激光扫描共聚焦显微镜(研究生)ppt课件
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A C. elegans EmbryoG at pro-nuclei meetingG
stage (before dividing into 2-cell embryo)
Differential Interference Contrast (DIC; Nomarski)
Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
1978年，Brandengoff在高数值孔径透 镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显 微镜；
1982年，BIO-RAD公司第一个推出商品 化激光扫描共聚焦显微镜；
1985年，Wijnaendts Van Resandt发 表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生 物学中应用的文章；
1987年，发展成现在通常意义上的第一 代激光扫描共聚焦显微镜。
5
FluoView™ FV1000共聚焦显微镜
FV1000系统完美地 整合了两套相互独立的 扫描模块在一套系统内， 在一束激光进行实验刺 激的同时，另一束激光 实时地对样品进行扫描， 从而记录完整的动态变 化过程。
美国Meridian公司的ACAS uLTIMA312为同类仪 器中档次最高、功能最全的精密仪器。 它能达到每秒 120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真 彩色的激光共聚焦原色图象。
8
Mitotic cells, multiple fluorescence 9 (NCI Maryland)
二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy ，简称LSCM）是近代生 物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显 微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光 或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理， 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以 及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位 等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细 胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免 疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、 定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这 些领域新一代强有力的研究工具。
16
共聚焦原理示意图
17
18
（一）激光光源
（1）、激光谱线 （2）、激光器开闭和电压调节 （3）、激光强度回馈稳定电路设计 （4）、辅助设备
19
波长（nm）功率(mW)
激光器类型
325
10～30 氦镉(He-Cd)激光
351
300
带紫外的水冷式氩离子激光
364
>20
风冷氩离子激光（Ar-ion）
生物物理教研室
陈丽娜
1
激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM）
2
授课内容
一、LSCM的发展与现状 二、LSCM的成像原理及组成 三、LSCM的使用步骤 四、LSCM的基本功能 五、LSCM在生物医学领域中的应
用
3
一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状
1957年，Marvin Minsky提出共聚焦原 理；
Multiphoton Fluorescence Excitation Microscopy (MPFE)
13
2、LSCM的工作原理
激光束
扫描器
载物台的升降
接收器
“细胞CT”
计算机
“光学切片”
14
LSCM
组 成 光 路 的 示 意 图
15
Beam path in the confocal laser scanning microscope
4
仪器名称
生产商
型号
BD高通量活细胞共聚焦分析 系统400系列
BD 高通量活细胞共聚焦分析 系统800系列
BD全光谱活细胞共聚焦高速 扫描系统
尼康共焦显微镜
共焦激光扫描显微镜
美国BD公司
美国BD公司
美国BD公司 尼康（Nikon) 徕卡仪器有限公司 Leica
OLYMPUS激光共聚焦显微镜 OLYMPUS
442
11
氦镉激光
457～514 25
小型氩离子激光
543
1.25
绿氦－氖(He-Ne)激光
630
33
外谐振器半导体激光
630
3
碰撞脉冲染料激光
632
3.5
氦－氖激光
700～1100 2 000
蓝宝石激光
1 152
1
氦－氖激光
20
（二）扫描器
扫描器
针孔光栏（pinhole） 分光镜 发射荧光分色镜 检测器
21
1）针孔光栏
位置 作用
2）分光镜
位置 作用
22
3）发射荧光分色镜
位置
4）检测器 作用
位置 作用
23
描装置
10
1、LSCM的基本结构
荧光显微镜系统及样品台
激光光源
扫描器
图象存储及处理系统
控制
计算机控制系统
LSCM各部分相互关系示意图 11
共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较
激光扫描共聚焦显微镜 普通光学显微镜
激光光源 共轭聚焦原理和装置
场光源 干扰
计算机数字图象处理分析系统
照相
12
Light Microscopy
BIO-RAD公司第七代Radiance 2100型激光扫描共 聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦 扫描显微镜
6
7
激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统
硬件系统 软件系统
1）激光光源 2）计算机系统 3）共聚焦系统 4）光学探测系统 5）图像分辨率 6）扫描方式
1）、Image Analyze 2）、Ratio Analysis和 Kinetics 3）、Cell –Cell Communication and FRAP 4）、Cell List 5）、Cell Sorting 6）、Confocal Imaging
时间分辨激光共聚焦显微成 像系统
德国耶莱公司
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国 ZEISS
ห้องสมุดไป่ตู้
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国ZEISS
FV1000 尼康（nikon）C1-plus
UltraView™
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
Pathway415、Pathway435
800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
OLYMPUS激光共聚焦显微镜 OLYMPUS
NIKON共聚焦显微镜
尼康（nikon)
UltraView™高速扫描型激 光共聚集系统
PerkinElmer
高通量共聚焦显徽细胞图像 分析测定系统
GE Healthcare
stage (before dividing into 2-cell embryo)
Differential Interference Contrast (DIC; Nomarski)
Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM)
1978年，Brandengoff在高数值孔径透 镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显 微镜；
1982年，BIO-RAD公司第一个推出商品 化激光扫描共聚焦显微镜；
1985年，Wijnaendts Van Resandt发 表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生 物学中应用的文章；
1987年，发展成现在通常意义上的第一 代激光扫描共聚焦显微镜。
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FluoView™ FV1000共聚焦显微镜
FV1000系统完美地 整合了两套相互独立的 扫描模块在一套系统内， 在一束激光进行实验刺 激的同时，另一束激光 实时地对样品进行扫描， 从而记录完整的动态变 化过程。
美国Meridian公司的ACAS uLTIMA312为同类仪 器中档次最高、功能最全的精密仪器。 它能达到每秒 120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察，可提供实时，真 彩色的激光共聚焦原色图象。
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Mitotic cells, multiple fluorescence 9 (NCI Maryland)
二、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy ，简称LSCM）是近代生 物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显 微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光 或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理， 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以 及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位 等生理信号及细胞形态的变化等。已广泛应用于细 胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免 疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、 定量、定时和定位研究具有很大的优越性，成为这 些领域新一代强有力的研究工具。
16
共聚焦原理示意图
17
18
（一）激光光源
（1）、激光谱线 （2）、激光器开闭和电压调节 （3）、激光强度回馈稳定电路设计 （4）、辅助设备
19
波长（nm）功率(mW)
激光器类型
325
10～30 氦镉(He-Cd)激光
351
300
带紫外的水冷式氩离子激光
364
>20
风冷氩离子激光（Ar-ion）
生物物理教研室
陈丽娜
1
激光扫描共聚焦显微镜 （LSCM）
2
授课内容
一、LSCM的发展与现状 二、LSCM的成像原理及组成 三、LSCM的使用步骤 四、LSCM的基本功能 五、LSCM在生物医学领域中的应
用
3
一、激光扫描共聚焦显微镜发展与现状
1957年，Marvin Minsky提出共聚焦原 理；
Multiphoton Fluorescence Excitation Microscopy (MPFE)
13
2、LSCM的工作原理
激光束
扫描器
载物台的升降
接收器
“细胞CT”
计算机
“光学切片”
14
LSCM
组 成 光 路 的 示 意 图
15
Beam path in the confocal laser scanning microscope
4
仪器名称
生产商
型号
BD高通量活细胞共聚焦分析 系统400系列
BD 高通量活细胞共聚焦分析 系统800系列
BD全光谱活细胞共聚焦高速 扫描系统
尼康共焦显微镜
共焦激光扫描显微镜
美国BD公司
美国BD公司
美国BD公司 尼康（Nikon) 徕卡仪器有限公司 Leica
OLYMPUS激光共聚焦显微镜 OLYMPUS
442
11
氦镉激光
457～514 25
小型氩离子激光
543
1.25
绿氦－氖(He-Ne)激光
630
33
外谐振器半导体激光
630
3
碰撞脉冲染料激光
632
3.5
氦－氖激光
700～1100 2 000
蓝宝石激光
1 152
1
氦－氖激光
20
（二）扫描器
扫描器
针孔光栏（pinhole） 分光镜 发射荧光分色镜 检测器
21
1）针孔光栏
位置 作用
2）分光镜
位置 作用
22
3）发射荧光分色镜
位置
4）检测器 作用
位置 作用
23
描装置
10
1、LSCM的基本结构
荧光显微镜系统及样品台
激光光源
扫描器
图象存储及处理系统
控制
计算机控制系统
LSCM各部分相互关系示意图 11
共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较
激光扫描共聚焦显微镜 普通光学显微镜
激光光源 共轭聚焦原理和装置
场光源 干扰
计算机数字图象处理分析系统
照相
12
Light Microscopy
BIO-RAD公司第七代Radiance 2100型激光扫描共 聚焦显微镜是全世界唯一无需人工调整的激光扫描共聚焦 扫描显微镜
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7
激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统
硬件系统 软件系统
1）激光光源 2）计算机系统 3）共聚焦系统 4）光学探测系统 5）图像分辨率 6）扫描方式
1）、Image Analyze 2）、Ratio Analysis和 Kinetics 3）、Cell –Cell Communication and FRAP 4）、Cell List 5）、Cell Sorting 6）、Confocal Imaging
时间分辨激光共聚焦显微成 像系统
德国耶莱公司
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国 ZEISS
ห้องสมุดไป่ตู้
德国ZEISS激光共聚焦显微 镜
德国ZEISS
FV1000 尼康（nikon）C1-plus
UltraView™
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
Pathway415、Pathway435
800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
OLYMPUS激光共聚焦显微镜 OLYMPUS
NIKON共聚焦显微镜
尼康（nikon)
UltraView™高速扫描型激 光共聚集系统
PerkinElmer
高通量共聚焦显徽细胞图像 分析测定系统
GE Healthcare