猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹
新疆农业大学学报 2008,31(4):83~86Journal of Xinj iang Agricultural U niversity文章编号:1007 8614(2008)04 0083 04猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹刘 焕1,2,冉多良1,王一成2,袁秀芳2,徐丽华2(1.新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐 830025; 2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州 320021)摘 要: 将猪繁殖与呼吸综合征病毒O RF5基因克隆入原核表达载体pET 28a(+)的多克隆位点中,经鉴定后得到重组质粒pET O RF5,将此重组质粒分别转化到受体菌E.coli BL21(DE3)中,并用诱导剂I PT G进行诱导表达, 2h后表达达到高峰。
经15%SDS P AG E电泳检测,表达得到的蛋白大小约为13.75kD。
经W est ern Blott ing分析,表达蛋白能与P RRSV阳性猪血清发生特异性反应,而与阴性血清不反应,具有较好的免疫原性,为研究PRRSV亚单位疫苗奠定了基础。
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒;OR F5;克隆;表达中图分类号:Q786 文献标识码:ACloning,Expression and Immunity Blot of ORF5of PRRSV LIU H uan1,2,RAN Duo liang1,WAN G Yi cheng2,YU AN Xiu fang2,XU Li hua2(1.Co lleg e of Animal M edicine,Xinjiang Agricultural University,U rumqi830025;2.Zhejiang Academy of Ag ricultural Sciences,H angzho u320021)Abstract: T he ORF5g ene of PRRSV w as amplified by PCR w ith a size of375bp.The amplified DNA frag ment w as cloned into pM D18 T,and sequenced.T he result of sequencing show ed that the consistency w as98%compared w ith that of standard strains.Inserted in pET 28a(+),and transform ed in Escher ichia coli BL21(DE3),the frag ment w as ex pressed after induced w ith IPT G.The results of SDS PA GE and Wester n Blotting show ed that the protein w as13.75kD in size and specifically reacted w ith PRRSV posi tive sera from pigs,not neg ative sera.T hese r esults become the base o f researching and producing no vel vaccine and developing effectiv e diagnostic method.Key words: PRRSV;ORF5;cloning;ex pr ession猪繁殖与呼吸综合征(Por cine r eproductive and respiratory sy ndrome,PRRS)以母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征,特别是感染本病后容易导致免疫抑制而继发其他疾病[1,2]。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆、表达与免疫印迹
ｗａ ８ ｃ ｍｐ ｒ ｄ ｗｉｈ ｔ ａ ｆｓ ａ ｄ ｒ ｔａ ｎ ．Ｉ ｓ ｒ ｅ ｎ ｐ Ｔ一 ８ （ ） ａ ｄ ｔａ ｓ ｏ ｍｅ ｎ Ｅｓ ｈ ｒ ｃ ｉ ｓ ９ ｏ ａ ｅ ｔ ｈ ｔｏ ｔ ｎ ａ ｄ ｓ ｒ ｉ ｓ ｎ ｅ ｔ ｄ ｉ Ｅ ２ ａ ＋ ， ｎ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｉ ｃ ｅ ｉｈ ａ
ｔｖ ｅ ａ ｆ ｏ ｉ ｓ， ｏｔ ｅ ａ ｉ ｅ ｓ ｒ ．Ｔｈｅ ｅ ｒ ｓ ｌｓ ｅ ｏｍ ｅ ｔ ｅ ｂａ ｅ ｏ ｅ ｅ ｒ ｈｉ ｇ ａ ｄ ｐｒ ｄｕ ｉ ｖ ｌ ｉ ｅ ｓ ｒ ｒ ｍ ｐ ｇ ｎ ｎ ｇ ｔｖ ｅ ａ ｓ ｅ ｕ ｔ ｂ ｃ ｈ ｓ ｆ ｒ ｓ ａ ｃ ｎ ｎ ｏ ｃｎｇ ｎｏ ｅ ｖ ｃ ｉ ｎ ｖｅｏｐ ｎ ｆｅ ｔｖ ｉ ｇｎ ｓ ｉ ｅ ｈｏ ａ ｃｎｅ ａ ｄ ｄｅ ｌ ｉ ｇ ｅ ｆ ｃ ｉ ｅ ｄ ａ ｏ ｔｃ ｍ ｔ ｄ． Ｋｅ ｒ ｓ： ＰＲ ＲＳＶ ；Ｏ Ｒ Ｆ５； ｃｏｎ ｎｇ； ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｙ ｗｏ ｄ ｌ ｉ ｘ ｅ ｓｏｎ
ｃ ｄｅ ｆＡｇｒｃ ｌｕ ａ ｉ ｎ ｅ ，Ｈａ ｚ ｏｕ ３ ０ ａ ｍｙ ｏ ｉ ｕ ｔ ｒ ｌＳｃｅ ｃ ｓ ｎｇ ｈ ２ ０２ １）
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｓ ｒ ｃ ： Ｔ ｈ Ｒ Ｆ５ ｇｅ ｅＯ ｎｅ ｏｆ ＰＲＲ Ｓ ａ ｍ ｐｌ ｉｄ ｂｙ ＰＣＲ ｔ ｉｅ ｏｆ３７ ｂｐ Ｖ ｗ ｓａ ｉ ｅ ｆ ｗｉｈ ａ ｓｚ ５ ．Ｔ ｈ ｍ ｐｌｆｅ ｅａ ｉｉｄ ＤＮ Ａ ｆ ａ ｅ ｔ ｗａ ｌ ｎｅ ｎ ｏ ｐＭ Ｄ１ 一 ，ａｎ ｅ ｕｅ ｅ ｒ ｇｍ ｎ ｓ ｃ ｏ ｄ ｉ ｔ Ｔ ８ ｄ ｓ ｑ ｎｃ ｄ． Ｔ ｈ ｅ ｕ ｔｏ ｅ ｅ ｃ ｎ ｈｏ ｅ ｈａ ｈｅ ｃ ｎｓｓ ｅ ｃ ｅｙ
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)江苏分离株NJGC ORF5基因的克隆及遗传变异分析
南京 ２０ １） １０４
摘 要 ： 为 了分 析江苏省流行的猪繁殖与 呼吸综合 征病 毒 （ Ｒ Ｓ 的遗传 变异特 征 ， Ｐ Ｒ Ｖ） 采用 Ｒ —Ｃ ＴＰ Ｒ方法 对江
ｒｓｉａｏｙｓｎ ｒｍｅｖｒ ｓ Ｐ ｅｐｒｔｒ ｙ ｄｏ ｉｕ （ ＲＲＳ Ｖ）ｉ ｌｔ ＧＣｆｏ Ｊａ ｇｕＰ ｏ ｉｃ ｓ ａｅＮＪ ｒｍ ｉｎ ｓ ｒ ｖｎｅ ｏ
ＬＩＢｉ ｎ， ＭＡＯ Ｌｉ ， ＨＥ Ｋｏ ｇ ｗａ ｇ， ｎ— ｎ ＬＩ Ｕ Ｙａ ｌ ｎ—ｉ ｎｇ， Ｗ ＥＮ Ｌｉｂｉ — ｎ， ＹＵ Ｚｈ ｎ — ｕ， ｅ ｇｙ ＭＡ０ — ｕａ， Ａｉｈ
江 苏 农 业 学 报 （ ｉｎｓ ．ｆＡ ｒＳｉ），０ １２ （ ）：７ ＪａｇｕＪｏ ｇ ．ｃ． ２ １ ，７ ４ ７ ５～７ １ ８
７５ ７
李
彬， 毛
立 ， 孔旺 ， ．猪繁殖与 呼吸综合征 病毒 （ Ｒ Ｓ 江 苏分 离株 Ｎ Ｇ Ｒ ５基 因的克隆及遗传 变异分 析 ［ ］ 江 何 等 Ｐ Ｒ Ｖ） Ｊ ＣＯ Ｆ Ｊ．
Ｐ Ｒ Ｖ， Ｒ Ｓ 且与 ２ ０ ０ ６年分离的 Ｓ ０ ０ Ｙ ６ ８有更近 的亲缘关 系 ， 体现 了 Ｐ Ｒ Ｖ具有一定 的地域性 。同时 ， ＲＳ 该基 因编码蛋 白 的抗原 表位和抗原性也发生 了变化 。依 据序列推断 Ｐ Ｒ Ｖ Ｎ Ｇ Ｒ Ｓ Ｊ Ｃ株属 于具有 明显地 域性 的高致病性 Ｐ Ｒ Ｖ。 ＲＳ
ｗｉ ｈ ｅ ｒ ｓ ｎ ａｉ ｅｉｏ ａｅ ｓｎ ｔ ｔ ｅ ｒｐ ｅ ｅ ｔ ｔ ｓ ｌｔ ｓｕ ｉ ｇＤＮＡｓａ ｏｔ ｒ ．Ｔ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｗｅ ａ ＲＲＳ ｓ ｌｔ Ｊ ｅ ｏ ｇ ｄ ｔ ｅＮｏ ｔ ｈ ｖ ｔ ｒｓ ｆ ｗａ ｅ ｈ ｅ ｕ ｔ ｓ ｏ ｄ ｔ ｔＰ ｓ ｈ Ｖ ｉ ａｅ Ｎ ＧＣ ｂ ｌｎ ｅ ｏ ｔ ｒｈ ｏ ｈ Ａｍｅ ｉａ ｅ ｏｙ ｅ ｈ ＲＦ ｅ ｅ ｏ ｔａｎ Ｎ ＧＣ ｓ ａ ｅ ０． ％ ｓ ｑ ｅ ｃ ｉ ｌｒｔ ｔ ｈ ｒ ｒｃ ｎ ｇ ｎ ｔｐ ．Ｔ ｅ Ｏ ５ ｇ ｎ ｆｓ ｉ Ｊ ｈ ｒ ｄ ９ ５ ｒ ｅ ｕ ｎ ｅ ｓｍｉ ｉ ｗｉ ｔ ｅ Ｎｏ ｈ Ａｍｅ ｉａ ｒ ｔｔｐ ａ ｙ ｈ ｔ ｒ ｎ ｐ ｏｏｙ ｅ ｃ
猪繁殖和呼吸综合症病毒河南地方株ORF5／6基因的克隆及真核表达
基 因克 隆入 真核表 达载体 ｐＤ Ａ ： ｃＮ ３ ０中，设计不 同引物 自行构建重组质粒 Ｐ Ｄ Ａ Ｏ Ｆ 、 Ｒ ６和 ｐ Ｄ Ａ Ｏ Ｆ ／。 ｃ Ｎ － Ｒ ５Ｏ Ｆ ｃ Ｎ — Ｒ ５６ 运 用磷酸钙法将重组质粒分别瞬时转染 ２３ ９ Ｔ细胞 ，经流式细胞和 ｗ ｓ ｌｉｇ试验分析表 明共表 达重 组质 粒 ＰＤ ｅｔ ｏ ｎ ｂｔ ｃ— Ｎ — Ｒ ５６ 达蛋 白能够与 Ｐ Ｒ Ｖ的阳性血清发 生特异性反应 ，而 ｐＤ Ａ Ｏ Ｆ 一 Ｒ ６在 ２ ３ Ａ Ｏ Ｆ／表 Ｒ Ｓ ｃ Ｎ — Ｒ ５Ｏ Ｆ ９ Ｔ细胞很 难检 测到
行设计引物 ， 由上海英俊生物工程有 限公 司合成 。（ 见表 １ ）
事动物分子病原学研 究
畜 牧 兽 医 科 技 信 息
病毒 （ Ｒ Ｓ 引起 的一种 以母 猪繁殖 障碍和新生 仔猪呼 吸 Ｐ Ｒ Ｖ） 道症状为特征 的传染病 。该病首先暴发 于美国 ， 已传播 到 现 世界各地 ， 给世界养猪 业造成 了巨大 的经济损失 。 Ｒ Ｓ 已 ＰＲ 现
成为危害我 国养猪业发展 的重要疫病 之一 。Ｐ Ｒ 流行病 学 Ｒ Ｓ 非常复杂 ，Ｒ Ｓ Ｐ Ｒ Ｖ急性感染后可 引起 长期 的持续性 感染 ， 猪
猪繁殖与 呼吸综合 征（ Ｒ Ｓ 是 由猪 繁殖 与呼吸综合征 ＰＲ）
因真核表达转 移载体 ， 研究 ｐＤ Ａ Ｏ Ｆ ／ ｃ Ｎ — Ｒ ５６真核表达载体在
２３ ９ Ｔ细胞中的表达 ，为进一步构建假病毒体 系来研究病毒 的结构蛋 白在感染 过程中的功能作用奠定基础 。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析
*基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)项目（No.G1999011901）。
高志强：1974年生，男，博士研究生。
**通迅作者。
Author for correspondence,E-mail:<yhanchun@>.收稿日期：2003-04-17接受日期：2003-05-12农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):283~287·研究论文·猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因的变异分析*高志强郭鑫查振林陈艳红杨汉春**（中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室，北京100094）摘要：从河北、江西猪场中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒（HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002和JX-1/2002）。
采用RT-PCR 方法扩增其完整的基因片段，进行了序列测定，并与其它5个国内毒株的基因序列进行了比较和变异分析。
所有这些毒株的基因均编码200个氨基酸，推导的氨基酸相似性在88.2%~99.0%之间。
其中BJ-4、S1及J1间的相似性较高，在98%~99%之间；HB-1(sh)/2002，HB-2(sh)/2002，JX-1/2002及CH-1a 间的相似性为92%~96%之间。
根据基因核苷酸序列的遗传进化距离，这些毒株可分为两个亚群，BJ-4、S1和J1为一个亚群，与VR2332及疫苗毒株接近；HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002、JX-1/2002和CH-1a 为另一个亚群。
关键词:猪繁殖和呼吸综合征病毒；基因；变异分析Variation Analysis of the Gene of Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus （PRRSV ）GAO Zhi-Qiang GUO XinCHA Zhen-Lin CHEN Yan-Hong YANG Han-Chun**(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine ，Ministry of Agriculture ，China Agricultural University,Beijing 100094,China)Three porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRSV)isolates (HB-1(sh)/2002，HB-2(sh)/2002and JX-1/2002)were obtained from Hebei and Jiangxi Provinces'pig farms.A RT-PCR method was used to amplify the complete gene of the viruses.Variation analysis ofgene of the three isolates and other five published PRRSV isolates in China showed that all ofthese isolates belonged to American type,and percent identity of amino acid ranged from 88.2%to 99.0%.gene among BJ-4,S1and J1had higher similarity,sharing 98%~99%identity of the deduced amino acid.HB-1(sh)/2002,HB-2(sh)/2002,JX-1/2002and CH-1a showed 92%~96%identity among theirgene.Phylogenetic analysis suggested that these isolates could be dividedinto two subgroups according to the genetic distance.BJ-4,S1and J1belonged to one subgroup,which are more close to VR2332and vaccine strains,whereas HB-1(sh)/2002,HB-2(sh)/2002,JX-1/2002and CH-1a belonged to anothersubgroup.porcine reproductive and respiratory syndrome virus;gene;variation analysis猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus ，PRRSV)为动脉炎病毒科成员之一,可引起妊娠母猪流产、早产、产死胎、弱胎、木乃伊胎、仔猪和肥育猪的呼吸道症状。
猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州爿离株ORF5基因原核表达的研究
王 彬， 汤德元 李春燕， 凤 ， ， 王 曾智勇， 张晓杰， 甘振磊 （ 贵州大学动物科学学院， 贵州 贵阳 ５０２ ） ５０ ５
摘 要： 通过对 ＰＲＶ 贵州分离株 （ｕ ｈｕ １Ｒ Ａ 的提取和 Ｒ － Ｃ 方法扩增得到 Ｏ Ｆ 基因， ＲＳ Ｇ ｉｏ－ ）Ｎ ｚ Ｔ ＰＲ Ｒ５ 成功构建原核 表达载体 ｐＴ ３ａ Ｏ Ｆ， Ｅ一 ２— Ｒ５ 转化至宿主菌 Ｂ２ （Ｅ） 诱导蛋 白表达， Ｌ１Ｄ ３ 中， 并对诱导表达蛋白的 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ 电泳和 Ｄ －Ａ Ｅ
猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 （ｏｃｎ 能 够诱 导 产 生 中和 抗体 ， 中和 抗体 由本实验室保存 ； ＲＩｏ Ｓ ｅ ｇ ｎ 、 ｐ ｒｉｅ 且 Ｔ ｚｌ ￣Ｒ ａ ｅ ｔ Ｌ
ｒ ｐｒｏ ｅ ｄｕｃ ｉ ａｎｄ ｒ ｓ ｒ ｔ ｙ ｔ ｖｅ ｅ ｐｉ ａ ｏｒ
ｅ ｓ ｒｐ ｌ ｖｅ ｓ Ｔｒ ｎｓ － ａ ｃ 出现 之 后 ， 血 清 主 要 识 别 Ｇ ５蛋 白。 Ｓｕｐ ｒ ｃ ｉ ｔ ｎ Ｒ ｅ ｒ ｅ 抗 Ｐ
首次分 离到 Ｐ ＲＲＳ Ｖ。近 几 年 来 ，该 病 表达载体 ｐ Ｔ一 ２ ＋） Ｂ ２ ＤＥ ） 限 公 司 ； ｆＤＮＡ 聚 合 酶 购 于 默 克 生 Ｅ ３ ａ（ 在 Ｌ １（ ３ ｐｕ
现 已成 为规模化 猪场繁殖 障碍 和呼 吸道 中表达 了 ＧＰ ５蛋 白，并 对诱 导表 达 蛋 物 工 程 有 限 （Ｔ Ｓ ＲＡＴ Ｅ ） 司 ｌ ＡＧ ＮＥ 公
１ 材料 与方法
Ｐ ＲＲＳ 的 主 要 结 构 蛋 白 Ｇ ５ 由 １ １ 主要 材 料 及 试剂 Ｖ Ｐ 是 ．
ＯＲ ５编码 的糖 基化囊膜 蛋白 ， 有诱 Ｆ 具
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达
收稿日期:2006204218 基金项目:教育部“新世纪优秀人才支持计划”资助项目(NCET 20420906/NCET 20620818);四川省重大科技攻关资助项目(01NG 018201/05Z Q0262038/2006Z D5*******);四川省重点建设学科资助项目(SZ D0418) 作者简介:希尼尼根(19712),男,蒙古族,博士。
3通讯作者猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc 2145细胞中的表达希尼尼根1,2,程安春13,汪铭书1,陈希文1,豆文波1,李雪梅1,刘伍梅1,刘 菲1,张平英1,陈孝跃1 (1.四川农业大学动物科技学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室,四川雅安625014;2.内蒙古农业大学动物科学与医学院,内蒙古呼和浩特010018)摘要:根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS V )LV 和VR 22332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRS V 四川分离株SC1和SC2进行RT 2PCR ,扩增出病毒ORF5基因。
利用真核表达质粒pcDNA3.1(+)成功构建了PRRS V 四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA 2PRRS V 2SC12ORF5和pcDNA 2PRRS V 2SC22ORF5。
通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA 2PRRS V 2SC22ORF5转染Marc 2145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h 和23h 后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h 达到高峰;这证明pcDNA 2PRRS V 2SC22ORF5在Marc 2145细胞中已高效表达,为PRRS V 基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。
关键词:PRRS V ;ORF5;基因疫苗;Marc 2145细胞中图分类号:S852143;S852165 文献标识码:A 文章编号:100524545(2008)0320223204Construction of eukaryotic expression plasmid of PRRSV 2ORF5gene and its expression in Marc 2145cell lineX ininigen 1,2,CHE NG An 2chun 13,W ANG Ming 2shu 1,CHE N X i 2wen 1,DOU Wen 2bo 1,LI Xue 2mei 1,LI U Wu 2mei 1,LI U Fei 1,ZH ANG Ping 2ying 1,CHE N X iao 2yue 1 (1.K ey Laboratory o f Animal Disease and Human Health o fSichuan Province ,College o f Animal Science and Technology ,Sichuan Agricultural Univer sity ,Yaan ,Sichuan625014,China ;2.College o f Animal Science and Veterinary Medicine ,Inner Mongolian Agricultural Univer sity ,Huhhot 010018,China ) Abstract :A pair of primers were designed and synthesized according to nucleotide of porcine reproductive and respiratorysyndrome virus LV and VR 22332,and DNA fragments of ORF5gene of PRRS V S ichuan is olates were am plified by RT 2PCR.ORF5of PRRS V S ichuan is olates were inserted into the eukary otic expression plasmid pcDNA3.1(+)to construct the recombinant plas 2mid pcDNA 2PRRS V 2SC12ORF5and pcDNA 2PRRS V 2SC22ORF5,then pcDNA 2PRRS V 2SC22ORF5was expressed in the Marc 2145cell line by cytofectene T M trans fection reagent kit processing and electroporation.ORF5expression was detected by means of im 2munofluorescence.An intense fluorescence was observed 23h post trans fection in the Marc 2145cells trans fected by electroporation ,which is 3h earlier than that processed by cytofectene T M trans fection reagent.The highest expression product was detected 56h post trans fection in the cells trans fected with cytofectene T M trans fection reagent or electroporation.Results indicated that PRRS V 2SC22ORF5gene could be expressed efficiently in the Marc 2145cells ,suggesting that the ORF5of PRRS V should be a g ood candidate for its gene vaccine. K ey w ords :PRRS V ;ORF5;gene vaccine ;Marc 2145cell 3Corresponding author 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS )是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS V )引起猪的一种高度传染性疾病,临床上以母猪发热、厌食和流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征,发病率高、传播快,严重危害养猪业的发展。
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的克隆和原核表达
引发 了空前 的“ 流产 风暴 ” ， 给 世 界 养 猪 业 造 成 巨 大 的经济 损失 。２ ０ ０ ６年 在 我 国 和东 南 亚 地 区 ， 该病 的 暴 发导 致约 ２ ０ ０万 的猪 死亡 ，给 我 国及全 世 界 养 猪
业 造成 了 巨大 的损失 ［ １ 。
毒的作用 ， 与病毒激发机体 免疫保护作用有关［ ５ ］ 。
白分 子质 量约 为 ２ ５ ｋ ｕ 。ＧＰ ５蛋 白具 有 一段 ３ １个氨 基 酸 的信 号肽及 ３个 跨 膜 区 ， 该 蛋 白包 含 ６个 抗 原 决定簇 ， 其 中 １个线 性决定 簇 ， 能在 体 外起 到 中和病
猪业 发达 国家 的一 种 病 毒性 疾 病 ， 随后在世界各 国
建成功 ， 重 组质 粒转 化 犬肠埃 希 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ ＤＥ ３ ） ， Ｉ Ｐ ＴＧ诱 导 表 达 ， Ｓ ＤＳ － Ｐ ＡＧ Ｅ 分析 重 组蛋 白的表 达 ， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ
ｂ ｌ ｏ ｔ 分析 重组蛋 白的反 应原 性 。结 果表 明 ， 重组 融合蛋 白 Ｈｉ ｓ — ＧＰ ５分子 质量 约 为 ４ １ ｋ ｕ ， 主 要 以 包涵体 的形
式存 在 ， 表 达量 占菌体 总蛋 白的 ３ ５ 以上 ， 纯化后 的 重组蛋 白 占总蛋 白的 ７ ５ 以上 ； 并且该 重 组蛋 白能 与猪 的阳性血 清反 应 ， 说 明其 具有较 好 的免 疫原 性 。研 究结果 为基 因工程疫 苗的研 发 和 Ｇ Ｐ ５的 抗体 制备 奠 定 了
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因不同编码区的表达和反应原性鉴定
ｖ ｕ Ｐ Ｒ Ｖ ｎｄ ｆ ｅｔ ｎｏｉ ｇ ｎ ，ｒ ｍ ｎ Ｌ Ｎ ａｄＣｏｔｎｄｂ ｅ ｔ ｇｔ — ｒ ｉ ｉ ａ ｐ ｐ ｉ ｓ（ Ｒ Ｓ ）ｉ ｉｅ ｎ ｅｃｄ ｇｒ ｉ ｓ ｆ ｇ ｅｔ Ｄ， ， ｎ ｂ ｉ ｙｄｌ ｉ ｅＮ ｔ ｍ ｎ ｓ ｎｌ ｅ ’ ｒ ｆｒ ｎ ｅｏ ａ ｓ ａｅ ｅｎ ｈ ｅ ａ ｇ ｌ
摘 要 ： 鉴 定 猪 繁殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 （ Ｒ Ｓ ） 膜 糖 蛋 白 Ｇ ５编 码 基 因 Ｏ Ｆ 为 Ｐ Ｒ Ｖ囊 Ｐ Ｒ ５不 同编 码 区 的 原 核 表 达 能 力 ， 利 用 Ｐ Ｒ方 法 分 别 扩 增 Ｏ Ｆ Ｃ Ｒ ５基 因缺 失 信 号 肽 的 Ｄ片段 、 失 信 号 肽 和跨 膜 区 的 Ｌ片 段 、 失 信 号 肽 的 ５端 Ｎ片 段 和 缺 缺
ｔｄ ｅ ｕ ｒ ｅ ａ ｄ ｒｔ ｅ ｔ ｎ ｍｅ ｒｎ ｏ ｉ ｅ ｕ ｎ ｅ ｏ ｉｅ ｓ ０ ｅ ｃ ｎ ／ｏ ｈ ｒ ｓ ｍｂ ａ ｅ ｄ ｍａｎ ｓ ｑ ｅ ｃ ｆ ＯＲＦ ｅ ｅｗｅ ｅａ ｌｆ ｄ ｂ ＣＲ ．Ｂ ｓｄ ｏ ｌｎ ｎ ｎ ｉ ａ ５ ｇ ｎ ｒ ｍｐ ｉ ｅ ｙ Ｐ ｉ ａ ｅ ｎ ｃｏ ｉ ｇａ ｄ ｓｑ ｅ ｃ Ｔ ｅ ｅｆａ ｍｅ ｔ ｗｅｅ ｉｓ ｒｅ ｎｏｔ ｅｐ ｏ ａ ｏｉ ｘ ｒ ｓｉｎ ｖ ｃｏ Ｅ ３ ａｒ ｓ ｅ ｔ ｅｙ．Ｔ ｅｒ ｃ ｍｂｎ ｎ ｘ ｅ ｕ ｎ ｅ． ｈ ｓ ｒｇ ｎｓ ｒ ｎ ｅｔｄ ｉｔ ｈ ｒ ｋ ｒ ｔｃｅ ｐｅ ｓｏ ｅ ｔｒｐ Ｔ一 ２ ｅ ｐ ｃ ｉ ｌ ｈ ｅ ｏ ｉａ ｔｅ — ｙ ｖ
缺 失 跨 膜 区 的 ３端 Ｃ片段 ， 克 隆 测 序 后 分 别 插 入 原 核 表 达 载体 ｐＴ３ａ中进 行 原 核 表 达 ， 果 显 示 未 缺 失 跨 膜 区 的 经 Ｅ －２ 结
猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因的亚克隆及原核表达
摘 要 ： 本研 究从 河 北省保 定地 区 ６ 疑 似感 染猪繁 殖 与呼 吸综 合征 病毒 （ Ｒ Ｖ）病猪 的肺 脏 中， 份 Ｐ ＲＳ 通
过 Ｒ —Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ获得 Ｐ Ｒ Ｖ ＧＰ Ｒ Ｓ ５蛋 白 完整 的基 因片段 ， 克隆 至 ｐ ＭＤ１一 栽体 。经 测序鉴 定正 确后 ， ８Ｔ 再设 计 一 对 引物从 重 组载 体 ｐ ＭＤ１ － ＧＰ ８Ｔ— ５中扩增 出缺 失 了 Ｎ 端 ３ ０个 氨基 酸 残基 的 ｄ ５的编 码 序 列 ｄ Ｆ ， ＧＰ ＯＲ ５ 克 隆至原核 表 达载体 ｐ Ｅ －ｐ １ 构 建原 核重 组质 粒 （ Ｇ Ｘ ６ — Ｇ ５ ， 化 至 Ｅ ｃｌ Ｂ ２ Ｇ Ｘ ６一 ， ｐ Ｅ －ｐｄ Ｐ ） 转 ．ｏｉ Ｌ １感 受 态细胞 。经 Ｉ ＴＧ诱 导后 ，ＤＳＰ Ｐ Ｓ － ＡＧＥ 电泳可检 测到 分子 质量 为 ４ ｕ的 目的蛋 白 。经 Ｗｅｔｒ ｌｔ Ｏｋ ｓｅｎｂｏ 分析表 明 ， 蛋 白 该
基 因的高 效 表 达 。陈 军 义 等 曾 去 除 了 Ｎ 末 端 ］
ｂ ｐ的基 因片段 ， 并成 功地 表达 了 ＧＰ ５蛋 白 。Ｏｌｋ — ｅｓ
工、 ｉ ｌ Ｔ 载 体 、Ｔ ｑ Ｄ Ｓｍｐｅ — ａ ＮＡ 聚 合 酶 、 Ｌ ２ ０ ０ Ｄ ０
的信号 肽 部 分 ， 增 了 Ｇ ５全 基 因 中 ７ ｐ ６０ Ｄ ｌｓＭａｋ ｒ Ｔ ＮＡ 连 接 酶 等 购 自宝 生 物 扩 Ｐ ９ｂ ～ ０ ＮＡ ｐｕ ｒ ｅ 、 ４ Ｄ
与 Ｐ Ｓ阳性 血清 具有 良好 的免 疫 反 应 性 ， ＲＲ 为进 一 步 研 究 Ｐ ＲＳ新 型 基 因工程 疫 苗和 诊 断试 剂 奠 定 了基 Ｒ
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析高志强;郭鑫;查振林;陈艳红;杨汉春【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2004(12)3【摘要】从河北、江西猪场中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002和JX-1/2002).采用RT-PCR方法扩增其完整的ORF5基因片段,进行了序列测定,并与其它5个国内毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析.所有这些毒株的ORF5基因均编码200个氨基酸,推导的氨基酸相似性在88.2%～99.0%之间.其中BJ-4、S1及J1间的相似性较高,在98%～99%之间;HB-1(sh)/2002,HB-2(sh)/2002,JX-1/2002及CH-1a间的相似性为92%～96%之间.根据ORF5基因核苷酸序列的遗传进化距离,这些毒株可分为两个亚群,BJ-4、S1和J1为一个亚群,与VR2332及疫苗毒株接近;HB-1(sh)/2002、HB-2(sh)/2002、JX-1/2002和CH-1a为另一个亚群.【总页数】5页(P283-287)【作者】高志强;郭鑫;查振林;陈艳红;杨汉春【作者单位】中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,100094;中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,100094;中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,100094;中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,100094;中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)江苏分离株NJGC ORF5基因的克隆及遗传变异分析 [J], 李彬;郭容利;周俊明;倪艳秀;吕立新;毛立;何孔旺;刘彦玲;温立斌;俞正玉;茅爱华;王小敏;张雪寒2.2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析[J], 陈盛楠; 张海龙; 谢博; 黄良宗; 顾万军3.2019年福建某原种猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析 [J], 林楚云;刘建奎;林志锋;林日丹;杨小燕;戴爱玲4.2019年福建某原种猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析 [J], 林楚云;刘建奎;林志锋;林日丹;杨小燕;戴爱玲5.2019年四川省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析[J], 孔军;朱国坡;康斌;武玉梅;李少丽;邵攀峰;尹忠良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒S-1株ORF5和ORF7基因的克隆及变异分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒S-1株ORF5和ORF7基因的克隆及变异分析张春玲;张婉华;臧克伟;王英;蒋凤英;邹勇;李春华;何锡忠【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2008(24)2【摘要】PRRSV S-1株经Marc-145复苏后,通过RT-PCR扩增了ORF5和ORF7基因.利用酶切位点将2个基因分别连接到原核表达载体PET-32C中,筛选阳性克隆送测序,序列分析表明:PRRSV S-1株ORF5基因变异性较高,与VR-2332毒株和CH-1a毒株的同源性分别是:核苷酸同源性为91%和89%,氨基酸同源性是87%和85%;ORF7基因相对保守,核苷酸的同源性分别是97%和94%,氨基酸的同源性分别是95%和93%.【总页数】6页(P40-45)【作者】张春玲;张婉华;臧克伟;王英;蒋凤英;邹勇;李春华;何锡忠【作者单位】上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106;山东农业大学,泰安,271018;上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海,201106【正文语种】中文【中图分类】S828;S855【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)江苏分离株NJGC ORF5基因的克隆及遗传变异分析 [J], 李彬;郭容利;周俊明;倪艳秀;吕立新;毛立;何孔旺;刘彦玲;温立斌;俞正玉;茅爱华;王小敏;张雪寒2.猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆 [J], 杜平;刘学荣;黄银君;贺延玉;牟克斌3.11株猪繁殖与呼吸综合征病毒中国分离株NSP2、ORF5、ORF7基因的序列分析 [J], Li J;吴艳4.河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株HB-3(cz)株ORF5基因变异分析 [J], 刘涛;陈赛娟;张丽青;张秀珊;杜冬华;孙继国;李聪研5.猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的克隆与变异分析 [J], 周海范;夏平安;崔保安;柴春霞;张红英;杨霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析
呼 吸 道疾 病 及 免疫 抑 制 和 持续 性感 染 ， 而 导 致 新 生 仔猪 发 从 生 继 发感 染 ， 长 发 育受 阻 ， 时可 出现 神经 症 状 ， 亡率 升 生 有 死 高 ， 。 １８ ４ ９ ７年 在美 国首 先 发 现 此病 ，９ １年在 荷 兰首 次 分 １ １９ 离 到病 原 ， 名 为 Ｌ ｌｓ ｄＶｉ ｓ Ｌ 。１ ９ 命 ｅ ｔ ｒ （ Ｖ） ９ ２年 美 国学 者 也 ｙａ ｕ 分 离 到该 病 毒 ， 命名 为 Ａ Ｔ Ｒ 一２３ １ 。１ ９ Ｔ ＣＶ ３ ２２ ］ ９ ６年 郭 宝 清
７ ℃ 终 延 伸 ５ｍｉ。按 常 规 方 法 将 Ｐ Ｒ 产 物 纯 化 后 与 ２ ｎ Ｃ ｐ １ ＭＤ ８一Ｔ载 体 连 接 ， 化 Ｄ ａ 受 态 细胞 ， 氨 苄 抗性 筛 转 Ｈ５ 感 经 选 及 双 酶 切对 重 组 菌 进 行 鉴 定 。
病 ’ 。近年 来 我 国各 地 也 陆 续 报 道 有本 病 的流 行 。研 究 表 ３
之 高 ， 明这 些 毒株 可 能均 起 源于 同一 个毒 株 ， 说 通过 猪 的 运 输 流 通 等在 全 国流行 。
关 键 词 ：猪繁 殖与 呼 吸 综 合征 病 毒 ； ＯＲＦ ５基 因； 变异
猪 繁殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 （ Ｒ Ｓ 属 于 动脉 炎病 毒科 、 Ｐ Ｒ Ｖ）
2010-2019年中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的遗传进化与重组分析
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２２ꎬ３８(１):２８５￣２８８ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ覃新云ꎬ刘桂秀ꎬ吕其壮ꎬ等.２０１０－２０１９年中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(ＰＲＲＳＶ)ＯＲＦ５基因的遗传进化与重组分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２２ꎬ３８(１):２８５￣２８８.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２２.０１.０３４２０１０－２０１９年中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(ＰＲＲＳＶ)ＯＲＦ５基因的遗传进化与重组分析覃新云１ꎬ㊀刘桂秀１ꎬ㊀吕其壮１ꎬ２ꎬ㊀邓家华３ꎬ㊀覃㊀婷１ꎬ㊀龙金桃１ꎬ㊀陈旭健１(１.玉林师范学院生物与制药学院ꎬ广西玉林５３７０００ꎻ２.广西农产资源化学与生物技术重点实验室ꎬ广西玉林５３７０００ꎻ３.河南科技学院动物科技学院ꎬ河南新乡４５３００３)收稿日期:２０２１￣０５￣２１基金项目:国家自然科学基金项目(３１８６０７０８)ꎻ广西自然科学基金项目(２０１７ＧＸＮＳＦＢＡ１９８０２５)ꎻ玉林师范学院大学生创新创业训练计划项目(２０２０１０６０６２２６)作者简介:覃新云(２０００－)ꎬ男ꎬ广西柳江人ꎬ本科ꎬ主要从事动物传染病病原学与流行病学研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)188****4673＠１６３.ｃｏｍꎮ刘桂秀为共同第一作者ꎮ通讯作者:吕其壮ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｖｑｉｚｈｕａｎｇ０６２＠１６３.ｃｏｍꎻ陈旭健ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｊｕａｎｌｉｕ０１２＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀关键词:㊀猪繁殖与呼吸综合征病毒ꎻＯＲＦ５基因ꎻ遗传进化分析ꎻ重组分析中图分类号:㊀Ｓ８５２.６５㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２２)０１￣０２８５￣０４ＧｅｎｅｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯＲＦ５ｇｅｎｅｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ(ＰＲＲＳＶ)ｉｎＣｈｉｎａｂｅｔｗｅｅｎ２０１０ａｎｄ２０１９ＱＩＮＸｉｎ￣ｙｕｎ１ꎬ㊀ＬＩＵＧｕｉ￣ｘｉｕ１ꎬ㊀ＬＹＵＱｉ￣ｚｈｕａｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＤＥＮＧＪｉａ￣ｈｕａ３ꎬ㊀ＱＩＮＴｉｎｇ１ꎬ㊀ＬＯＮＧＪｉｎ￣ｔａｏ１ꎬ㊀ＣＨＥＮＸｕ￣ｊｉａｎ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ＆ＰｈａｒｍａｃｙꎬＹｕｌｉｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹｕｌｉｎ５３７０００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＹｕｌｉｎ５３７０００ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｅｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＸｉｎｘｉａｎｇ４５３００３ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓꎻＯＲＦ５ｇｅｎｅꎻｇｅｎｅｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙａｎａｌｙｓｉｓꎻｒｅ￣ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀猪繁殖与呼吸综合征(ＰＲＲＳ)ꎬ俗称 猪蓝耳病 ꎬ是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(ＰＲＲＳＶ)引起的一种急性㊁具有高度传染性疾病ꎬ其主要临床症状表现为持续高热㊁母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸困难和高死亡率[１￣２]ꎮＰＲＲＳ最早发现于美国的北卡罗来纳州ꎬ随后世界各国陆续报道ꎬ中国于１９９６年首次报道该病ꎮ２００６年出现了由高致病性ＰＲＲＳＶ引起的 猪无名高热症 疫情的大面积暴发和流行ꎬ导致猪群高发病率及高死亡率ꎬ给养猪业造成了巨大的经济损失[３]ꎮＰＲＲＳＶ是一种单股正链ＲＮＡ病毒ꎬ其基因组长度约１４５００ｂｐꎬ编码区至少包括１０个开放阅读框(ＯＲＦ)[４]ꎮ其中ꎬＯＲＦ５基因可以编码病毒的主要结构蛋白ＧＰ５ꎬ该蛋白质是一种糖基化囊膜蛋白质ꎬ也是ＰＲＲＳＶ诱导机体产生中和抗体的主要抗原[５]ꎮ研究结果证实ꎬＧＰ５蛋白是ＰＲＲＳＶ中最容易发生变异的蛋白质之一ꎬ常被用作评价ＰＲＲＳＶ病毒是否发生变异的主要依据之一ꎬＯＲＦ５基因也因此成为序列分析的典型基因ꎬ可作为ＰＲＲＳＶ基因分型的重要依据ꎬ在ＰＲＲＳＶ流行性株遗传变异研究中发挥重要作用[６]ꎮ当前在中国境内的ＰＲＲＳＶ可分为２个血清型ꎬ即ＰＲＲＳＶ２(以ＶＲ￣２３３２毒株为代表)和ＰＲＲＳＶ１(以Ｌｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ毒株为代５８２. All Rights Reserved.表)ꎬ其中ＰＲＲＳＶ２又可分为５个基因亚型(ｌｉｎｅａｇｅ１㊁ｌｉｎｅａｇｅ３㊁ｌｉｎｅａｇｅ５㊁ｌｉｎｅａｇｅ８㊁ｌｉｎｅａｇｅ９)ꎬｌｉｎｅａｇｅ１包含ＮＡＤＣ３０㊁ＪＬ５８０等毒株ꎻｌｉｎｅａｇｅ３包含ＱＹＹＺ㊁ＧＭ２等近年来在华南地区流行的低致病毒株ꎻｌｉｎｅａｇｅ５包含ＰＲＲＳＶ２代表毒株ＶＲ￣２３３２ꎻｌｉｎｅａｇｅ８包含以ＴＪ㊁ＪＸＡ１㊁ＴＡ￣１２等高致病毒株和以ＣＨ￣１ａ等为代表的经典毒株及２０１１年于新疆地区发现的ｌｉｎｅａｇｅ９[７￣１１]ꎮ为研究中国近年来ＰＲＲＳＶ流行毒株和变异特征ꎬ本研究从ＧｅｎＢａｎｋ中随机取回分离于中国２０１０－２０１９年的８７７株ＰＲＲＳＶ的ＯＲＦ５基因序列ꎬ并对其进行遗传进化和重组分析ꎬ以期为监测中国猪群中ＰＲＲＳＶ的变异情况和防控ＰＲＲＳ提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因序列的收集从ＧｅｎＢａｎｋ数据库中随机取回８７７株２０１０－２０１９年分离于中国２９个省㊁市和自治区的ＰＲＲＳＶ的ＯＲＦ５全基因序列作为分析样本ꎬ同时ꎬ收集２４株各ＰＲＲＳＶ基因亚型的代表毒株和２２株邻国毒株作为参考毒株ꎮ为了更好地呈现分析结果ꎬ在８７７株毒株中随机选取９８株代表毒株用于后续分析ꎮ１.２㊀ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因的系统发育分析采用Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ(ＮＪ)方法ꎬ参照文献[１２]进行参数设置ꎬ利用软件ＭＥＧＡｖ.１０.０.５绘制本研究获得的８７７株ＰＲＲＳＶ的ＯＲＦ５基因序列与参考毒株ＯＲＦ５基因序列的分子进化树ꎬ应用徐铮等[１３]提出的基因分型方法对毒株进行类群划分并分析其进化关系及各基因亚型在中国的流行情况ꎮ１.３㊀ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因序列分析利用ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ程序将收集的ＯＲＦ５基因序列与参考毒株的ＯＲＦ５基因序列进行核苷酸同源性分析ꎬ并对ＯＲＦ５基因推导的氨基酸序列进行对比分析ꎬ其中以ＰＲＲＳＶ２代表毒株ＶＲ￣２３３２为氨基酸序列比对时的标准毒株[６ꎬ８]ꎮ１.４㊀ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因的重组分析为研究所收集毒株之间的基因重组情况ꎬ利用软件ＲＤＰ４.０中的７种检测算法[ＲＤＰ(Ｒ)㊁ＭａｘＣｈｉ(Ｍ)㊁ＢｏｏｔＳｃａｎ(Ｂ)㊁ＧｅｎｅＣｏｎｖ(Ｇ)㊁３ｓｅｑ(Ｔ)㊁ＳｉＳｃａｎ(Ｓ)和Ｃｈｉ￣ｍａｅｒａ(Ｃ)]对获得的ＯＲＦ５基因进行重组分析ꎬ并参照文献[１４￣１５]中的判定依据对检测出的重组事件进行界定ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因的核苷酸同源性比对及遗传演化分析分析结果显示ꎬＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因序列的长度为６００ｂｐ㊁６０３ｂｐ和６０６ｂｐꎬ核苷酸同源性为５９.６％~１００ ０％ꎬ与国内外４６株参考毒株的ＯＲＦ５基因同源性为５９.４％~１００ ０％ꎮＯＲＦ５基因进化树分析结果表明ꎬ８７７株ＰＲＲＳＶ毒株中有１５株为ＰＲＲＳＶ１ꎬ８６２株为ＰＲＲＳＶ２毒株ꎮＰＲＲＳＶ２又可进一步划分为多个不同基因亚型ꎬ其中高致病性毒株(亚型１)有５１７株㊁经典毒株(亚型２)有７４株㊁广东新变异毒株(亚型３)有６２株㊁ＪＸＡ￣Ｒ疫苗样毒株(亚型４)有２９株㊁ＮＡＤＣ３０/ＮＡＤＣ３４样毒株(亚型５)有１１５株以及分离于新疆地区的毒株(亚型９)有６株ꎮ进一步分析发现ꎬ除上述６种已发表的基因亚型外ꎬ又出现几个与之明显不同的分支ꎬ将其分别命名为亚型６(３２株)㊁亚型７(４株)㊁亚型８(２３株)ꎮ２.２㊀不同基因亚型ＰＲＲＳＶＧＰ５蛋白的氨基酸序列对比根据文献报道ꎬ当前ＰＲＲＳＶ２ＧＰ５蛋白中存在１个信号肽㊁２个高变区(ＨＶＲ１和ＨＶＲ２)㊁３个跨膜区(ＴＭ１㊁ＴＭ２和ＴＭ３)以及５个表位结构(ＤＥ㊁ＮＥ㊁Ｔ１㊁Ｔ２㊁ＴＭ３)ꎬ另有位于第１３位和１５１位氨基酸位点的２个毒力相关位点[６ꎬ１４￣１５]ꎮ本试验从ＰＲＲＳＶ１和ＰＲＲＳＶ２毒株１~５基因亚型中随机选取代表毒株与本试验获得的９８株代表性分析毒株的ＧＰ５蛋白氨基酸序列进行对比分析ꎮ结果表明ꎬ中国ＰＲＲＳＶＧＰ５蛋白的氨基酸序列中普遍存在变异ꎮ相比于ＰＲＲＳＶ２的代表毒株ＶＲ￣２３３２㊁ＰＲＲＳＶ１毒株和亚型７均在第３３~３４位氨基酸位点处插入２个氨基酸ꎻ相比于ＰＲＲＳＶ１的代表毒株ꎬ亚型６和亚型７分别在第３４位氨基酸位点㊁５８位氨基酸位点处出现１个氨基酸缺失ꎮ而Ｇｅｎｏｔｙｐｅ１和Ｓｕｂｇｅｎｏｔｙｐｅ７毒株均在３３~３４位氨基酸位点处插入２个氨基酸ꎬ其余的突变主要表现为各氨基酸位点的点突变ꎮ２.３㊀ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因的重组分析重组分析共检测到１１个重组事件ꎬ其中ꎬ２个是明确的重组事件ꎬ９个是潜在的重组事件[１６￣１８]ꎮ在明确的重组事件中ꎬ重组事件２的重组体是毒株ＭＨ４２２０６０(ＮＣＢＩ登录号:ＨＬＪ/ＨＥＢ/２０１６/１０３１ｂ)ꎬ其主要亲本是毒株ＫＸ８１５４２８(ＮＣ￣ＢＩ登录号:１５ＳＣ３)ꎬ次要亲本是毒株ＭＫ４５０６１４(ＮＣＢＩ登录号:２０１８１１３Ｚｈａｎｇｓｈｕ６)ꎬ重组区域大约发生在ＯＲＦ５基因序列的２７０~５７０ｂｐꎮ３㊀讨论近年来ꎬ中国陆续报道新的突变毒株ꎬ使得中国的ＰＲＲＳＶ流行毒株更加多样化ꎬ变异进程加快ꎬ防控更加复杂化[１６ꎬ１９￣２１]ꎮ虽然中国已采取疫苗免疫的方法进行防控ꎬ但高致病性毒株减毒活疫苗的无序使用造成减毒活疫苗病毒的大量传播ꎬ使得ＰＲＲＳ仍然是严重危害中国养猪业的重要疫病之一[２２]ꎮ通过对ＰＲＲＳＶ基因组特征和遗传进化分析发现ꎬ基于选择压力的变化和病毒自身进化的需要ꎬＰＲＲＳＶ不断发生变异和重组ꎬ尤其是在ＮＳＰ２和ＧＰ５２个最易变异的蛋白质上面ꎬ这给ＰＲＲＳ的防治带来了更大困难ꎬ因此ＰＲＲＳＶＮＳＰ２和ＯＲＦ５基因也常被用作ＰＲＲＳＶ各流行毒株间遗传进化分析的靶基因ꎮ６８２江苏农业学报㊀２０２２年第３８卷第１期. All Rights Reserved.通过对新鉴定亚型进行地理区分分析ꎬ我们发现以ＫＹ３７３２１４㊁ＭＦ１３３２９６等为代表的新亚型６主要在广西㊁河南㊁四川㊁山东等地被检出ꎻ以ＫＣ５２７８３０㊁ＫＸ８１５４１９为代表的新亚型７主要在广东㊁浙江等地被检出ꎻ以ＭＫ２９１４０７㊁ＫＰ９９８４１５为代表的新亚型８主要在中国台湾地区被检出ꎬ且新亚型６与ＰＲＲＳＶ１ꎬ新亚型７与ｌｉｎｅａｇｅ３ꎬ新亚型８与ｌｉｎｅａｇｅ１亲缘关系较近ꎬ表明目前中国的ＰＲＲＳＶ呈现多基因亚型并存的局面ꎬ且基因亚型的种类有进一步增多的趋势ꎮ通过对ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因编码蛋白质的变异分析发现ꎬ其存在多处点突变ꎬ个别基因型或基因亚型还存在碱基插入和缺失的情况ꎬ该情况可能导致已有的ＰＲＲＳＶ疫苗免疫效果不佳或失败ꎬ更可能导致新型变异毒株的出现ꎮ此外ꎬ与毒力有关的第１３位和第１５１位氨基酸位点的比对结果显示ꎬ这些毒力位点的突变有可能会导致ＰＲＲＳＶ流行毒株毒力的改变ꎬ甚至会出现新的高致病性毒株ꎮ对ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因的重组分析结果表明ꎬ基于中国不同地区的８７７株ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因共检测到１１个可能的重组事件ꎬ但是根据Ｔｏｍｉｔａｋａ等[１８]和Ｌｉ等[１６]的结果判断原则ꎬ其中只有２个是明确的重组事件ꎬ虽然重组事件１中重组体ＭＫ６８９０８３(新亚型６)的主要亲本尚不明确ꎬ但其次要亲本ＭＴ０３６９３１却是亚型４ꎬ即高致病性ＰＲＲＳＶ减毒疫苗毒株或演化毒株ꎮ重组事件２中的重组毒株ＭＨ４２２０６０(亚型２ꎬ即经典毒株)来源于ＫＸ８１５４２８(亚型５ꎬ即ＮＡＤＣ３０￣ｌｉｋｅ毒株)和ＭＫ４５０６１４(亚型１ꎬ即高致病性毒株)的重组ꎬ这与陈盛楠等[１４]和Ｘｉｅ等[１９]对中国部分地区ＰＲＲＳＶ变异分析的结果一致ꎬ说明中国ＰＲＲＳＶ毒株间的重组频频发生是导致新的突变毒株出现的主要原因之一ꎮ特别值得注意的是ꎬ虽然利用ＲＤＰ４软件并未检测到ＰＲＲＳＶ１与ＰＲＲＳＶ２毒株之间存在基因重组的情况ꎬ但通过氨基酸序列比对发现ꎬ亚型７的第１~５６个氨基酸与ＰＲＲＳＶ２代表株高度同源ꎬ其第６２~２０１个氨基酸却又与ＰＲＲＳＶ１代表株高度同源ꎬ提示亚型７可能来源于ＰＲＲＳＶ１与ＰＲＲＳＶ２毒株间的基因重组ꎮ众所周知ꎬ基因重组可能会导致病毒的抗原表位发生变化ꎬ从而导致病毒发生变异ꎬ这既是病毒发生变异产生新的亚群的一种方式ꎬ也是疫苗特异性免疫失败的一个重要原因[２３]ꎮ对重组事件进一步分析发现ꎬ所收集８７７株ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因的重组情况主要分布在广东㊁吉林㊁河南㊁浙江㊁江西㊁黑龙江㊁安徽等地ꎬ其中在河南检出最多ꎬ其次是山东ꎬ提示将来这些地方的ＰＲＲＳＶ防控应以重组毒株为主ꎮ本研究基于８７７株中国２０１０－２０１９年ＰＲＲＳＶＯＲＦ５基因序列对中国近年来ＰＲＲＳＶ流行毒株的变异情况进行了分析ꎬ本研究结果为进一步研究中国ＰＲＲＳＶ的遗传演化ꎬ筛选新的疫苗候选株和开发新型疫苗防控ＰＲＲＳ具有重要意义ꎮ参考文献:[１]㊀ＨＡＮＪꎬＺＨＯＵＬꎬＧＥＸＮꎬｅｔａｌ.ＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２０９:３０￣４７. [２]㊀邹伟斌ꎬ林梓栋ꎬ齐冬梅.猪繁殖与呼吸综合征病毒的控制策略研究进展[Ｊ].中国兽医杂志ꎬ２０１８ꎬ５４(１１):６６￣６９. [３]㊀杨宗照ꎬ方维焕.猪瘟合并猪繁殖与呼吸综合征病毒(ＰＲＲＳＶ)和猪圆环病毒２型(ＰＣＶ２)感染[Ｊ].中国兽医学报ꎬ２００６ꎬ２６(３):２４０￣２４２.[４]㊀ＬＵＮＮＥＹＪＫꎬＦＡＮＧＹꎬＬＡＤＩＮＩＧＡꎬｅｔａｌ.Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ(ＰＲＲＳＶ):ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｉｎｔｅｒ￣ａｃｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＡｎｉｍａｌＢｉｏ￣ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１６ꎬ４(１):１２９￣１５４.[５]㊀ＯＳＴＲＯＷＳＫＩＭꎬＧＡＬＥＯＴＡＪＡꎬＪＡＲＡＭꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｄｎｏｎｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅｓｉｎｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＧＰ５ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ[Ｊ].ＪＶｉｒｏｌꎬ２００２ꎬ７６(１３):４２４１￣４２５０.[６]㊀袁为锋ꎬ张帆帆ꎬ李龙显ꎬ等.２０１６－２０１７年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ＯＲＦ５基因变异分析[Ｊ].中国畜牧兽医ꎬ２０１８ꎬ４５(１０):２８３１￣２８３９.[７]㊀ＷＵＱＷꎬＬＩＺＬꎬＺＨＡＮＧＧＱꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｐｈｙｌｏ￣ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｎｓｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａｆｒｏｍ２００７ｔｏ２０１４[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｅｔｅｒｉ￣ｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ１８(３):３１７￣３２６.[８]㊀ＹＵＬＹꎬＺＨＡＯＰＤꎬＤＯＮＧＪＧꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ１１ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｉｎｓｏｕｔｈＣｈｉｎａｆｒｏｍ２０１４ｔｏ２０１５[Ｊ].ＶｉｒｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１７ꎬ１４(１):１３９.[９]㊀ＧＡＯＪＣꎬＸＩＯＮＧＪＹꎬＹＥＣꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕ￣ｓｅｓｉｎｍａｉｎｌａｎｄＣｈｉｎａｉｎ１９９６－２０１６[Ｊ].Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ２０８(１):１６４￣１７２.[１０]ＳＨＩＭꎬＬＡＭＴＹꎬＨＯＮＣＣꎬｅｔａｌ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆＰＲＲＳＶ:ａｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１０ꎬ１５４(１/２):７￣１７.[１１]ＳＨＩＭꎬＬＡＭＴꎬＨＯＮＣꎬｅｔａｌ.Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ￣ｂａｓｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙꎬｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃａｌꎬａｎｄｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎｏｆｎｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ２ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ８４(１７):８７００￣８７１１.[１２]ＫＵＭＡＲＳꎬＳＴＥＣＨＥＲＧꎬＴＡＭＵＲＡＫ.ＭＥＧＡ７:ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕ￣ｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎ７.０ｆｏｒｂｉｇｇｅｒｄａｔａｓｅｔｓ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕ￣ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２０１６ꎬ３３(７):１８７０￣１８７４.[１３]徐㊀铮ꎬ周吉培ꎬ申翰钦ꎬ等.２０１６－２０１７年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子检测及ＮＳＰ２㊁ＯＲＦ５基因变异分析[Ｊ].中国兽医杂志ꎬ２０１９ꎬ５５(４):２５￣３０ꎬ３４.[１４]陈盛楠ꎬ张海龙ꎬ谢㊀博ꎬ等.２０１８年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ＯＲＦ５基因变异分析[Ｊ].动物医学进展ꎬ２０２０ꎬ４１(１):５０￣５６.[１５]许秀琼ꎬ查云峰ꎬ王福广ꎬ等.广东省屠宰场猪群ＰＲＲＳＶ感染状况调查及基因测序分析[Ｊ].中国动物检疫ꎬ２０２０ꎬ３７(９):４０￣４５.[１６]ＬＩＧＲꎬＨＥＷＴꎬＺＨＵＨＮꎬｅｔａｌ.Ｏｒｉｇｉｎꎬｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬａｎｄ７８２覃新云等:２０１０－２０１９年中国猪繁殖与呼吸综合征病毒(ＰＲＲＳＶ)ＯＲＦ５基因的遗传进化与重组分析. All Rights Reserved.ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｎｏｖｅｌｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ３[Ｊ].ＡｄｖａｎｃｅｄＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１８ꎬ５(９):１８００２７５.[１７]ＯＨＳＨＩＭＡＫꎬＴＯＭＩＴＡＫＡＹꎬＷＯＯＤＪＴꎬｅｔａｌ.Ｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｒｅｃｏｍ￣ｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｈｏｔｓｐｏｔｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ８８(１):２９８￣３１５.[１８]ＴＯＭＩＴＡＫＡＹꎬＯＨＳＨＩＭＡＫ.ＡｐｈｙｌｏｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｔｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｉｎｅａｓｔＡｓｉａｒｅｖｅａｌｓａｎ ｅｍｅｒｇｅｎｔ ｌｉｎｅａｇｅｉｎＪａｐａｎ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｃｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ１５(１４):４４３７￣４４５７.[１９]ＸＩＥＣＺꎬＨＡＺꎬＮＡＮＦＬꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏ￣ｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ(ＯＲＦ５ＲＦＬＰ１￣７￣４ｖｉｒｕ￣ｓｅｓ)ｉｎｎｏｒｔｈｅｒｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓꎬ２０２０ꎬ１４０:１０３９４１.[２０]孔㊀军ꎬ朱国坡ꎬ康㊀斌ꎬ等.２０１９年四川省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ＯＲＦ５基因的遗传变异分析[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０２１ꎬ４９(７):６８￣７３.[２１]江地科ꎬ尹清清ꎬ项明源ꎬ等.检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２０ꎬ３６(１):１１６￣１２１. [２２]杨汉春ꎬ黄芳芳ꎬ郭㊀鑫ꎬ等.猪繁殖与呼吸综合征病毒(ＰＲＲＳＶ)ＢＪ￣４株全基因组序列测定与分析[Ｊ].农业生物技术学报ꎬ２００１ꎬ９(３):２１２￣２１８.[２３]ＶＬＡＳＯＶＡＡＮꎬＭＡＲＴＨＡＬＥＲＤꎬＷＡＮＧＱＨꎬｅｔａｌ.ＤｉｓｔｉｎｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｃｏｍｐｌｅｘｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＰＥＤＶｓｔｒａｉｎｓꎬｎｏｒｔｈＡ￣ｍｅｒｉｃａꎬＭａｙ２０１３￣Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１４[Ｊ].ＥｍｅｒｇｉｎｇＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａ￣ｓｅｓꎬ２０１４ꎬ２０(１０):１６２０￣１６２８.(责任编辑:陈海霞)８８２江苏农业学报㊀２０２２年第３８卷第１期. All Rights Reserved.。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ＯＲＦ５基因的克隆与原核表达
作者：梁望旺伍锐杨克礼刘泽文熊忠良段正赢邓均华唐文娟余爱冬徐涤平
来源：《湖北农业科学》2009年第05期
摘要：采用RT—PCR方法扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒临床分离株(HBKM2)的ORF5全基因，并进行了测序分析，根据ORF5的结构特点，进一步扩增了截去N端信号肽序列的ORF5(nsORF5)．并将其克隆到pGEX—KG原核表达载体，构建了重组质粒pKG-ns5，经酶切和测序鉴定后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达，经SDS—PAGE和Westem-blot分析表明。
克隆的nsORF5基因与谷胱甘肽转移酶(GsT)基因获得了高效融合表达，表达的融合蛋白GST-nsGP5分子量约为43kD．并具有反应活性，这为进一步研究PRRSV GP5蛋白的功能反新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建赵娜;田宏;吴锦艳;满自萍;尚佑军;何生虎;刘湘涛【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2009(024)001【摘要】根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF5序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃LZH株的ORF5基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF5,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF5转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF5;并成功构建了PRRSV LZH株ORF5基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础.【总页数】4页(P83-86)【作者】赵娜;田宏;吴锦艳;满自萍;尚佑军;何生虎;刘湘涛【作者单位】中国农业科学院,兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口啼疫参考实验室,甘肃,兰州;宁夏大学,农学院,宁夏,银川,750021;中国农业科学院,兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口啼疫参考实验室,甘肃,兰州;中国农业科学院,兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口啼疫参考实验室,甘肃,兰州;中国农业科学院,兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口啼疫参考实验室,甘肃,兰州;宁夏大学,农学院,宁夏,银川,750021;中国农业科学院,兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口啼疫参考实验室,甘肃,兰州;宁夏大学,农学院,宁夏,银川,750021;中国农业科学院,兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,国家口啼疫参考实验室,甘肃,兰州【正文语种】中文【中图分类】S432.4+1【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建与鉴定 [J], 周玉照;马志亮;孙亭亭;杨洁;张小苗;柴俊;张娜娜;张以芳2.猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的克隆及其表达载体的构建 [J], 刘霞;汤德元;黄涛;徐健;王彬3.猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建 [J], 徐铮;孙彦伟;刘镇明;林彦星;詹爱军;龚善中;陈靳松4.PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建 [J], 赵娜;田宏;吴锦艳;祁燕蓉;满自萍;尚佑军;何生虎;刘湘涛5.猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建 [J], 郭小参;崔保安;陈红英;王彦彬;方剑玉;吕晓丽;王东方因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白ORF5基因的克隆与序列分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白ORF5基因的克隆与序列分析吴晓薇;刘晓慧;杨谦;熊蕊;郭凤柳;郭霄峰;阳佑天;陈茹【摘要】为揭示广东地区猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可能的流行规律,本研究采用RT-PCR的方法扩增5株来自广东地区猪场临床样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respirato-ry syndrome virus,PRRSV)分离株的GP5蛋白ORF5基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较.结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为88.8％、99.5％、88.7％、88.7％和83.5％.系统进化树分析结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株均属于美洲型.以上结果为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)011【总页数】4页(P40-43)【关键词】猪繁殖与呼吸综合征;GP5蛋白;序列分析【作者】吴晓薇;刘晓慧;杨谦;熊蕊;郭凤柳;郭霄峰;阳佑天;陈茹【作者单位】广东出入境检验检疫局,广东广州510642;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;华南农业大学,广东广州 510640;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;华南农业大学,广东广州510640;华南农业大学,广东广州 510640;广东出入境检验检疫局,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S854.4+3猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)以引起母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状为临床特征的接触性传染病(田志平等，2012)，是影响全球养猪业最重要的疾病之一。
猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达
猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达陈勇军;苏鑫铭;高晓飞;郑其升;于春梅;曹瑞兵;周斌;陈溥言【期刊名称】《农业生物技术学报》【年(卷),期】2006(14)3【摘要】根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物,从重组质粒pMD-ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues).改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和ORF5-2.将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析,ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达,表达量分别为12.2%和39%,证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量.经Western blot分析,融合蛋白具有一定的免疫学活性,表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大.【总页数】4页(P319-322)【作者】陈勇军;苏鑫铭;高晓飞;郑其升;于春梅;曹瑞兵;周斌;陈溥言【作者单位】南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095;南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.RNA干扰抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒N基因表达及病毒复制 [J], 黄良宗;钟科阳;王淑敏;司兴奎;马春全;顾万军2.猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达 [J], 兰辉;卓伟伟;刘军;罗艳;权富生;华松3.猪繁殖与呼吸综合症病毒E基因克隆及重组腺病毒表达载体的构建 [J], 刘光瑞;李宝玉;柳纪省;胡永浩4.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达 [J], 方六荣;肖少波;牛传双;张辉;陈焕春5.猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析 [J], 陈妍;田宏;尹双辉;尚佑军;孙靖;刘湘涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析
猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析陈妍;田宏;尹双辉;尚佑军;孙靖;刘湘涛【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2009(39)9【摘要】参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较。
将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析。
结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-1a 株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性。
GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础。
【总页数】5页(P774-778)【关键词】猪生殖与呼吸综合征病毒;GP5蛋白;原核表达【作者】陈妍;田宏;尹双辉;尚佑军;孙靖;刘湘涛【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室;吉林大学【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病毒系统中的表达 [J], 赵耘;罗长宝;林志雄;陈茹;李树根;陈博文;刘尚高2.猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州分离株ORF5基因的克隆及其表达载体的构建 [J], 刘霞;汤德元;黄涛;徐健;王彬3.猪生殖与呼吸综合征病毒广东株ORF3和ORF5基因的克隆与分析 [J], 陈建君;宋长绪;王贵平;杨增岐4.宁夏地区猪生殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及其变异分析 [J], 满自萍;田宏;吴锦艳;赵娜;尚佑军;刘湘涛;杨春生;何生虎5.猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J], 郭爱英;吴发兴;陈杰;郑喜邦;李晓成;张燕霞;黄保续因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因在昆虫细胞中的高效融合表达方六荣;肖少波;牛传双;张辉;陈焕春【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2003(043)001【摘要】对杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的转座质粒pFastbac1进行改造,即在其多角体蛋白启动子下游插入谷胱苷肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)基因,构建GST融合表达转座质粒pFGST.通过转座和转染Sf9细胞,证实该系统能高水平表达GST.采用PCR方法从pMT-gp51质粒中扩增截去N端信号肽序列的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)YA株ORF5基因,并将截短的ORF5基因片段克隆到pFGST中,使之与GST融合,构建的重组转座质粒pFGST-53转染DH10Bac,提取大分子Bacmid DNA,转染Sf9细胞,获得能表达融合蛋白的高滴度重组病毒rvGST53.rvGST53感染Sf9细胞,SDS-PAGE和Western印迹分析表明:与GST融合的ORF5基因在Sf9细胞中获得高效表达,表达产物分子量为45kD,能与抗PRRSV E蛋白单克隆抗体发生特异性反应.将表达产物免疫小白鼠,经间接免疫荧光检测,免疫血清能使PRRSV YA株感染的MARC-145细胞呈较强的荧光着色,证实表达的融合蛋白具有良好的免疫原性.【总页数】7页(P8-14)【作者】方六荣;肖少波;牛传双;张辉;陈焕春【作者单位】华中农业大学牧医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学牧医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学牧医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学牧医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学牧医学院动物病毒室,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】S850【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及杆状病毒表达载体的构建 [J], 赵娜;田宏;吴锦艳;满自萍;尚佑军;何生虎;刘湘涛2.猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究 [J], 陈希文;程安春;汪铭书;希尼尼根;豆文波;张平英;李雪梅;王刚;刘伍梅3.猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病毒系统中的表达 [J], 赵耘;罗长宝;林志雄;陈茹;李树根;陈博文;刘尚高4.猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达 [J], 陈建君;宋长绪;杨增岐;王贵平5.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染猪组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的分布 [J], 李燕华;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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动物医学进展,2009,30(12):63 66Pr ogress in Veterinary Medicine猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达尹国友1,孙 婕1,黄保续2*(1.河南城建学院生物工程系,河南平顶山467044; 2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032)摘 要:通过PCR方法从重组质粒扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结构蛋白ORF5基因,将其克隆至原核表达载体pET 32a,得到重组表达载体pET 32a GP5,转化大肠埃希菌BL21。
用不同浓度的IPT G分别于37 诱导。
经SDS PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为31.4ku;薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。
重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测。
关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF5基因;原核表达中图分类号:Q785;S852.659.6文献标识码:A文章编号:1007 5038(2009)12 0063 04猪繁殖与呼吸综合征(Porcine repro ductive and respir atory syndro me,PRRS)是20世纪80年代中后期新发现猪的一种病毒性传染病[1],临床上主要以妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征[2]。
本病于1987年首先暴发于美国,引发了空前的猪 流产风暴 ,给世界养猪业造成了灾难性的损失[3 4]。
1996年郭宝清等在国内[5]首次分离到该病毒。
目前,国内至少有22个省份有本病的发生或流行,成为规模养猪场的主要疫病之一。
2006年以来,该病呈流行态势。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒,属于动脉炎病毒科,病毒基因组大小为15kb,包括9个开放阅读框(ORFs),其中ORF2~7编码病毒的结构蛋白,ORF2~5编码病毒的糖基化蛋白(GP2~GP5),ORF6编码病毒的基质蛋白M,ORF7编码病毒的核衣壳蛋白N[6 7]。
其中ORF5编码病毒的糖基化囊膜蛋白(又称E蛋白)是主要的结构蛋白,参与病毒入侵宿主细胞的过程,并诱导产生中和抗体,ORF5含有4个糖基化位收稿日期:2009 07 06作者简介:尹国友(1976-),男,山东陵县人,讲师,硕士,主要从事分子生物学研究。
*通讯作者[11] 吴兆亮.用Y 参比法测定发酵液中林可霉素的含量[J].中国抗生素杂志,2003,28(11):666 668.[12] 陈 丽,冯建文,谭宝玲,等.紫外分光光度法检测预混料中林可霉素的含量[J].粮食与饲料工业,2007(2):43.[13] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].2005版.北京:中国农业出版社,2005:178 179.[14] 陈 明,耿志明,王 冉,等.高效液相色谱法测定饲料中林可霉素含量[J].江苏农业学报,2008,24(1):99 100.[15] 周小红,黄巧玲.HPLC法测定复方盐酸林可霉素凝胶中盐酸林可霉素的含量[J].海峡药学,2007,19(11):33 34.[16] 姜丙铺,刘 波,宁瑞多,等.H PLC法测定盐酸林可霉素滴眼液的含量[J].黑龙江医药,2007,20(2):97 98.[17] 陈 丽,冯建文,谭宝玲,等.H PLC法检测预混合饲料中林可霉素的含量[J].饲料博览,2006(9):29 31.Determination of Lincomycin Hydrochloride Injection by UV Spectrophotometry FENG Xue zhong1,WU Guang hui1,FA NG Bing hu2,LI H ua peng1,PAN Yuan zhi1,WEN Zi ming1(1.G uang dong Dah uanong Animal H e alth Pr od ucts Co.L td,X inx ing,Guang d ong,527400,China;2.Colle ge of Veterinary M e dicine,S outh China A gr ic ultur al Univ e rsity,Gu angz hou,Gu angd ong,510642,China) Abstract:A U V spectrophotometry m ethod fo r the determination of lincomy cin in linco mycin hydrochlo ride injection w as established w ith0.02mol/L palladium chlor ide as refer ence so lution at380nm 1nm.The calibr ation cur ve fo r lincom ycin w as linear w ithin the concentration r ange o f50 g/mL 250 g/m L(r= 0.9999).T he av erag e recovery rate w as99.5%,and the RSD w as0.9%(n=5).This metho d w as prov ed to be sim ple,rapid and pr ecise.This method can be used for the quality control o f linco mycin hydrochlo ride injection.Key words:lincomy cin hydr ochlor ide;UV spectropho to metr y;content determination点,6个抗原决定簇,中和抗体决定簇位于GP5的中部[8]。
北美洲和欧洲型毒株的GP5分别含有200个和201个氨基酸,还具有一段31个氨基酸的信号肽和3个跨膜功能区[9]。
因此,研究GP5的结构和功能为研制PRRSV新型疫苗与检测试剂盒奠定基础[10]。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种和质粒 E.coli BL21,DH5 由中国动物卫生与流行病学中心实验室保存。
PRRSV重组质粒由构建并保存,PRRSV阳性血清由中国动物卫生与流行病学中心实验室提供。
1.1.2 工具酶及各种试剂 Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Bam H 、H in d 、DNA M arker DL2000、DNA M arker DL1500等试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品;辣根过氧化物酶标二抗为美国Prom eg a公司产品;UNIQ 10柱式DNA胶回收试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。
1.2 方法1.2.1 ORF5基因片段的扩增 参照GenBank中发表PRRSV ATCC VR 2332株全基因组序列,用Primer5.0软件设计特异性引物,并在其中引入Bam H 和H in d 酶切位点,预期扩增产物大小为541bp。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列如下(划线部分表示引入的限制性酶切位点):上游引物P1:5 TA GGAT CCAT GCT CGC CAACGCCA 3下游引物P2:5 GCAAGCTT CTAAGGACGAC CCCATT 3PCR反应:10 buffer5 L、dNTPs(包括dAT P、dGTP、dCT P、dTT P,浓度为10m mol/L) 4 L、上、下游引物1 L、Taq DNA聚合酶(200000单位/mg)1 L、cDNA4 L、加灭菌三蒸水至50 L。
反应条件为95 5min;94 50s, 62 45s,72 1m in,共35个循环;最后延伸10min。
1.2.2 重组质粒的的构建和鉴定 PCR产物与克隆载体连接,连接产物转化到E.coli DH5 感受态细胞,碱裂解法快速提取质粒,利用限制性内切酶H in d 和Bam H 分别对克隆载体和表达质粒pET 32a进行酶切,将纯化回收后的目的片段与表达载体pET 32a连接,连接物转化到E.coli BL21感受态细胞。
碱裂解法提取质粒,用限制性内切酶H in d 和Bam H 进行酶切分析,并对阳性重组表达质粒pET 32a进行测序鉴定。
1.2.3 诱导表达 将转化的BL21感受态细胞涂板挑菌。
阳性菌在添加氨苄青霉素的LB液体培养基中振摇培养过夜后,按1 100转接种含氨苄青霉素的2 YT培养基中,37 振摇培养至对数生长期(0.6~0.8),分别加入终浓度为0.05、0.10、0.25、0.50、1.00mmol/L的IPT G,在37 振摇诱导培养5h。
1.2.4 重组蛋白的纯化 菌体经超声波破碎后,离心得到沉淀,然后用含有去污剂Triton X100和尿素的包涵体洗涤液分步洗涤,除去杂蛋白,再进行SDS PAGE电泳。
电泳后的凝胶浸泡在100m mol/L的KCl溶液中,4 放置。
待电泳条带清晰时切下表达产物所处的条带,装入透析袋中,加入适量的pH7.4的缓冲液,用30V的电压作用30m in,收集电洗脱液。
1.2.5 Western blo t鉴定 将丽春红染色后的NC膜转移至BSA封闭液中,室温轻摇3h~5h后4 封闭过夜;倒掉封闭液,用洗涤液PBST洗膜3次,每次10m in,然后加入一抗溶液,室温下振荡1.5h~2.0h;再用PBST洗膜3次,每次10min,然后加入二抗血清,室温振荡1.5h~ 2.0h;再用PBST洗膜3次,每次10min,最后置于DAB底物显色液中显色,待条带清晰后迅速用蒸馏水终止显色反应。
2 结果2.1 重组质粒的筛选与鉴定重组质粒经Bam H 、H in d 双酶切,酶切下的质粒产物克隆到双酶切过的表达载体pET 32a 中。
获得的重组质粒再经Bam H 、H in d 双酶切鉴定,电泳结果显示酶切片段的大小为541bp,与预期片段大小一致(图1、图2),说明得到阳性重组表达质粒,命名为pET 32a ORF5。
64动物医学进展 2009年 第30卷 第12期(总第197期)M.DNA标准DL2000;1.阳性对照;2.RT PCR产物 M.DNA标准DL2000;1.pM D ORF5;2.pET ORF5M.DNA M arker DL2000;1.Pos itive control;2.RT PCR product M.DNA M arker DL2000;1.pM D ORF5;2.pET ORF5图1 R T PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 图2 重组质粒的酶切鉴定Fig.1 Agrose electrophorsis of RT PCR Fig.2 Identification of recombin ant plasmid w ith r estriction digestion2.2 表达产物的SDS PAGE用120g/L的聚丙烯酰胺凝胶对诱导前和不同IPTG浓度诱导后的样品进行SDS PAGE检测。