普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究
普鲁兰酶性质的研究
一如何获得目的菌株( 1) 普鲁兰酶产生菌的初筛。
取10g 土样加入到装有90mL 无菌水和玻璃珠的三角瓶中, 振荡30min, 使样品充分打散后, 吸取1.0mL 于富集培养基中, 在35℃下振荡培养48h。
取培养液稀释涂布于以普鲁兰糖为唯一碳源的平板分离培养基上, 35℃温箱中培养48h。
将平板倒置, 注入10mL无水乙醇, 室温放置24h, 观察菌落并挑出周围出现透明圈的菌落, 于斜面培养基上进行培养。
( 2) 菌种纯化。
用接种环从斜面培养基上挑取少量菌株接入平板固体培养基, 采用平板划线分离法对菌株进行纯化, 将产生透明圈的单菌落接入斜面培养基, 供菌种复筛用。
( 3) 摇瓶培养法复筛。
将斜面保存的菌种接入种子培养基中, 35℃振荡培养24h 后, 制得菌悬液, 将菌悬液以4%接种量接入菌种筛选摇瓶培养基, 35℃振荡培养48h 后, 测定发酵液中普鲁兰酶活力。
二目的产物的检测方法三目的菌产酶条件的优化四纯酶的获得以及酶学性质研究方案酶的初步纯化酶的部分纯化普鲁兰酶的部分酶学性质。
( 1) 最适温度及热稳定性。
将普鲁兰酶液分别于不同温度下测其活力, 以活力最高者为100%对照, 测试其最适反应温度。
在不同温度下, 将普鲁兰酶液分别保温1h 后, 测定残余酶活力, 以活力最高者为100%对照, 试验温度对普鲁兰酶稳定性的影响。
( 2) 最适pH 值及pH 值稳定性。
将普鲁兰酶液分别于不同pH 值下测其活力, 以活力最高者为100%对照, 测试其最适反应pH 值。
将普鲁兰酶液在不同pH 值缓冲液中于室温保持24h 后, 测定残余酶活力, 以活力最高者为100%对照, 试验pH 值对普鲁兰酶稳定性的影响。
( 3) 金属离子对普鲁兰酶活性的影响。
将不同的无机盐溶液与等量普鲁兰酶液混合, 并使混合液中的无机盐最终浓度达到0.5mmoL/ L, 按1.2.3 的方法测定酶活力, 设不加金属离子组为对照组, 测定金属离子对普鲁兰酶活力的影响。
嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究
嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究赵淑琴;杨孝朴;刘霞;杨学山【摘要】对获得的嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶进行了酶学性质测定.结果表明：普鲁兰酶最适温度为60℃,此温度下处理90 min,残存酶活在70%以上,70℃酶的半衰期大于50 min；最适pH 5.6,在pH 4.5~6.0的范围50℃保温24 h仍具有较高活性；Km为0.036μmol/L,Vmax为20.16μmol/min；Mn2+、Mg2+和 Ca2+对酶有激活作用,其中以Mn2+的激活作用最强,而Cu2+和Zn2+则有抑制作用.研究表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶,对底物有较强亲合力和催化活性,在淀粉糖化工业中有良好的应用前景.%A study was conducted on the enzymatic properties of pullulanase which obtained from Ba-cillus stearothermophilus.The results showed that the optimum temperature was 60 ℃,about 70% of re-sidual activity was still sustained after treatment for 90 min at 60 ℃.The half-life was longer than 50 min at 70 ℃.Optimum pH was 5.6.The enzyme kept a higher activity in the range of pH 4.5 to 6.0 for 24 h at 50 ℃.Km was 0.036μmol/L,Vmax was 20.16μmol/min;Mn2+,Mg2+ and Ca2+ activated the enzyme activi-ty,among them Mn2+ had the most activation.Cu2+ and Zn2+ inhibited the enzyme activity.It is suggested that the pullulanase obtained from B.stearothermophilus belongs to high-temperature acidic enzymes,can be used in starch processing industry.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P130-133,140)【关键词】嗜热脂肪芽孢杆菌;普鲁兰酶;酶学性质【作者】赵淑琴;杨孝朴;刘霞;杨学山【作者单位】甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】TS235.1工业上使用的谷类淀粉是由直链淀粉和支链淀粉构成，且支链淀粉一般占75%～85%.支链淀粉中除主要的α-1，4糖苷键外，还有5%～6%存在于分支点的α-1，6糖苷键.淀粉工业上常用的α-淀粉酶和β-淀粉酶，只作用淀粉中α-1，4糖苷键，对α-1，6糖苷键不起作用，不利于淀粉的充分利用.1961年Bender和Wallenfals首次在Aerobacteraerogenes中发现普鲁兰酶，由于该酶具有切割α-1，6糖苷键的作用而倍受关注.国外作了大量研究，发现不少类似的具有相同功能的新酶［1］.我国早在20世纪70年代就筛选到了产普鲁兰酶的菌株，但由于该菌株所产的普鲁兰酶最适pH为5.5～6.0，与糖化酶的最适pH不符，且在pH ＜5时易失活，所以没有得到广泛应用［2］.为了改变这一现状，本研究对嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）中的普鲁兰酶（Pullulanase）经分离纯化、电泳检查后，对其酶学性质进行研究，主要包括最适温度、最适pH 值、热稳定性、酸稳定性、金属离子依赖性和酶促反应动力学常数等，旨在为该酶在生产实践中的应用提供参考数据.1.1 试验材料1.1.1 菌种嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）购自中科院微生物研究所，菌种编号1.1923；普鲁兰酶为从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离纯化的胞内普鲁兰酶，配制成0.05mg／mL的酶溶液.1.1.2 主要试剂普鲁兰（Pullulan）购自Fluka公司；其他化学试剂均为国产分析纯.1.1.3 主要仪器 TU-1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），HH-601超级恒温水浴箱（常州菲普实验仪器厂），HH-6数显恒温水浴锅（南京莱步科技实业有限公司），HPSJ-3F酸度计（上海精密仪器仪表有限公司）.1.2 试验方法1.2.1 普鲁兰酶的最适作用温度在恒定pH值条件下，测定不同温度对酶活性的影响［3］.具体方法参照淀粉酶的标准测量法［4］，不同温度试验管平行3份，取其平均OD540nm值，查葡萄糖标准曲线，计算酶相对活性，以活性最高者为100%.1.2.2 普鲁兰酶的最适作用pH值在恒定反应温度条件下，测定不同pH值对酶活性的影响［2，5－6］.不同pH值试验管平行3份，取其平均OD540nm值，查葡萄糖标准曲线，计算酶相对活性，以活性最高者为100%.1.2.3 普鲁兰酶的热稳定性将酶液分别在50、60、70、80℃恒温水浴箱中保温，间隔10、20、30、40、50、60、70、80、90min分别取样，在50℃和pH 6.0条件下参照上述方法测定残存酶活力，以未保温酶液活力为100%［3，7］.1.2.4 普鲁兰酶的酸稳定性将酶与不同pH值3.6、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲液混合（缓冲体系为0.2mol／L醋酸缓冲液和0.2mol／L磷酸缓冲液），50℃保温，在1h和24h分别取样［3，8］，于在50℃和pH 6.0条件下参照上述方法测定残存酶活力，以pH 6.0保温1h酶液活力为100%.1.2.5 金属离子对普鲁兰酶活性的影响在酶反应系统中分别添加终浓度为10mmol／L的Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋、Cu2＋，以去离子水代替缓冲液［1，9－10］（避免金属离子与缓冲液相互作用），于50℃和pH 6.0条件下参照上述方法测定酶活性，以不添加金属离子的反应体系酶活性为100%.1.2.6 普鲁兰酶动力学参数的测定在确定普鲁兰酶作用的最适温度和最适pH的基础上，取8支试管，依次加入浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24μmol／L普鲁兰糖溶液1.0mL和最适pH缓冲液1.0mL，最适温度预热5min，再各加1.0mL普鲁兰酶液（各管的底物终浓度依次为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08μmol／L），反应5min.空白管为对应的不同浓度的底物1.0mL＋缓冲液1.0mL＋蒸馏水1.0mL，同时最适温度下进行反应［11］.沸水浴终止反应后，参照上述方法测定还原糖量，计算不同底物浓度时的初速度（葡萄糖μmol／min），用双倒数作图法求出酶的Km值.2.1 酶的最适作用温度和pH值以最高酶活性为100%，计算各温度条件下酶的相对活性.以酶相对活性为纵坐标，温度为横坐标，绘制出的温度-酶相对活性曲线见图1.从图中可以看出，该酶在50～65℃范围内均有较强活性，最适温度为60℃.以最高酶活性为100%，计算不同pH条件下酶的相对活性，绘制出的pH值-酶相对活性曲线见图2.该普鲁兰酶在酸性pH值范围内具有较强活性，最适作用pH 值为5.6.2.2 酶的热稳定性将酶液分别在50、60、70、80℃恒温水浴箱中保温，间隔10、20、30、40、50、60、70、80、90min分别取样测定酶活性，未经热处理的酶活性为100%，计算酶相对活性，结果见图3.该普鲁兰酶具有较好的热稳定性，50℃处理90min，仍保持酶活在90%以上，60℃处理90min，残存酶活在70%以上，但在70℃和80℃酶的半衰期分别小于60min和10min.2.3 酶的酸稳定性将酶液分别与等体积pH3.6、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲液混合，50℃恒温水浴锅中保温，在1h和24h分别测定残存酶活力，以pH 6.0保温1h酶液活力为100%，计算酶的相对活性，结果见表1.在pH 4.5～6.0的范围内酶具有较好的稳定好，在此范围内50℃保温24h与pH 6.0保温1h相比，酶仍残存75%以上的活性.2.4 金属离子对酶活性的影响在酶反应系统中分别添加终浓度为10mmol／L的Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋、Cu2＋，于50℃和pH 6.0条件下测定酶相对活性，以不添加金属离子酶活性为100%，计算酶的相对活性，结果见表2.Mn2＋、Mg2＋和Ca2＋对普鲁兰酶有激活作用，其中以Mn2＋的激活作用最强；Cu2＋和Zn2＋对普鲁兰酶有抑制作用；Na＋对普鲁兰酶的作用不明显.2.5 酶的Km值和Vmax值在普鲁兰酶作用最适温度（60℃）和最适pH值（pH 5.6）条件下，以反应体系中底物（普鲁兰糖）终浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08μmol／L，测定酶促反应的初速度（葡萄糖μmol／min），绘制v-［S］动力学曲线图，并用双倒数作图（图5）法求出酶的Km值和Vmax值.由图4可以看出，普鲁兰酶催化反应的初速度与底物浓度呈典型的双曲线关系，说明该酶催化普鲁兰糖的反应遵循米氏方程.根据双倒数图的y＝0.001 8x＋0.049 6，即1／v＝0.0018.1／［S］＋0.049 6，得知1／Vmax＝0.049 6，Km／Vmax＝0.001 8，故酶的最大速度Vmax＝20.16μmol／min，Km＝0.036μmol／L.普鲁兰酶主要用于食品工业生产中，将α-淀粉酶、β-淀粉酶所不能水解的支链淀粉彻底水解，提高淀粉的转化率，这不仅要求酶活性要强，而且作用的最适温度相对较高，最适pH相对较低，酸热稳定性要好.从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离纯化的普鲁兰酶经测定，最适作用温度为60℃，与文献报道的嗜酸性普鲁兰糖芽孢杆菌普鲁兰酶（Promozyme）的最适温度相同［12－13］，而低于WQBG2-3普鲁兰酶的最适温度（75℃）［14］，但热稳定性好，60℃处理90min，残存酶活在70%以上，70℃的半衰期大于50min.而市场上销售的Promozyme在60℃下60min仅有20%的原酶活力［15］.嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶作用的最适pH 5.6，高于Promozyme的最适pH 4.5，而与WQBG2-3普鲁兰酶的最适pH 5.5相近，但酸稳定性较好，在pH 4.5～6.0的范围50℃保温24h仍具有较高活性.这表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶能够耐受酸热.嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶催化普鲁兰糖反应的初速度与底物浓度呈典型的双曲线关系，说明该酶是典型的米氏动力学酶.本试验测定出其Km为0.036μmol／L （Vmax为20.16μmol／min），与WQBG2-3普鲁兰酶相近（0.035），而小于其他一些普鲁兰酶［16］.这表明，嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶和WQBG2-3普鲁兰酶与底物（普鲁兰糖）的亲合力及活性相当，均优于其他一些普鲁兰酶.Mn2＋、Mg2＋和Ca2＋对嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶有激活作用，其中以Mn2＋的激活作用最强，而Cu2＋和Zn2＋对普鲁兰酶有抑制作用.这与文献报道的普鲁兰酶的特性是一致的［14－15］.因此，嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶，对底物有较强亲合力和催化活性，针对食品工作中淀粉糖化的生产条件，以及要采用各种不同的灭菌条件和防止杂菌污染，具有较好应用前景.【相关文献】［1］马晓军，张晓君，王锐，等.碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究［J］，西北植物学报，2002，22（4）：883-888［2］唐宝英.耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选及发酵条件的研究［J］.微生物学通报，2001，28（1）：39-43［3］杜先锋，薛正莲.普鲁兰酶的纯化及其性质［J］.安徽机电学院学报，1999，14（1）：6-30 ［4］唐兵，周林峰，陈向东.嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质［J］.微生物学报，2000，40（2）：188-192［5］ Plant A R，Morgan H W，Daniel R M.A highly stable pullulanase fromThermusaquaticusYT-1［J］.Enzyme Microb Techno1，1986，8：668-720［6］陈金全.产耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选鉴定及其酶学性质初探［D］.昆明：云南师范大学，2005［7］夏子芳，王正祥.Thermotogamaritima普鲁兰酶的基因克隆与酶学性质研究［J］.食品与发酵工业，2007，33（14）：19-22［8］刘维全.动物生物化学实验指导［M］.北京：中国农业出版社，2008［9］周瑞芳，英恒龙，彭风鼎.稻米中普鲁兰酶的纯化与性质的研究［J］.中国粮油学报，1994，9（1）：11-15［10］孙国政，甘伯中，艾对元.牦牛乳酥油源白地霉S122产脂肪酶培养基的优化［J］.甘肃农业大学学报，2013，48（1）：135-139［11］ Kunamneni，Singh S A.Improved high thermal stability of pullulanase from a newly isolated thermophilicBacillussp.AN-7［J］.EnzMicrobial Technol，2006，39：1399-1404［12］程池.普鲁兰酶Promozyme 200L及其生产菌种［J］.食品与发酵工业，1992（6）：72-76［13］陆健，金冲，顾国贤.普鲁兰酶及其生产菌种［J］.酿酒，1998（5）：1-6［14］唐嘉.云南温泉亚栖热菌产耐热普鲁兰酶的研究［D］.昆明：昆明理工大学，2007 ［15］沃尔夫冈.埃拉.工业酶的制备与应用［M］.2版.杨胜利，译.北京：化学工业出版社，2006 ［16］ Yuzuru Suzuki，Masaharu Chishiro.Production of extracellular thermostable pullulance by an amylolytic obligately thermophilic soil bacterium［J］.European J Appl Microbiol Biotechnol，1983，17：24-29。
产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究 建平中学 蔡羽洁
产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究高中1,4-糖苷键1,6-糖苷键I、II型普鲁兰酶水解健酶的类型产物加入唾液淀粉酶普鲁兰糖结构产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究摘要：I型普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）能够专一水解普鲁兰多糖α-1，6糖苷键，在工业、食品业、医疗保健等行业中具有重要的应用意义。
本研究采用唯一碳源法从稻田来源的土样中培养筛选到若干株产普鲁兰降解酶的菌株，并通过16S rDNA序列分析鉴定了其中的产酶菌株Ps-1为假单胞菌属。
该菌株在可溶性淀粉为底物诱导条件下表达，摇瓶发酵产普鲁兰酶的水平达到15 U/mL。
该酶的最适酶活反应温度为60℃，最适酶活反应pH 为6.0，具有良好的温度稳定性和适应性；适应工业发展的需求。
通过TLC和HPAEC方法鉴定该菌株所产的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够专一水解普鲁兰多糖中的α-1，6葡萄糖糖苷键产生麦芽三糖。
将Ps-1所产普鲁兰酶与淀粉糖化酶协同糖化淀粉比单一添加糖化酶的实验组别具有更高的葡萄糖含量，两酶协同作用更利于高葡萄糖产物的制备，具有一定的工业应用价值。
关键词：普鲁兰降解酶；I型普鲁兰酶；酶学特性；假单胞菌属；一、研究背景普鲁兰降解酶（pullulan degrading enzymes）是一种能够专一水解普鲁兰多糖和相应低聚糖中的α-1，6葡萄糖糖苷键以及特定位置的α-1，4葡萄糖糖苷键，生成麦芽糖及麦芽三糖等产物糖基水解酶[1]。
它广泛的分布于动物、植物、真菌、酵母和细菌中。
根据IUBMB（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）建立的两类分类标准[2]（催化反应和底物特异性）把普鲁兰降解酶分成四类（见下图）：不同类型的普鲁兰降解酶鉴定标准如下表：普鲁兰降解酶分类酶学分类编号水解键类型水解普鲁兰多糖产物γ-淀粉酶EC 3.2.1.3 外切酶葡萄糖新普鲁兰酶EC 3.2.1.135 α-1，4糖苷键潘糖（三糖）、少量单糖异普鲁兰酶EC 3.2.1.57 α-1，4糖苷键异葡糖基麦芽糖（三糖）I型、II型普鲁兰酶EC 3.2.1.41 α-1，6糖苷键麦芽三糖其中I型普鲁兰酶能够专一水解1,6糖苷键，与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用可以将最小单位的支链分解，最大限度的利用淀粉原料。
碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究
西北植物学报2002,22(4):883—888Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.文章编号:1000-4025(2002)04-0883-06碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究X马晓军1,张晓君2,王 锐1*,陈 拓2,杨 玲1,冯清平1 (1兰州大学生命科学学院,兰州730000;2中国科学院寒区旱区环境与工程研究所,兰州730000)摘 要:从儿童食品中分离筛选到1株产碱性普鲁兰酶活性较高的菌株,编号为SX-12,初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.。
研究了SX-12原生质体制备与再生最佳条件。
其原生质体经紫外线诱变处理,选育出产碱性普鲁兰酶的高产菌株SX-12C67,酶活由出发菌株的2.42U/mL提高到6.87U/mL,提高了约1.8倍。
在此基础上对产酶条件进行了优化,优化后的最佳发酵培养基为:可溶性淀粉3%,蛋白胨1.0%,酵母膏0.5%,K2HP O40.2%,M g SO4.7H2O0.05%,M nCl20.0001%,最适pH9.5,最适温度40℃。
初步研究了酶的部分性质,酶反应的最适pH、温度分别为10.0～10.5和55℃。
在55℃反应条件下,酶在pH6.0～11.0的范围内都具有一定的活性。
Ca2+、M n2+、M g2+等离子是酶的激活剂,Zn2+、Hg2+等离子是抑制剂。
关键词:原生质体的制备;紫外诱变;碱性普鲁兰酶;产酶条件优化;酶性质中图分类号:Q939.99 文献标识码:AStudies on screening and breeding of alkaline pullulanase producing bacterium and regulation of nutritionM A Xiao-jun1,ZHANG Xiao-jun2,WA NG Rui1*,CHEN Tuo2,YANG Ling1,FENG Qing-ping1(School of Life Science,Lanzhou Un ivers ity,Lanzh ou730000,Ch ina;2Laboratory of Ice C or e and ColdRegion Environment,Cold and Arid Region Environment Engineering Res earch In stitute,Ch ines eAcadem y S cien ce,L anz hou730000,C hina)Abstract:Bacillus sp.SX-12,a strain producing alkaline pullulanase,w as isolated fr om baby food.T he optimal condition fo r preparating of the pro to plast and its reg ener ating w er e studied.Protoplast of Bacillus sp.SX-12w ere induced by ultraviolet ray.One High pr oducing strain(SX-12C67)w ere obtained fr om process of screening.The activity o f al-X收稿日期:2001-06-06;修改稿收到日期:2001-10-11基金项目:中国科学院寒区旱区环境与工程研究所冰芯室创新项目(210506)作者简介:马晓军(1971-),男(汉族),博士,工程师。
普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究的开题报告
普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究的开题报告一、研究背景普鲁兰酶是一种重要的蛋白酶，能够催化蛋白质中的特定肽键断裂，具有广泛的应用前景。
目前，普鲁兰酶已经被广泛应用于蛋白质纯化、蛋白质结构分析、酶学特性研究等领域，因此对于普鲁兰酶产生菌的筛选及其酶学性质的研究具有重要意义。
二、研究目的本研究的主要目的是从自然环境或者人体肠道等样品中筛选出能够产生普鲁兰酶的菌株，并对其进行深入的酶学研究，以进一步了解其酶学特性及应用前景。
三、研究内容（1）菌株的筛选。
从自然环境或人体肠道等样品中筛选出能够产生普鲁兰酶的菌株。
（2）菌株的鉴定。
对筛选出的菌株进行形态学、生理生化等方面的鉴定，确定其分类地位。
（3）普鲁兰酶的酶学特性研究。
利用光谱等技术对普鲁兰酶的催化机理、催化基团等进行深入研究，同时探究其对底物的特异性、酶动力学特性等。
（4）普鲁兰酶的应用研究。
探究普鲁兰酶在蛋白质纯化、蛋白质结构分析等领域的应用前景，同时探究其在制药、医疗等领域的应用前景。
四、研究意义（1）为普鲁兰酶的研究提供新的菌株资源，为生物工程、制药、医疗等领域的应用提供更多选择；（2）深入研究普鲁兰酶的结构和功能，揭示其催化机理及其对底物的特异性等酶学特性，有助于更好地探究普鲁兰酶的应用前景。
五、研究方案（1）样品的采集和处理。
从自然环境或人体肠道等样品中收集潜在的普鲁兰酶产生菌株，采用涂布法等方法进行分离和纯化。
（2）菌株的鉴定。
利用形态学、生理生化等方面的方法对菌株进行鉴定，确定其分类地位。
（3）普鲁兰酶的生产。
培养筛选出来的菌株，并对其发酵条件进行优化，最终得到高产普鲁兰酶的菌株。
（4）普鲁兰酶的纯化和酶学特性研究。
对普鲁兰酶进行常规分离纯化，利用光谱等技术研究其结构和功能，探究其催化机理和酶学特性。
（5）普鲁兰酶的应用研究。
探究普鲁兰酶在制药、医疗等领域的应用前景，为其进一步的应用研究提供理论支持。
六、预期成果（1）从自然环境或人体肠道等样品中筛选出普鲁兰酶产生菌株；（2）深入研究普鲁兰酶的酶学特性，详细揭示其结构和功能；（3）探究普鲁兰酶在制药、医疗等领域的应用前景，并为其应用提供更多选择。
_植物内生源产普鲁兰酶细菌的筛选及其酶活性测定
植物内生源产普鲁兰酶细菌的筛选及其酶活性测定摘要作为一种非常重要的药用植物的蒺藜，其具有很多种的药理活性，比如调血脂、降低血压、催欲、抗癌抗菌、利尿等等。
现在有很多的研究方向是与蒺藜植株内主要的成分以及药理作用有关。
最近几年的研究表明植物的内生菌与植物的许多药用机理有着很紧密的关系。
因此本实验就以蒺藜为试验材料，经过用固体分离培养基培养其的根茎组织，分离得到14种细菌，再通过用鉴别培养基筛选出6株产普鲁兰酶的菌株，但只有一株水解圈比较大，对其编号WKX11。
为了进一步测定所筛选出来的细菌的产酶情况及其所产酶的活性，本实验用了产酶培养基对试验所筛选出来的细菌所产酶进行了酶活性测定。
最后从本实验所培养的细菌菌液中提取DNA，对其DNA进行PCR扩增，然后将试验中获得的PCR产物在电泳液里进行凝胶电泳，电泳后获取目的条带，将目的条带克隆后进行测序，获得目标菌株的保守序列；将测序获得的序列放到NCBI数据库中比对。
最后综合生物学特征和分子生物学测定结果，将目标菌株确定为Aerobacter Aerogenes。
其具有产普鲁兰酶的特性，可作为产普鲁兰酶的备用菌株。
关键词：普鲁兰酶，蒺藜，筛选，16SrDNAISCREENING AND PRODUCTION OF BIOGENICACTIVITY ASSAY PULLULANASE BACTERIA INPLANTSABSTRACTTribulus as a very important medicinal plant, which has a wide variety of pharmacological activities, such as adjusting blood fat, lower blood pressure, aphrodisiac, anti-bacterial, diuretic and so on. There are a lot of studies and research on the pharmacological effects of the component within its plant. In recent years many studies have shown that the efficacy of plant endophyte and plants has a very close relationship. Therefore, this experiment Take terrestris as materials, after separation of the solid culture medium with its roots organization, isolated 14 kinds of bacteria, and then screened by differential medium pullulanase producing strain of six, but only one hydrolysis circle is relatively large, their number WKX11. Produced and its activity measured for enzyme production in order to further filter out bacteria, this experiment with the medium on enzyme tests filter out bacteria produced the enzyme activity assay. The last extract from this experiment in broth culture bacterial DNA, PCR amplification of their DNA, and then the PCR product was obtained in the test solution in electrophoresis gel electrophoresis to obtain target band after electrophoresis, the target band after cloning and sequencing were obtained conserved sequence of the target strain; sequencing will get into the NCBI database comparison. The final consolidated morphology, biochemical and molecular biological assay results, the target strain identified as Aerobacter Aerogenes. Having pullulanase producing properties, it can be used as spare production pullulanase strains.KEY WORDS:pullulanase,Tribulus,isolation,16SrDNAII目录摘要 (I)ABSTRACT (II)第一章文献综述 (3)1.1 内生菌 (3)1.1.1 内生菌的多样性 (3)1.1.2 植物内生菌的作用 (3)1.1.3 国内外内生菌的研究进展 (4)1.2 普鲁兰酶 (4)1.2.1 普鲁兰酶的分类 ............... 错误！未定义书签。
普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究
（ １） 普鲁兰酶产生菌的初筛。取 １０ｇ 土样加入到装有 ９０ ｍＬ 无 菌 水 和 玻 璃 珠 的 三 角 瓶 中 ， 振 荡 ３０ｍｉｎ， 使 样 品 充 分 打 散 后 ， 吸 取 １．０ｍＬ 于 富 集 培 养 基 中 ， 在 ３５℃下 振 荡 培 养 ４８ｈ。取 培 养 液 稀 释 涂 布 于 以 普 鲁 兰 糖 为 唯 一 碳 源 的 平 板 分 离 培 养 基 上， ３５℃温 箱 中 培 养 ４８ｈ。将 平 板 倒 置， 注 入 １０ｍＬ 无水乙醇， 室温放置 ２４ｈ， 观察菌落并 挑 出 周 围 出 现透 明 圈 的菌落， 于斜面培养基上进行培养。
表 ２ 不同金属离子对普鲁兰酶活力的影响
无机盐
对照
Ｆｅ２（ ＳＯ ４） ３ Ｋ２ＳＯ ４ ＺｎＳＯ ４ ＣｕＳＯ ４ ＡｇＮＯ ３ ＨｇＣｌ２
相 对 酶 活 力 ∥％ １００ １８５ １０２ ８８ ４３ ６２ ４６
无机盐
Ｐｂ（ Ａｃ） ２ ＭｇＳＯ ４ ＫＣｌ Ｎ ｉＣ ｌ２ ＭｎＳＯ ４ ＣａＣｌ２
《现代农业科技》２００８ 年第 １３ 期
园艺博览
普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究
周念波 魏丙卓 孙 杰 王 晶
（ 武汉生物工程学院生物工程系， 湖北武汉 ４３０４１５）
摘要 利用选择性培养基从淀粉加工厂附近土壤中分离出 １１ 株具有产普鲁兰酶能力的菌株， 对其中产酶能力 最高 的 ＰＢ１ 菌株 所产 酶进行了性质测定。结果显示： ＰＢ１ 所产普鲁兰酶活力为 ３．２５Ｕ／ ｍＬ； 该酶最适反应温度为 ６０℃， 在低于 ７０℃范围内热稳定性较好； 最适反 应 ｐＨ 值为 ５．０￣６．０， 在 ｐＨ 值为 ４．０￣７．５ 范围内稳定； Ｆｅ３＋对该酶活性有明显的促进作用， 而 Ｃｕ２＋、Ａｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋对该酶活性有强烈的抑制作用。
酸性普鲁兰酶的筛选、性质及应用研究
分类号______________ 密级_______________U D C_______________昆明理工大学硕士学位论文酸性普鲁兰酶的筛选、性质及应用研究研究生姓名陈辉指导教师姓名、职称韩鹏讲师学科专业食品科学研究方向食品生物技术论文工作起止日期2017年9月~ 2019年4月论文提交日期2019年4月昆明理工大学硕士学位论文昆明理工大学硕士学位论文摘要随着科技和生物技术的蓬勃发展，来自微生物发酵中得到的淀粉水解酶系在食品、酿造、饲料与洗涤等工业领域有着巨大的发展前景。
普鲁兰酶作为一种重要的淀粉脱支酶受到了研究者的广泛关注。
本文研究了实验室之前筛选鉴定得到的一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103，对其普鲁兰酶基因进行了克隆表达，优化了其表达水平，研究了其酶学性质及应用前景。
后续又从土壤中分离筛选到了一株产普鲁兰酶的野生菌株，根据其形态特征、16S rDNA鉴定和生理生化试验鉴定其为委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）C105，优化其产酶能力，进行该酶的纯化及性质研究。
主要研究内容与结果如下：1、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Y103普鲁兰酶基因的克隆表达、酶学性质及应用研究对实验室之前筛选鉴定得到的巨大芽孢杆菌Y103的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中克隆表达。
以巨大芽孢杆菌中的普鲁兰酶基因为模板，设计特异性引物，通过PCR方法扩增目的基因，以大肠杆菌pET27b为载体质粒，成功构建重组质粒，先后在大肠杆菌JM109和BL21（DE3）中成功转化，成功异源表达，通过单因素试验优化其表达水平，重组普鲁兰酶的酶活达到6.38 U/mL，是未优化前1.16 U/mL的5.5倍（P < 0.05）。
超声破碎得到重组普鲁兰酶粗酶液，利用Ni-IDA亲和层析对重组普鲁兰酶粗酶液进一步纯化达到电泳纯。
回收率为54.0%，普鲁兰酶比活为43.2 U/mg，SDS-PAGE测定其分子量为110.8 KDa，其最适pH和温度分别为6.0，55 ℃，在pH 6.0 - 8.0和45 ℃ 以下保持80%以上的相对稳定，金属Ca2+和尿素对其酶活有很大的促进作用，分别达到289.2%和221.8%。
普鲁兰酶的研究进展
普鲁兰酶的研究进展董桂秀;杨平平;夏涛;邱永乾;毛相朝【摘要】普鲁兰酶,是能够专一性切开支链淀粉中分支点处α-1,6-糖苷键的一种脱支酶,它在以淀粉为原料的食品工业中有着重要的应用.通过对该领域研究成果的整理,对产普鲁兰酶的微生物选育、酶的分离纯化、酶学性质特点、酶的应用等方面进行了综述.%Pullulanase ia a type of debranching enzyme which can specifically attack a-1,6 linkages in amylopectin, and it has important applications in (pod processing industry. In this paper, the research findings about pullulananse were summarized, and the breeding of pullula-nase-producing microorganism, as well as the separation, purification, characteristics and application of the pullulanase were reviewed.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)018【总页数】5页(P9874-9877,9958)【关键词】普鲁兰酶;菌种选育;纯化;应用;研究进展【作者】董桂秀;杨平平;夏涛;邱永乾;毛相朝【作者单位】山东轻工业学院食品与生物工程学院,山东济南250353;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛266003;山东轻工业学院食品与生物工程学院,山东济南250353;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛266003;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛266003;中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛266003【正文语种】中文【中图分类】S188普鲁兰酶属于а-淀粉酶第13家族，是能够专一性切开支链淀粉中分支点处а-1，6-糖苷键的一种脱支酶。
新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质
新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质王青艳;申乃坤;朱婧;秦艳;朱绮霞;谢能中;李亿;黄日波【摘要】【目的】筛选并克隆表达高酶活且具有一定热稳定性的新型普鲁兰酶。
【方法】克隆Tumebacillus flagellatus GST4的普鲁兰酶基因pulB，构建重组质粒后转化宿主菌大肠杆菌进行诱导表达，再运用亲和层析进行纯化并分析其酶学性质和结构。
【结果】pulB在大肠杆菌中实现可溶性表达，发酵液上清酶活力达到78 U／mL，粗酶液经纯化后比活力为258 U／mg。
重组酶 PulB最适反应温度和 pH 值分别为55℃和5．0，在较窄的酸性范围内（pH值4．5～5．5）酶活力比较稳定；对普鲁兰糖的Km ＝（16．28±0．03）mg／mL，Vmax ＝（22．05±0．02）μmol·min－1·mg－1。
PulB的DNA序列与 GenBank数据库里的任何序列都没有同源性，在蛋白质序列上，由基因pulB编码的氨基酸序列与T．aegyptius 的环麦芽糖糊精酶相似性最高，BlastX比对的Identities为54％，Positives为69％，SMART结构预测分析发现，pulB具有淀粉酶的结构域。
底物特异性分析表明，它可水解普鲁兰糖和支链淀粉生成线性的低聚糖或麦芽三糖。
【结论】重组酶 PulB是尚未报道的新型普鲁兰酶，它可水解普鲁兰糖和支链淀粉，属Ⅰ型普鲁兰酶。
%[Objective]Screening,cloning,heterologous expression of the pullulanase encoding gene from Tumebacillus flagellatus GST4 in order to obtain efficient expression of a new pullulanase and enhance its activity and thermosatbility.[Methods]Cloning,construction of recombinant and heterologous expression of pullulanase gene in Escherichia coli,purification by Ni-chelating affinity chromatography from cell free culture supernatant and characterization of pullulanase were carried out.[Results]The pullulanase gene pulB was cloned and expressedsuccessfully in E.coli,and the activity of cultur-al supernatant can reach 78 U/mL.And PulB was purified to homogeneity and the specific ac-tivity was 258 U/mg.The optimal temperature of purified PulB is 50℃,its optimal pH value is 5.0 and activity remains stable within the a-cidic range of pH4.5~5.5.PulB displayed typical Michaelis-Menten kinetics,where its Kmis(16.28±0.03)mg/mL andVmax is(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1,respectively,when used pullulan as substrate.GenBank blast results show that there is no homologous DNA se-quences with pulB,and the encoding protein of PulB had the highest identity (54%)with cy-clomaltodextrinase from Thermicanus aegyptius.We find that it has amylase structure do-main by online SMART searching.The substrate specificity analysis shows that it typically hydrolyze pullulan and amylopectin to produce liner oligosaccharides or maltotriose.[Conclu-sion]PulB is a new starch/pullulan hydrolase,which has not yet been reported.It can hydro-lyze pullulan or amylopectin and belong to type I pullulanase.【期刊名称】《广西科学院学报》【年(卷),期】2016(032)002【总页数】10页(P136-145)【关键词】Ⅰ型普鲁兰酶;膨胀芽孢杆菌;克隆表达;酶学性质【作者】王青艳;申乃坤;朱婧;秦艳;朱绮霞;谢能中;李亿;黄日波【作者单位】广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007;广西科学院，国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西南宁 530007【正文语种】中文【中图分类】Q93【研究意义】普鲁兰酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是α-淀粉酶家族GH13中的一种脱支酶，它能够专一性的水解普鲁兰、淀粉和糖原中的α-1,6-糖苷键[1]。
普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质
普鲁兰酶的分离纯化及部分酶学性质周念波【摘要】对盐球菌(Halococcus sp.) Z1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产的普鲁兰酶粗酶液的耐热耐酸性进行了比较研究,并采用(NH4)2SO4盐析、透析、DEAE-Sephadex A25阴离子交换、Sephadex G-1 00凝胶过滤对Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶进行分离纯化,并测定了其部分酶学性质.结果表明Halococcus sp.Z1所产普鲁兰酶在低于65℃和pH4.0～7.5范围内有很好的稳定性,最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0～5.4,相对分子质量为8.17×104,Km值为0.24 mg/mL.【期刊名称】《食品工程》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】5页(P37-40,48)【关键词】普鲁兰酶;纯化;性质【作者】周念波【作者单位】武汉生物工程学院生物工程系,湖北武汉430415【正文语种】中文【中图分类】TS201.2+5普鲁兰酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是能够专一性地作用于普鲁兰糖、支链淀粉、糖原及相应低聚糖中的α-1，6-糖苷键，从而切下整个侧枝的一种脱支酶，已广泛应用于以淀粉为原料的各种工业生产中。
文献报道过的普鲁兰酶有多种，在应用方面近年来主要以开发耐热耐酸普鲁兰酶为主。
本试验以实验室筛选所得的盐球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的发酵粗酶液为研究对象，探讨其在热稳定性和酸碱稳定性方面的性质，对其中符合耐热耐酸特性的普鲁兰酶，进一步进行分离纯化和其他方面酶学性质的研究。
1.1 试剂普鲁兰糖，纯度99%，上海普奥生物科技有限公司；DEAE-Sephadex A25，上海楷洋生物技术有限公司；Sephadex G-100，南京都莱生物技术有限公司；低分子量标准蛋白质，相对分子量1.44×104～9.74×104，大连宝生物工程有限公司。
产普鲁兰酶菌株ZXYG5的分离鉴定及其普鲁兰酶活性
产普鲁兰酶菌株ZXYG5的分离鉴定及其普鲁兰酶活性孙会忠;王小东;宋月芹;朱金峰;李广良;孙明辉;侯小改【摘要】After being inoculated with amylopectin and pullulan as sole carbon source successively, strain ZXYG5 with potential of pullulanase production was isolated from gut of tobacco beetle (Lasioderma serricorne). The optimal fermentation condition was 35℃, 160 r?min-1 and 42 h with maximum pullulan yield of 4.2 U?mL-1 . Subsequent standard morphological observation, physio-logical and biochemical property analysis, and 16S rDNA sequencing test indicated strain ZXYG5 was Pantoea sp., and was named Pantoea sp. ZXYG5. Strain ZXYG5 with satisfactory initial pullulanase activity can be used as a good alternative to conventional mu-tation and genome breeding.%通过以支链淀粉为唯一碳源的分离培养基和以普鲁兰糖为唯一碳源的鉴别培养基复筛,从烟草甲( Lasioderma serri-corne)肠道中分离得到一株产普鲁兰酶菌株,编号为ZXYG5.该菌株在以普鲁兰糖为碳源的产酶培养基35 ℃、160 r?min-1条件下发酵42 h时,普鲁兰酶活性达到最大值4.2 U?mL-1 .通过光学显微镜和扫描电子显微镜的形态观察、生理生化特性和16S rDNA保守序列分析,将菌株ZXYG5初步鉴定为泛菌属Pantoea sp.,命名为Pantoea sp. ZXYG5.该菌株具有较高的初始产普鲁兰酶活性,可作为常规诱变育种和全基因组育种的良好备选菌株.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(044)006【总页数】5页(P629-633)【关键词】普鲁兰酶;肠道细菌;分离;16SrDNA;酶活性【作者】孙会忠;王小东;宋月芹;朱金峰;李广良;孙明辉;侯小改【作者单位】河南科技大学农学院,河南洛阳 471003;河南科技大学农学院,河南洛阳 471003;河南科技大学农学院,河南洛阳 471003;河南省烟草公司漯河市公司,河南漯河 462000;河南省烟草公司漯河市公司,河南漯河 462000;河南省烟草公司漯河市公司,河南漯河 462000;河南科技大学农学院,河南洛阳 471003【正文语种】中文【中图分类】Q939.9(1.河南科技大学农学院 ,河南洛阳471003；2.河南省烟草公司漯河市公司 ,河南漯河462000),淀粉酶主要分为4大类 ,分别是α-淀粉酶(α-amylase ,EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(β-amylase ,EC3.2.1.2)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase ,EC3.2.1.3)和脱支酶(isoamylase ,EC3.2.1.9).普鲁兰酶(pullulanase ,EC3.2. 1.41)属于脱支酶范畴 ,它只水解糖原或支链淀粉分支点的α-1 ,6糖苷键 ,使支链淀粉脱支形成长短不一的直链淀粉[1].自然界的淀粉大多含有80%的支链淀粉[2],所以 ,普鲁兰酶是淀粉高效利用不可缺少的关键酶 ,是微生物功能酶研究的热点之一[3－5].但不同来源的普鲁兰酶对底物的作用专一性不同 ,因此 ,普鲁兰酶产生菌的筛选分离工作一直在进行.截至目前 ,除了丹麦NOVO公司成功研发的由酸性普鲁兰芽孢杆菌生产的普鲁兰酶外[6],文献报道的绝大多数野生菌株活性普遍较低 ,即使是通过基因工程技术构建的工程菌株[7－9],也远没有达到理想的发酵产酶效果.所以 ,筛选分离发酵产酶活性较高的产普鲁兰酶菌株仍然是一项长期而艰巨的工作.资料显示 ,动物肠道菌在发酵产酶方面往往更具优势 ,而且在产酶活性、生物安全等方面也更容易得到保障[10].昆虫是一个种类多、数量庞大的生物群体 ,从其肠道中分离各类有益菌也逐渐得到重视[11 ,12].烟草甲(Lasioderma serricorne)是一种隶属窃蠹科(Anobiidae)的世界性昆虫[13],该虫具有取食广泛、生存能力强的特点 ,主要以幼虫蛀食贮存期烟叶、粮粒、药材等农资而完成生活史发育.迄今为止 ,关于烟草甲内生细菌来源的产普鲁兰酶菌株分离鉴定方面的研究尚未见报道.基于以上背景 ,本文拟以烟草甲为试验材料 ,分离鉴定产普鲁兰酶菌株 ,旨在丰富高效产普鲁兰酶菌株生物资源库.1.1 试验材料烟草甲:采自河南科技大学农学院烟草研究室烤烟仓储室.固体分离培养基:蛋白胨8 gűL－1,酵母提取物6 gűL－1,支链淀粉3 gűL－1,NaCl 5 gűL－1,琼脂粉18 gűL－1,蒸馏水定容 ,pH 7.0.鉴别培养基:蛋白胨6 gűL－1,酵母提取物4 gűL－1,NaCl 5 ,普鲁兰糖2 gűL－1,琼脂粉18 gűL－1,蒸馏水定容 ,pH 7.0.LB种子培养基:蛋白胨10 gűL－1,酵母粉5 gűL－1,NaCl 5 gűL－1,蒸馏水定容 ,pH 7.0.产酶培养基:普鲁兰糖3 gűL－1,酵母粉10 gűL－1,KH2PO40.5 gűL－1,K2HPO40.5 gűL－1,FeSO40.01 gűL－1,MgSO47H2O 0.5 gűL－1,蒸馏水定容 ,pH 7.0.1.2 试验方法1.2.1 产普鲁兰酶菌株的筛选从仓储烤烟上挑取8头4龄健康烟甲虫老熟幼虫 ,先饥饿24 h ,用无菌水冲洗 ,然后用灭菌细线将分别口器和肛门两端绑扎.接着用75%乙醇进行体表浸泡消毒3 min ,再用0.1 molűL－1升汞消毒3 min ,在超净工作台中将消毒后的虫体固定于蜡盘解剖 ,取肠道 ,并划破 ,用无菌水冲洗内容物 ,收集于灭菌离心管.加入0.5 mL无菌水稀释后 ,分别取20 μL、50 μL、80 μL不同体积稀释液涂布于固体分离培养基 ,恒温培养箱中30℃培养48 h后 ,选取典型菌落连续进行3次平板划线纯化 ,并将纯化菌种斜面4℃保存.通过固体分离培养基初筛后 ,将初筛菌株转接于普鲁兰糖鉴别培养基.30℃恒温培养48 h ,滴加卢氏碘液 ,将具有水解圈者初步确定为具有普鲁兰酶活性菌株.1.2.2 产普鲁兰酶菌株的产酶活性测定粗酶液制备:将具有水解圈菌株接种到装有50 mL LB种子培养基的三角瓶中,35℃、160 rűmin－1摇床培养16 h ,然后取6 mL转接于装有75 mL产酶培养基的1 000 mL三角瓶中 ,相同条件下摇床培养58 h ,期间每隔4 h取样1次 ,发酵上清液即为粗酶液.采用DNS法对粗酶液进行酶活性测定[14].1.2.3 菌株的鉴定应用普通光学显微镜和扫描电子显微镜对菌株进行形态观察[15]；生理生化指标测定方法参考文献进行[16 ,17].菌株的16S rDNA分析:将ZXYG5菌株接种于LB液体培养基,37℃ ,200 rű min－1摇床培养12 h ,获取菌液.采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver.2.0试剂盒提取ZXYG5基因组DNA.16S rDNA PCR扩增引物为:正向引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ,反向引物:1492R:5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR扩增体系(20μL):10×Ex Taq PCR buffer 2 μL ,dNTP(10 mmolű mL－1)1.6 μL ,正、反向引物(20 μműmL－1)各1 μL ,DNA模板1 μL ,Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL ,双蒸水13.2 μL.扩增程序:94℃预变性5 min；94℃变性45 s ,50℃退火45 s ,72℃延伸1 min 40 s ,循环30次；72℃最终延伸10 min.目的片段长度为1.5 kb左右 ,PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳 ,目的条带采用TaKa-Ra MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver.3.0进行胶回收 ,回收产物与TaKaRa pMDTM18-T Vecter连接 ,并将重组质粒转化于DH5α感受态细胞,37℃培养过夜 ,经蓝白斑筛选 ,挑选阳性克隆摇菌 ,测序由北京奥克鼎盛生物科技有限公司完成.将测序获得的ZXYG5的16S rDNA碱基序列提交NCBI进行相似性比对 ,并采用MEGA 6.06软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育进化树.菌株鉴定按照参考文献进行[18 ,19].2.1 产普鲁兰酶菌株的分离通过固体分离培养基的分离培养,获得一株水解圈大而显著的菌株,编号为ZXYG5；将初筛菌株ZXYG5再通过普鲁兰糖鉴别培养基的鉴别培养 ,进一步明确该菌株具有较高的普鲁兰糖降解活性(图1) ,故将ZXYG5确定为目标菌株.2.2 菌株ZXYG5的产普鲁兰酶活性测定对ZXYG5菌株采用DNS法进行普鲁兰酶活性测定 ,结果显示 ,在ZXYG5菌株的发酵产酶历程中 ,发酵42 h时 ,普鲁兰酶活性达到最高4.2 UűmL－1,说明该菌株具有较高的产普鲁兰酶活性(图2).与同类文献资料相比 ,无论从产普鲁兰酶活性和发酵周期来看 ,ZXYG5菌株都具有一定的优势 ,是下游研究良好的备选菌株 ,具有一定的开发应用潜力.2.3 菌株ZXYG5的鉴定2.3.1 菌株ZXYG5的形态特征 ZXYG5菌株为杆型细菌 ,大小(0.5－1.6)μm×(0.8－2.5)μm ,无荚膜 ,能运动.在LB平板上35℃培养48 h ,菌落近圆形 ,边缘不整齐 ,直径2－3 mm ,表面光滑 ,扁平 ,有黄色素产生(图3A ,B).扫描电镜下放大到60 000倍时 ,可见菌体的两端钝圆 ,具周生鞭毛(图3C).2.3.2 ZXYG5菌株的生理生化鉴定 ZXYG5菌株的生理生化测定结果表明 ,结果与文献[18]和[19]中泛菌属(Pantoea)的描述基本一致(表1).2.3.3 菌株ZXYG5的16S rDNA分析通过测序 ,获得ZXYG5菌株的16S rDNA基因序列长度为1501 bp ,序列号为KR362557.将基因序列提交NCBI(美国国家科技情报研究中心)的BLAST进行在线相似性比对 ,并选取相似度高的序列构建ZXYG5的系统发育进化树(图4).结果显示 ,ZXYG5与肠杆菌科(Enter-obacteriaceae)泛菌属(Pantoea)的Pantoea sp.GYPB18(JF346891)等聚为同一分支 ,且它们相似度达到83% ,说明它们遗传进化关系最近 ,再综合形态特征、生理生化特性 ,初步将菌株ZXYG5鉴定为泛菌Pan-toea sp. ,命名为Pantoeasp.ZXYG5.文献报道的产普鲁兰酶微生物资源主要类群有:海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoactinomyces ethanolicus)、Bacillus flavocaldarius、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.Stearothermophilus)、多形拟杆菌(B.Thetaiotaomicron)、克雷伯肺炎菌(Kiebsiella.Pneumoniae)、热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor sac-charolyticus)、嗜热厌氧闪光杆菌(Fervidobacterium pennavorans)等[1 ,3 ,4],但真正用于工业化生产的菌株却极少.原因主要有两个 ,一个是相当一部分产酶菌株是从土壤中分离获得 ,而许多土著野生菌株并不适合发酵产酶；二是很多菌株产酶活性大幅度提高的潜力有限 ,即使是通过基因操作构建了表达工程菌 ,也往往达不到理想的发酵产酶效果.随着交叉学科的不断深入发展 ,人们已逐渐将筛选分离产普鲁兰酶菌株的范围拓展到新的领域 ,如动物内生菌、植物内生菌、极端环境、深海环境等 ,并已初见成效[2－4 ,7－8].郭宏文等[20]研究表明 ,产普鲁兰酶菌株PUG12的初始产酶活性为0.64 UűmL－1,发酵条件优化后经64 h发酵 ,酶活性达到2.45 UűmL－1；马晓军等[21]筛选出一株产普鲁兰酶菌株Bacillus sp.SX-12 ,初始酶活性为2.42 UűmL－1,经紫外线诱变后 ,经48 h发酵培养酶活性提高到6.87 UűmL－1.本研究从烟草甲肠道分离出的菌株ZXYG5在未优化发酵条件和诱变育种的情况下 ,菌株最高产普鲁兰酶酶活性就达到了4.2 UűmL－1,与部分同类文献相比 ,产酶活性和发酵周期均具有一定优势.另外 ,来源于动物内生性的产功能酶菌株 ,在酶活性的生物安全方面更容易得到保障[10],开发应用潜力更大 ,普鲁兰酶在食品、饲料领域使用广泛 ,所以ZXYG5具有较大的开发前景；从ZXYG5菌株多项分类鉴定结果的归属来看 ,还未见有泛菌属产普鲁兰酶菌株的报道 ,因此 ,ZXYG5菌株的分离、鉴定及产酶活性的确定 ,丰富了产普鲁兰酶菌株诱变育种和全基因组育种的遗传资源.【相关文献】[1]袁振宏.能源微生物学[M].北京:化学工业出版社 ,2012:69－76.[2]孙劭靖 ,路福平 ,姜楠 ,等.一株耐热普鲁兰酶菌株Anoxybacillus sp.LM14-2分离鉴定及酶学性质研究[J].生物技术通报 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一株产普鲁兰酶细菌的分离鉴定及其发酵条件优化
一株产普鲁兰酶细菌的分离鉴定及其发酵条件优化王明道;郭双;张雨杭;孙利鹏;时延光;邱立友【期刊名称】《信阳师范学院学报：自然科学版》【年(卷),期】2014(27)4【摘要】从淀粉加工厂附近土壤中筛选得到一株普鲁兰酶高产菌株,编号为Z-13,其初始酶活达到5.7 U/mL.通过对此菌株的16S rDNA比对,以及生理生化鉴定,鉴定此菌株为克雷伯氏菌(Klebsiella variicola),通过发酵条件优化,确定最佳发酵产酶条件为:玉米淀粉1.5%,蛋白胨2.0%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.01%.装液量为70 L/250 L,培养基最初pH为6.0,发酵温度30℃,摇床转速200 r/min,发酵时间48 h,优化后菌株产普鲁兰酶的酶活高达67.8 U/mL,是优化前菌株产普鲁兰酶活性的11.89倍.【总页数】5页(P569-573)【关键词】普鲁兰酶;筛选;鉴定;产酶条件优化【作者】王明道;郭双;张雨杭;孙利鹏;时延光;邱立友【作者单位】河南农业大学农业部农业微生物酶工程重点实验室;河南仰韶生化工程有限公司【正文语种】中文【中图分类】TQ925.1【相关文献】1.产普鲁兰酶海单胞菌的分离鉴定及发酵条件优化 [J], 严芬;杨光;连燕萍;王培松;吴晨烁2.油田产出水中一株产多糖细菌的分离、鉴定及发酵条件优化 [J], 李向前;佘跃惠;张忠智3.一株产普鲁兰酶芽孢杆菌的筛选鉴定及发酵条件优化 [J], 宋勇强;胡先望;张鸣明;严晓娟;沙芮;梁宁4.一株产脂肪酶细菌的分离鉴定及产酶条件优化 [J], 刘晓丽;杨孝朴;赵军5.一株普鲁兰酶产生菌的分离鉴定及发酵条件的优化 [J], 乔宇;丁宏标;闫俊艳;王海燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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普鲁兰酶产生菌的筛选及部分酶学性质研究作者：周念波魏丙卓孙杰王晶
来源：《现代农业科技》2008年第13期
摘要利用选择性培养基从淀粉加工厂附近土壤中分离出11株具有产普鲁兰酶能力的菌株，对其中产酶能力最高的PB1菌株所产酶进行了性质测定。
结果显示：PB1所产普鲁兰酶活力为3.25U/mL；该酶最适反应温度为60℃，在低于70℃范围内热稳定性较好；最适反应pH 值为5.0~6.0，在pH值为4.0~7.5范围内稳定；Fe3+对该酶活性有明显的促进作用，而Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+对该酶活性有强烈的抑制作用。
关键词普鲁兰酶；筛选；酶学性质
中图分类号 Q556+.2文献标识码A文章编号1007-5739（2008）13-0007-02
普鲁兰酶（Pullulanase，EC3.2.1.41）是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α-1，6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶[1]。
在淀粉加工行业中，由于大部分淀粉质原料支链淀粉含量约为70%~95%，支链淀粉不被分解则影响到淀粉的利用率和产品的质量。
普鲁兰酶能水解α-1，6-糖苷键，可以显著提高淀粉原料的利用率，从而提高生产效率。
目前已经较成功地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆、低聚寡糖浆和啤酒生产[2]。
普鲁兰酶由于来源不同，酶性质差异较大。
在淀粉的加工行业上，普鲁兰酶多与α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等其他淀粉酶类配合使用，必须满足其他淀粉酶类的反应条件，因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热[3，4]。
普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌
（Aerobacter.aerogenes）发酵获得[5]。
他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入地研究，从不同地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。
尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件（酸性，高温），大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。
目前，我国只局限于实验室研究且酶活较低，工业上所用的普鲁兰酶均是从丹麦NOVO进口[6]。
本研究通过初步的筛选工作，得到了1株产普鲁兰酶较好的菌株。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1土样。
从淀粉加工厂附近取土样。
1.1.2试剂和仪器。
普鲁兰糖（购自日本林原研究所），3，5-二硝基水杨酸（国药集团化学试剂有限公司），糯米淀粉（购于市场）。
DHP-9052型电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），HQ45Z恒温摇床（武汉中科科仪技术发展有限公司），GL-12B型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），722S分光光度计（上海棱光技术有限公司），SW-CJ-ZD超净工作台（苏州净化设备有限公司），YX280A高压蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）。
1.1.3培养基。
平板分离培养基：普鲁兰糖0.3%，蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.01%，琼脂
2.0%，pH值为5.0。
斜面培养基：糯米淀粉1.0%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.01%，琼脂2.0%，pH值为5.0。
液体培养基：糯米淀粉2.0%，蛋白胨1.0%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸铵0.5%，硫酸镁0.05%，硫酸铁0.001%，pH值为5.0。
1.2方法
1.2.1菌种筛选方法。
（1）普鲁兰酶产生菌的初筛。
取10g土样加入到装有90 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，振荡30min，使样品充分打散后，吸取1.0mL于富集培养基中，在35℃下振荡培养48h。
取培养液稀释涂布于以普鲁兰糖为唯一碳源的平板分离培养基上，35℃温箱中培养48h。
将平板倒置，注入10mL无水乙醇，室温放置24h，观察菌落并挑出周围出现透明圈的菌落，于斜面培养基上进行培养。
（2）菌种纯化。
用接种环从斜面培养基上挑取少量菌株接入平板固体培养基，采用平板划线分离法对菌株进行纯化，将产生透明圈的单菌落接入斜面培养基，供菌种复筛用。
（3）摇瓶培养法复筛。
将斜面保存的菌种接入种子培养基中，35℃振荡培养24h后，制得菌悬液，将菌悬液以4%接种量接入菌种筛选摇瓶培养基，35℃振荡培养48h后，测定发酵液中普鲁兰酶活力。
1.2.2普鲁兰酶液的制取。
摇瓶振荡培养后，收集发酵液，5 000r/min低温离心后取上清液，制得粗酶液。
1.2.3普鲁兰酶活力测定。
采用3，5-二硝基水杨酸法，在1.0mL的5g/L普鲁兰糖溶液（用醋酸缓冲液配制）中加入1.0mLpH值为6.0的醋酸缓冲液，然后加入1.0mL适当稀释的酶
液，于60℃保温反应30min，沸水浴10min灭酶，加入3，5-二硝基水杨酸1.5mL，沸水浴
10min，取出冷却，于520nm处测光吸收值。
酶活单位定义为在上述条件下，每分钟催化分解普鲁兰糖生成相当于1μmoL葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活单位。
1.2.4普鲁兰酶的部分酶学性质。
（1）最适温度及热稳定性。
将普鲁兰酶液分别于不同温度下测其活力，以活力最高者为100%对照，测试其最适反应温度。
在不同温度下，将普鲁兰酶液分别保温1h后，测定残余酶活力，以活力最高者为100%对照，试验温度对普鲁兰酶稳定性的影响。
（2）最适pH值及pH值稳定性。
将普鲁兰酶液分别于不同pH值下测其活力，以活力最高者为100%对照，测试其最适反应pH值。
将普鲁兰酶液在不同pH值缓冲液中于室温保持24h后，测定残余酶活力，以活力最高者为100%对照，试验pH值对普鲁兰酶稳定性的影响。
（3）金属离子对普鲁兰酶活性的影响。
将不同的无机盐溶液与等量普鲁兰酶液混合，并使混合液中的无机盐最终浓度达到0.5mmoL/L，按1.2.3的方法测定酶活力，设不加金属离子组为对照组，测定金属离子对普鲁兰酶活力的影响。
2结果与分析
2.1菌种的分离筛选
从采集到的土样中，通过平板分离筛选，共筛选到有较明显透明圈菌株35株，摇瓶培养复筛后，经酶活测定比较，其中11株产酶能力较高，其透明圈与菌落直径比值、酶活力见表1。
其中以编号PB1的菌株产酶活性最高，因此选PB1为进一步试验用菌。
2.2普鲁兰酶的部分酶学性质
2.2.1最适温度及热稳定性。
温度对普鲁兰酶活性的影响见图1。
由图1可以看出，不同温度对普鲁兰酶分解普鲁兰糖具有明显的影响，该酶在55~65℃范围内活性较强，其中60℃为其降解普鲁兰糖的最适温度。
普鲁兰酶在低于70℃时稳定性较好，残余活力在90%以上，温度高于70℃后，酶活力开始迅速下降。
2.2.2最适pH值及pH值稳定性。
pH值对普鲁兰酶活性的影响见图2。
由图2可知，该酶的最适pH值为5.0~6.0。
在pH值4.0~7.5范围内，普鲁兰酶稳定性较高，活力损失较少，酶的残余活力在90%以上。
2.2.3金属离子对普鲁兰酶活性的影响。
不同金属离子对普鲁兰酶活力的影响见表2。
由表2可以看出，Fe3+对普鲁兰酶活性有激活作用，而Cu2+、Ag+、Hg2+、Pb2+对该酶活性有强烈的抑制作用，Zn2+、Mg2+、Ni2+也有一定的抑制作用，其他金属离子对该酶活性影响不明显。
3讨论
本试验中普鲁兰酶产生菌是从淀粉加工厂附近土壤中筛选得到，其初始产酶能力较高，但还需对其产酶条件进行优化，以及采用诱变、基因工程等手段进行选育。
耐热和耐酸性是评价一种普鲁兰酶优劣的重要指标。
各国科研人员从不同地区的微生物中获得了该酶，但很多因其性质不满足当今淀粉加工业生产条件的要求，而得不到广泛地应用。
本文研究了该酶的部分性质，发现该酶的最适反应温度为60℃，在低于70℃范围内热稳定性较好，表明其是一种耐热的酶。
最适反应pH值为5.0~6.0，在pH值4.0~7.5范围内较稳定。
这些特点接近目前淀粉加工的生产条件，对于工业应用是很有利的。
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注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
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