蛋白酶产生菌的分离汇总讲解
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蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定
许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理,杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌,将其接种到酪蛋白平板进行培养,根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括:蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。
通过本实验项目,使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法,菌种的纯化技术、高产菌的选育技术;了解蛋白酶产生菌的生长情况,学会绘制其生长曲线;学会培养基优化的方法;了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理;掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。
1 实验材料
1.1 实验样品
校园内土壤样品
1.2实验仪器与材料
牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水(带玻璃珠)、芽孢染色液番红;显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、,玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸( pH 5.5—9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计(应符合GB9721的规定)等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法
1.称量
按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。
2.溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积。
3.调pH
4.分装
按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
5.包扎
塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎,用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
6.灭菌
将上述培养基以1.02kg/cm2(15磅/英寸2),121.3℃, 15-20min高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。
7.制作平板
将灭菌后的培养基冷凝至55~60℃,放在超净台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,以铺满皿底为度。
8.无菌检查
待培养基凝固后,5个培养皿一叠,倒置平放在恒温培养箱中培养24—48
小时,以检查灭菌是否彻底。
2.2蛋白酶产生菌的分离
1)采集土壤样品,用无菌水制备1:10土壤悬液;
2)取1:10土壤悬液5ml,注入已灭过菌的试管中,将此试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min,以杀死非芽孢细菌;
3)取加热处理过的土壤悬液100-200 μL,涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养基平板,将平板倒置,于30-32 ℃培养24-48 h;
4)对长出的单菌落进行编号,选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落,挑取少许菌苔涂片,做芽孢染色,判断是否为芽孢杆菌。
2.3 蛋白酶产生菌的筛选
1)从判定为芽孢杆菌的菌落处,分别挑取少许菌苔,先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于含酪蛋白的平板,30-32 ℃培养24-48 h,测定平板上菌苔直径和水解圈直径。
2)水解圈直径与菌落直径比值大的那个菌株对应的斜面培养物,可作为进
行诱变选育或酶发酵、酶活力测定菌株。
2.4蛋白酶产生菌的选育
2.4.1 紫外线对出发菌株的诱变效应
1)菌悬液的制备:①取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支,用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下,倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中,振荡30分钟,以打碎菌块。②将上述菌液离心(3000 r/min,离心15分钟),弃去上清液,将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次,最后制成菌悬液。③用显微镜直接计数法计数,调整细胞浓度为每毫升108个。
2)平板制作:将淀粉琼脂培养基溶化后,冷至55℃左右时倒平板27套,凝固后待用。
3)紫外线处理:①将紫外线灯开关打开,预热约20分钟。②取直径6cm无菌平皿2套,分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml,并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上,打开皿盖,在距离为30cm,功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖,关闭紫外灯。
4)稀释:在红灯下,将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6(具体可按估计的存活率进行稀释)。
5)涂平板:取10-4、10-5、10-6
三个稀释度涂平板,每个稀释度涂平板3只,每只平板加稀释菌液0.1ml,用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作,取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。
6)培养:将上述涂匀的平板,用黑布(或黑纸)包好,置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。
7)计数:将培养48小时后的平板取出进行细菌计数,根据对照平板上菌落数,计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。8)观察诱变效应:将细胞计数后的平板,分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴,在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值(HC值)。与对照平板进行比较,根据结果,说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 2.5蛋白酶产生菌的发酵与酶活力测定 2.5.1蛋白酶产生菌的发酵(1)将保藏培养基中的产蛋白酶芽孢杆菌接种两环到种子培养液中,30-32 ℃摇床发酵培养16h,4℃冰箱保存。
(2)取10ml含产蛋白酶芽孢杆菌的种子培养液接入含100ml酪素液体发酵培养基的250ml 三角瓶中,30-32 ℃摇床发酵培养,作为样一。
(3)样一培养12h后,再取10ml含产蛋白酶芽孢杆菌的种子培养液接入含100ml酪素液体发酵培养基的250ml三角瓶中,30-32 ℃摇床发酵培养,作为样二。
(4)在发酵培养的48h内,每3h取一次样,每次取5ml,放入10ml的离心管中,于4℃冰箱冷藏。
(5)48h后将所有取样3000rpm离心10min,离心所得上清液680nm进行酶活力测定,每管沉淀加5ml蒸馏水600nm测生长曲线。
2.5.2试剂和溶液 2.5.2.1 福林试剂
2.5.2.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g ,用水溶解并定容至1000mL.