重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较

浙江大学学报(农业与生命科学版) 34(4):374~378,2008Journal of Zhejiang University(Ag r ic &Life Sci )文章编号:1008 9209(2008)04 0374 05DOI:10.3785/j.issn.1008 9209.2008.04.004重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较高波1,孙怀昌2,宋成义1(1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009; 2.扬州大学兽医学院,江苏扬州225009)摘 要:为了研究表达在蛋清中的重组人组织激肽释放酶(r hK1)是否与天然组织激肽释放酶具有相似的理化特性,对鸡输卵管暂态生物反应器表达的rhK1与猪胰腺组织激肽释放酶(pK)的理化特性进行比较鉴定.Western blotting检测结果显示,表达在蛋清中的rhK1能被人组织激肽释放酶(hK1)特异抗体识别,与pK无交叉反应,rhK1酶原和成熟酶的分子量约为43kDa和37kDa.理化鉴定结果显示,rhK1在pH7 ~10的范围内活性稳定,而pK在pH8~9的范围内活性较稳定;rhK1和pK均能被Cu2+、F e3+和Al3+完全抑制;rhK1和pK的热稳定性相似,但rhK1在37孵育20min后被显著激活.以上试验结果表明,表达在蛋清中的r hK1分子量正确,理化特性与猪的天然酶相似,具有开发利用价值.关 键 词:鸡输卵管暂态生物反应器;重组人组织激肽释放酶;猪胰腺组织激肽释放酶;理化特性中图分类号:Q7 文献标识码:AG AO Bo1,SU N H uai chang2,SON G Cheng y i1(1.S chool of A nimal Science and T echnology,Yang z hou Univers ity,Yangz hou,J iangs u225009,China; 2.Schoo l of Veter inar y Medicine,Yang z hou Univ ers ity,Yangz hou,J iangsu225009,China)Physical and chemical properties of recombinant human tissue kallikrein and porcine pancreatic kallikrein.Journal of Zhejiang U niversity(Ag r ic &L ife Sci ),2008,34(4):374 378Abstract:T o study the similar ity betw een r ecombinant human t issue kallikrein(rhK1)and nat ur al kallikrein,the physical and chemical pro per ties of rhK1ex pr essed in chicken ov iduct tr ansient bior eacto r and por cine pancreatic kallikr ein(pK)w ere co mpar ed.Western blotting analy sis sho wed the r hK1was r eco gnized specifically by hK1antibody,and tw o bands w ith mo lecular w eig hts of37kDa and43kDa w ere observed,cor respo nding to the mature and pr e enzyme respectively,but pK failed to r eact w ith t he antibody.Bio chemical studies show ed that the rhK1w as stable f rom pH7to pH10,w hile pK was stable fr om pH8to pH9,the activity of rhK1and pK was inhibited co mpletely by Cu2+,Fe3+andA l3+.T he rhK1and pK show ed similar ther mo stability,but r hK1w as act ivated sig nificantly after20minutes wit h37incubat ion.T hese dat a indicated that t he mo lecular w eig ht o f rhK1w as r ig ht,rhK1 and pK had similar t her mo stability,optimal pH value and sensitivit y to io ns,and the chicken ov iduct specific transient expressio n system can be used to pr oduce commercial r eco mbinant pro teins.Key words:chicken o viduct tr ansient bior eact or;recombinant human tissue kallikr ein;po rcine pancreatic ka llikrein;physical and chemica l pro per ties收稿日期:2007 08 09基金项目:江苏省教育厅科研产业化资助项目(JH01 066).作者简介:高波(1975 ),女,江苏扬州人,副教授,从事转基因生物制药研究.E mail:gaob oyzu@.通讯作者:孙怀昌,男,教授,博士生导师,主要从事转基因动物制药方面的研究.T el:0514 ********;E mail:sun78569@ hotm .高波,等:重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较高血压是一种多因素和多基因调控的慢性疾病.虽然现有治疗高血压的化学药物已取得一定成功,但也仅有20%~35%高血压病人的血压能被控制[1].而且长期服药对病人的毒副作用很大.早在1934年,Elliot等就已证明人组织激肽释放酶和血压的平衡有关.大量临床研究表明,尿液中人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,hK1)浓度的高低与高血压的发病率呈负相关.因此,激肽释放酶(kallikrein1,KLK1)一直作为治疗高血压的候选基因,用KLK1基因及重组hK1治疗高血压是当今国际医学领域研究的热点,并在动物模型中获得可喜的进展[2 3]. hK1主要在胰腺、肾脏和颌下腺等外分泌腺中合成,其中胰腺含量最为丰富.目前国内外临床使用的组织激肽释放酶主要来源于猪的胰腺或颌下腺,尚无上市的hK1基因工程产品.本实验室首次用产蛋鸡重组载体注射法使rhK1在鸡蛋清中获得大量表达[4],并将其和猪胰腺组织激肽释放酶进行比较鉴定,以确定其开发利用价值.1 材料与方法1.1 重组酶和试剂含rhK1的蛋清来自含hK1cDNA的输卵管表达重组载体注射鸡[4];表达hK1的真核表达载体pcDNA3 KLK1由本室构建;猪胰腺激肽释放酶纯品pK购自上海第一生化药业有限公司;盐酸 Na 苯甲酸 L 精氨酸乙酯(BAEE)购于上海伯奥生物有限公司;兔抗hK1血清由本室制备;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G 购于Sigm a公司;其余均为上海生物工程公司进口的分析纯级试剂.1.2 rhK1和pK的活性检测在无菌工作台内将含有rhK1的蛋打开,收集浓蛋清于灭菌试管中,用三乙醇胺缓冲液(pH 8.0)适当稀释后,按标准方法[5]进行rhK1的活性测定.将500 L BAEE(3 0mmol L-1)和2 2 mL三乙醇胺缓冲液(67mmol L-1,pH8 0)置于每一试管中,25水浴预热,然后将100 L pK或稀释好的蛋清加入试管中,混匀,用分光光度计分别测定25水浴1min和15min时在波长340nm处的吸收值,最后根据公式算出酶活性.用同样方法进行pK活性测定.阴性对照为不含rhK1的正常蛋清.1 3 rhK1和pK的pH稳定性试验分别用14 4mol L-1H Cl或10mol L-1 NaOH调整酶活性反应缓冲液的pH值至4、5、6、7、8、9、10、11,缓冲液与蛋清的比例为27!1,混合液的pH值与反应缓冲液的pH值保持一致.然后按照1 2节的方法进行酶活性测定.1 4 rhK1和pK的热稳定性试验将载体注射鸡的蛋清和pK用三乙醇胺缓冲液适当稀释后,分别在37、55、75、100水育箱内孵育10、20、30、40、50、60min,然后按照1 2节的方法进行酶活性测定.1 5 rhK1的金属离子敏感性试验将载体注射鸡的蛋清和pK用三乙醇胺缓冲液适当稀释后,分别加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+、Cu2+、Al3+,使离子终浓度为0 01mol L-1,然后参照1 2节的方法进行酶活性测定.1 6 Western blotting分析分别将15 L蛋清、大肠杆菌表达的GST KLK1融合蛋白[6]和20 L pK(含10个单位)与等量的2∀SDS PAGE上样缓冲液混合,煮沸5min后进行SDS PAGE(12%)分离,然后用半干电转移法(350mA 120min-1)将分离的蛋白转移到PVDF膜上.免疫印迹杂交参照文献进行[7],第一抗体为1!6000稀释的兔抗hK1血清,第二抗体为1!10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G.2 结 果2 1 rhK1和pK的pH稳定性为了检验rhK1和pK的pH稳定性及活性范围,根据文献报道的hK1的理化特性[8],以含rhK1的蛋清和pK为试验材料,在不同pH条件下进行酶的活性测定.结果显示在pH值低于6 0的反应体系中,表达在蛋清中的rhK1表现为无或低活性,在pH7~9范围内活性最强,pH 10 0时活性明显下降,pH11 0时活性丧失,这与pK的活性pH范围非常相似,但在pH10 0375第4期浙江大学学报(农业与生命科学版)时,rhK1比pK表现出更强的活性(图1).图1 rhK1和pK的活性pH范围Fig.1 Enzym atic activities of rhK1and pK at different pH con dition s2 2 rhK1和pK的金属离子敏感性为了检验rhK1和pK对金属离子的敏感性,根据文献报道的hK1的理化特性[9],以含rhK1的蛋清和pK为试验材料,在反应体系中加入终浓度为0 01mol L-1的金属离子,然后进行酶的活性测定.结果显示,Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Ni2+等离子对rhK1的活性有不同程度的抑制作用,Cu2+、Fe3+和Al3+能完全抑制其活性,这与pK对金属离子的敏感性相近,但K+、Mg2+和Zn2+对rhK1活性的抑制程度大于pK(图2).图2 rhK1和pK对金属离子的敏感性Fig.2 In hibitory effects of different ions on rhK1and pK2 3 rhK1和pK的热稳定性为了检验rhK1和pK的热稳定性,根据文献报道的hK1的理化特性[10],以含r hK1的蛋清和pK为试验材料,将其在37、55、75、100水育中孵育不同时间后进行酶活性测定.结果显示,rhK1与pK的热稳定性相似,但在37孵育20min条件下r hK1活性较温育前升高6~7倍(图3).图3 rhK1和pK的热稳定性Fig.3 T herm o stability of rhK1and pK376第34卷高波,等:重组人组织激肽释放酶与猪胰腺组织激肽释放酶的理化特性比较2 4 rhK1的分子量Western blotting 分析结果显示,正常蛋清和pK 未出现特异条带,GST hK1融合蛋白为52kDa 的特异条带,含r hK1的蛋清出现约37kDa 和43kDa 的2条带,前者可能是成熟的rhK1,后者可能是hK1的酶原形式(图4).1:无r hK1蛋清;2:大肠杆菌表达的GST hK1融合蛋白;3:猪源性K1;4:含rhK1蛋清;M :低分子量蛋白质mar ker.图4 表达在蛋清中的rhK 1的Western blotting 分析Fig.4 W es tern blotting analys is of rhK1exp ress ed inegg w h ite of vector injected hens3 讨 论本研究结果表明,表达在重组载体注射鸡蛋清中的rhK1的活性pH 范围、热稳定性、金属离子敏感性及分子量等理化特性与天然组织激肽释放酶相似[8 10],提示鸡输卵上皮细胞能合成有活性的hK1.Western blotting 分析结果显示,表达在蛋清中的rhK1能被hK1特异抗体识别,并呈现出37kDa 和43kDa 的2条特异条带.其中,37kDa 的蛋白质与中国仓鼠卵巢细胞表达的rhK1分子量一致[11],但远高于根据hK1氨基酸序列推算的理论值(约26kDa),提示表达的r hK1可能发生了糖基化修饰;而43kDa 的蛋白质很可能是rhK1的酶原形式,其N 端比成熟的r hK1多7个氨基酸,将其切除后便成为具有活性的r hK1[12].将含rhK1的蛋清经37 温育20~30min 后,蛋清中的酶活性较温育前增加6~7倍,提示rhK1可能具有与天然酶相似的自身激活酶原的特性[8],这一结果也支持43kDa 蛋白质是rhK1酶原的推论.Western blo tting 分析结果显示,猪胰腺组织激肽释放酶pK 不能被抗hK1血清识别,T er ashim a 等[13]的研究结果也表明,hK1特异抗体不能抑制pK 的活性,其主要原因是hK1和pK 的氨基酸序列同源性仅为65%.因此,虽然目前临床使用的从猪胰腺或颌下腺提取的K1对治疗人轻中度高血压具有一定的效果,但治疗效果应不及hK1,特别是注射给药有可能诱导免疫应答和出现过敏反应.hK1的等电点为5 6~5 8,pH #4时活性损失相当大(20%),在pH 11时活性基本消失,而在pH 7~10范围内具有较强的活性,这对临床口服K1具有参考价值.尽管给高血压大鼠口服4~6U rhK1表现降血压效应[14],但若用适当缓冲液降低大鼠胃的pH 环境,降血压效应可能更好,这也是临床口服使用的K1制成肠溶性制剂的原因所在.本研究中二价离子比一价离子能更有效抑制hK1和pK 活性,而Cu 2+、Fe 3+和Al 3+则完全抑制酶活性,这和有关文献报道一致[9].提示在纯化hK1和pK时应尽可能避免接触各种金属离子,或者通过使用巯基化合物及EDT A 等螯合剂进行活性逆转.虽然现有治疗高血压的化学药物种类很多,但由于高血压为终生疾病,长期服用不仅药效降低(至多24h),而且具有不同程度的毒、副作用,所以迫切需要开发安全、高效、服用方便的降血压新药.hK1具有活性强、抗消化酶等特点,口服后可以通过消化道粘膜进入循环系统[15],而且对病变组织具有一定的修复作用,是现有化学药物无可比拟的.但目前国内外临床使用的K1多从屠宰猪的胰腺提取,不仅质量难以保证,提纯工艺较复杂,而且存在病原污染等潜在危险.若将rhK1用于人高血压的防治,可能会获得更好疗效.References:[1] Burt V L,Cutler J A,H iggins M ,et al .Tr ends in theprevalence,aw aren es s,treatmen t,and control ofhypertens ion in th e adult U S population.Data from the377第4期浙江大学学报(农业与生命科学版)h ealth examination sur veys,1960to1991[J].Hypertension,1995,26(1):60 69.[2] W an g J,Xiong W,Yang Z,e t 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