1640 培养液( GIBCO 公司) 补充 2 mmol/ L L 谷氨酰胺、50 mol/ L 二巯基乙醇( 2 ME) 、 1 mmol/ L丙酮酸钠、50 mg/ L 庆大霉 素 和 100 mL/ L 新生 小 牛血 清( NBS, 杭 州 四季 青公 司) 后 为 完 全
[ Key words] Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester; Proliferation; T cell subpopulations; Flow cytometry
检测淋巴细胞激活后的增殖反应是免疫学实验 研究中的基本技术, 传统方法有同位素( 3H TdR) 掺 入法和形态学方法, 也有用 MTT 法, 以及 BrdU 标记 法等技术。这些检测方法均不能反映不同淋巴细胞 亚群的增殖状态。1990 年, Weston 等用活细胞染料 羧基 荧光 素 乙 酰乙 酸 琥 珀酰 亚 胺 酯 ( Carboxyfluo rescein diacetate, succinimidyl ester, CFDA SE ) , 也 常 简称为 CFSE, 标记淋巴细胞研究迁移活动[ 1] 。随后 Lyons 等[ 2] 用其检测淋巴细胞的增殖反应。CFSE 是 非极性分子, 可自由扩散进入细胞, 在胞内酯酶水解 后产生具有荧光特性的 CFSE, 并与胞内蛋白的赖氨 酸等胺基发生不可逆偶联, 形成稳定的大分子荧光
流式细胞术检测细胞毒方法的建立
流式细胞术检测细胞毒方法的建立王晓祺;谭岩;段秀梅;刘玲丽;方艳秋;姜艳芳;许淑芬;刘力华【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2004(020)010【摘要】目的:建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法.方法:用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞,再用碘化丙碇(PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞.效靶比为100:1～6.25:1,共孵育时间为1～6小时,流式细胞仪收集1 000个靶细胞并测定被杀细胞的百分率.结果:CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料,18小时后也能很好地区分效靶细胞;靶细胞的自然死亡率低于5%;杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加.最佳效靶比为50:1～25:1,共孵育时间为2～4小时.结论:CFSE/PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点:避免放射性试剂的应用,敏感性增强,单细胞水平的分析.【总页数】4页(P704-707)【作者】王晓祺;谭岩;段秀梅;刘玲丽;方艳秋;姜艳芳;许淑芬;刘力华【作者单位】吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院肿瘤生物治疗中心,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院中心研究室,长春,130021;吉林大学第一医院肿瘤生物治疗中心,长春,130021【正文语种】中文【中图分类】R392【相关文献】1.基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立 [J], 黄鹏程;周长慧;李申宁;常艳2.流式细胞术检测NK细胞的细胞毒作用的两种方法比较 [J], 蔡思齐;邓志辉3.活细胞标记和流式细胞术应用于体外检测巨噬细胞吞噬活性的方法建立 [J], 王佳佳; 王磊; 宋兴辉; 李艳伟; 郭春; 黄莹莹; 刘丽4.Vero-E6细胞培养中汉坦病毒抗原流式细胞术检测方法的建立及与ELISA、IFA 方法的比较 [J], 邓海英;杨占秋;江珍玉;刘颖娟;陈文;刘媛媛5.流式细胞术检测体内细胞毒效应方法的研究 [J], 傅晓岚;杨空明;王莉;吴玉章因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
流式细胞仪检测P-selectin和t-PA的方法学评价及临床应用
［ － Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ ０ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ — ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ － Ｐ Ａ Ｗ ｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｆ ＡＣ Ｓ Ａ ｒ ｒ ａ ｙ ｆ ｌ ｏ ｗ ｃ ｙ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ ， ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｅ ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ｄ ｉ ｆ ｆ ｅ ｒ —
５ ５ ０ ０ ０ ２， Ｃｈ ｉ ｎ ａ； ２ ． Ｂａ ｓ ｉ ｃ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｇｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｇｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ， Ｇｕ ｉ ｙ ａ ｎ ｇ ５ ５ ０ ０ ０ １ ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
［ 关 键 词 ］ 流 式 细胞 仪 ； 方法学评价 ； 冠心病 ； Ｐ 选择 素 ； 组 织 型 纤 溶 酶 原 激 活 物 ［ 中图 分 类 号 ］ Ｒ ３ ３ １ ． １ ［ 文 献 标 识 码］ Ａ ［ 文章编号］ １ ６ ７ １ — ８ ３ ４ ８ （ ２ ０ １ ６ ） ３ ４ — ｇ ／ Ｌ， ｔ － Ｐ Ａ 的 浓 度 范 围为 （ ９ ． ５ ９ － ＿２ ４ －． １ ３ ） ～（ ２ ８ ． ７ ２ ±２ ． １ ５ ） ｎ ｇ ／ ｍＬ， 与对 照组 相 比 ， 差异有统计 学意义（ Ｐ＜ ｏ ． ０ ５ ） 。结 论
Ｆ Ａ Ｃ Ｓ Ａｒ ｒ ａ ｙ流 式 细 胞仪 检 测 系统检 测 血 清 Ｐ — ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ 、 ｔ － Ｐ Ａ 的分 析 性 能符 合 规 定 的 性 能 指 标 ， 能 够 满足 实 验 室认 可 的 需要 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
◇实验方法学◇CFSE 示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T 淋巴细胞增殖的影响包晶晶,林海霞,马 璟(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心,上海 201203)收稿日期:2009-12-30,修回日期:2010-03-18基金项目:科技部“十一五新药创制”重大专项资助课题(No2008ZX093052006);上海市科委企业技术创新团队项目资助(No 08430516200)作者简介:包晶晶(1983-),女,硕士生,E 2mail:jjb19831@g mail .com;马 璟(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,通讯作者,Tel:0212508003332106中国图书分类号:R 2332;R 329.24;R 331.125;R 979.1;R 979.5文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)06-0828-05摘要:目的 利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu 2orescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。
方法 环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE 染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。
结果 对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27117h 和22188h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31153h 和43132h 。
结论 通过数学拟合法对CFSE 数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。
关键词:CFSE;定量分析;数学拟合;流式细胞仪;淋巴细胞增殖;环磷酰胺 传统的测定淋巴细胞增殖的方法只能通过细胞数量的变化来反映细胞增殖的的变化,不能更深入的洞察细胞增殖是如何被改变的。
例如3H 参入法检测增殖时,一组细胞(假定为A 组)摄入3H 的量多于另一个组别(假定为B 组)时会有以下几种可能:①A 中有增殖反应的细胞多于B,但是他们的增殖率相同。
②A 组进入增殖的时间早于B,即实验结束时A 组增殖代数多于B 组。
③A 和B 的分裂率相同,但A 组中每代细胞的死亡数少于B 组。
④A 组细胞的分裂率快于B 组。
而上述这些情况可以用羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )示踪和定量的流式细胞仪方法加以区分。
对于CFSE 法检测淋巴细胞增殖的结果分析,Deenick 开辟了定量分析CFSE 数据的先河[1]通过建模和数学拟合来获取单个细胞水平上细胞增殖的动力学参数如细胞分裂率、死亡率、进入第一代分裂的时间、平均细胞周期、平均分裂数等参数。
目前定量分析的方法已应用在小鼠和人源的的T 、B 细胞检测上[1-4]。
让人惊讶的是,所有的淋巴细胞都遵循相似的动力学和随机的特征。
因此可以标准化该模型来获取关于细胞增殖的信息[5]。
淋巴细胞的增殖有一些关键的参数是实验和分析方法的基础也是本实验中模型拟合的基础。
首先是进入第一代分裂的时间。
T 、B 细胞的分裂是不同步的,主要原因就是它们进入第一代分裂的时间不同[4]。
高斯分布模型和Cyt on 模型都可以用来拟合细胞进入第一代分裂的时间。
其次是每代分裂细胞的死亡率,它决定每一代细胞的丢失数目。
另外一个关键参数是进入分裂前的细胞半衰期,即分裂前细胞的死亡数,除了机械因素造成的细胞死亡外,未被刺激和未分裂的细胞也会死亡。
体内试验研究表明由于去除了刺激增殖的因素,未分裂的细胞的死亡时间会延长。
该死亡过程近似单相指数衰减过程,通过指数拟合即可以获得细胞分裂前的半衰期[2-6]。
本实验主要采用Ha wkins 标准化的较为简单的前体细胞数(p recurs or cohort method )的方法,即通过作图软件和EXCE LL 软件来处理数据。
获取T 淋巴细胞增殖的进入第一代分裂的时间、每代细胞的死亡率、进入第一代分裂前的半衰期等参数,分析了环磷酰胺对淋巴细胞增殖的影响机制。
该数学模拟的方法的原理是认为细胞的分裂和死亡是被随机的独立的过程调控的。
给定起始的细胞数和不同时间点收获细胞的绝对数,即可用两种概率分布来描述细胞,即时间对分裂数的概率分布和时间对死亡的概率分布,就可以计算出t 时间点时单位时间的死亡数和分裂数[5]。
1 材料与方法1.1 材料和仪器 Balb /c 小鼠12只♀♂各半,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,合格证号:SCXK (沪2008-0016);CFSE 染料购自上海贝基生物有限公司;环磷酰胺购自Sig ma 公司(C AS 号6055-19-2);淋巴细胞分离液(200m l )购自上海欧伟达有限公司;RP M I 1640(500m l )购自B i o 2west 公司;胎牛血清(500m l )购自Hycl one 公司;Con A (25mg )购自上海贝基生物有限公司流式细胞仪BD 公司(F AC 2SCalibur T M Fl ow Cyt ometer 342975);二氧化碳细胞培养箱(For ma 公司);离心沉淀机(8022)购自上海手术器械厂。
1.2 给药和染色 将Balb /c 小鼠随机分成两组即对照组和给药组,每组6只,♀♂各半。
给药组给予环磷酰胺,按80mg ・kg-1,连续3d 腹腔注射造成免疫抑制模型。
对照组・828・中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun;26(6):828～31给予生理盐水。
末次给药后24h经眼眶无菌采血,轻轻加到淋巴细胞分离液上层。
2000r・m in-1,离心15m in,轻轻吸取中间白膜层。
将对照组和给药组的淋巴细胞制成细胞池。
用P BS重悬细胞调整细胞浓度为1×1010・L-1,共1 m l。
加入CFSE染液使其终浓度为015mmol・L-1,37℃染色8m in,加入冰冷的RP M I1640培养基终止反应。
1500r・m in-1离心5m in,用P BS洗两次;用含10%胎牛血清的RP2 M I1640培养基重悬细胞调整细胞浓度为5×108・L-1,加入24孔板中,每孔1m l。
加入Con A,使其终浓度为10mg・L-1。
放入37℃CO2培养箱中培养。
分别在培养第18、27、30、42、54、64h取出一孔细胞离心绝对计数细胞数目。
上流式细胞仪检测分裂峰。
并用Modfit软件分析计算每代分裂的细胞数。
1.3 数据分析方法 绝对计数各个时间点的细胞数,并通过流式细胞仪和Modfit软件获取各个分裂代的细胞数后通过以下步骤进行数据的拟合分析。
第1步:将不同时间点获取的每代细胞数进行高斯拟合。
第2步:将每代分裂的细胞数除以2i(i代表分裂的代数)得到前体分裂细胞数,并进行高斯拟合,得到平均分裂代数。
第3步:平均分裂数与获取时间进行直线拟合(y=mx +c)得到进入第一代分裂的时间(t first=(1-c)/m)。
第4步:对细胞分裂前进行单相消除指数拟合得到细胞分裂前半衰期(half2life)y=e-k;half2life=ln(2)/k。
第5步:以平均分裂数和前体细胞总数进行拟合得到每代细胞的死亡率(l oss/divisi on)(l oss/divisi on=12e-k)。
2 结果2.1 各分裂代细胞数 各个时间点获取的细胞数和分裂代数以及每代细胞数见Tab1、2。
2.2 前体细胞数 进入下一次分裂前的细胞即为前体细胞,经每代细胞数/2i变换得来,i代表分裂数。
见Tab3、4。
2.3 进入第1代分裂的时间 通过212的高斯拟合得到每个时间点细胞的平均分裂次数(见Tab5),并以时间点和平Tab1 nu m ber of cells of con trol group of ti m e2ser i esD ivisi on numberTi m e series/h018274052640.500000.225638.27925.17257.2284.0.1.362.86375.44324.27746.11657.2.0.10700.105233.73264.34436.3.0.0.5379.153248.102290.4.0.0.0.3938.254490.5.0.0.0.0.2277.6.0.0.0.0.811.总数500000.226000.125000.172400.262500.386000.Tab2 nu m ber of cells of CP group of ti m e2ser i esD ivisi on numberTi m e series/h018274052640.500000.218000.18040.8500.2076.0.1.0.82523.13550.7598.6110.2.0.6048.91238.34462.14404.3.0.0.11375.120944.84708.4.0.0.0.7785.153192.5.0.0.0.0.1196.6.0.0.0.0.416.总数500000218000106638124703172917260090Tab3 T i m e2ser i es da t a converted to precursor cohortfor ma t of con trol groupD ivisi on numberTi m e series/h274052640.027925.17257.2284.0.1.043188.22162.13873.5829.2.02675.26308.18316.8609.3.00.685.19156.12786.4.00.0.246.15906.5.00.0.0.71.6.00.0.0.13.Tab4 T i m e2ser i es da t a converted to precursor cohortfor ma t of CP groupD ivisi onnumberTi m e sevies/h27405264 018040.0010200.0002316.00000.000 141261.506775.0003799.00003055.000 21512.0022809.5008615.50003601.000 30.001421.87515118.000010588.500 40.000.000486.56259574.500 50.000.0000.000037.375 60.000.0000.0000 6.500・928・中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2010Jun;26(6)F i g 1 F i rst d i v isi on ti m e Tab 5 M ean d i v isi on nu m berTi m e series/hContr ol gr oup CP gr oup 27 1.136 1.20040 1.699 2.31352 2.637 3.171643.6643.8282.4 进入分裂前细胞的半衰期 进入分裂前的细胞半衰期对照组为31151h (见Fig 3)给药组为43132h (见Fig 4)。