细胞生物学实验--设计性实验方案--二组

设计性实验方案课程名称细胞生物学题目名称 DNA的原位显示专业生物科学学号学生姓名指导教师时间邯郸学院生命科学与工程学院说明一、实验设计的目的实验设计是培养学生综合运用所学知识与技能，初步训练学生获得分析和解决实际问题的能力的实践性教学环节之一。

通过实验设计培养学生运用所学知识设计课题的能力，为毕业论文的开展，以及今后从事生产、教学、科研等相关工作打下坚实基础。

二、实验设计的要求1、以小组为单位，提出与专业、课程有关的课程设计题目。

命题要求既有代表性，又有实际意义。

2、设计应包括以下几个部分构成：（1）研究的目的与意义。

应说明此项研究在生产实践上或对某些技术进行改革带来的经济、生态与社会效益。

有的课题过去曾进行过，但缺乏研究，现在可以在理论上做些探讨，说明其对科学发展的意义。

（2）国内外同类研究的概况综述。

在广泛查阅有关文献后，对该类课题研究已取得的成就与尚存在的问题进行简要综述并提出自己对一些问题的看法。

（3）课题研究方案：包括研究内容、研究方法和技术路线。

研究内容要重点突出；研究方法要具有科学性、先进性；技术路线有清晰。

（4）研究的预期结果和创新性。

3、格式要求（1）表格内容，字号用小4号，中文字体用宋体，英文字体、数字用Times New Roman；（2）正文字数1500字以上。

4、内容要求（1）立题依据充分（实验目的明确、意义定位准确，对拟解决的问题有合理预测，对国内外研究现状阐述全面）；（2）研究方案（包括实验的技术路线、实验的进程安排、具体操作过程、设立的实验指标和指标的检测手段）可操作性强；（3）实验结果的记录及分析方法可行性强；（4）对实验中可能发生的问题有正确预测并提出相应的解决方法；（5）经费预算合理；（6）附有5篇以上主要参考文献。

三、实验设计题目（自拟）一、选题依据（拟开展研究项目的目的、意义）实验目的1、掌握孚尔根反应和Brachet反应的原理。

2、掌握孚尔根反应和Brachet反应显示细胞内DNA的方法。

3、掌握实验方案设计、数据整理及结果分析、论文撰写等基本技能。

实验意义1、了解和掌握两类核酸显示的原理及操作程序2、了解并掌握细胞中DNA和RNA的分布二、研究方案（主要研究内容、研究方法和技术路线）一、研究内容DNA的Unna显示法所制作的装片在细胞质和细胞核内的染色结果，以及三氯乙酸的具体作用。

二、研究进展不同染色剂染色对观察洋葱根尖细胞有丝分裂相的影响根据实验研究结果分析得知，用醋酸洋红染色存在染色不均匀的问题造成图像模糊，有的细胞染色很重，有的是细胞质与细胞核内染色分辨不清楚，从而影响观察。

而用改良品红染色，染色体染色清晰，细胞质不着色，背景明亮，易于分辨，但是改良品红染色时间要远远长于醋酸洋红的时间，否则很难染色。

在用改良品红染色与醋酸洋红的对比的实验中，用改良品红染色细胞质与细胞核明显可辨别，其染色体部分染色较深，细胞质基本不着色，但要注意的是用改良品红染色时一定要把握好染色的时间问题，尽量延长染色的时间，否则染色浅就不容易观察到染色体。

不同时间取材对观察洋葱根尖细胞有丝分裂相的影响根据实验研究结果分析得知，在上午 10∶ 00 时取下的洋葱根尖，细胞有丝分裂比较旺盛，其中前期和中期的分裂相最多。

而在下午15∶ 00 时取的洋葱根尖细胞有丝分裂不如上午分裂旺盛，下午也是前、中、后期相较多，上午和下午的末期相差别不大。

实验结果表明:植物细胞的有丝分裂活动受生物钟的制约，在一天的24h 里，细胞有丝分裂是有节律性的，即在白天 10∶00 ～11∶ 00 时最旺盛，可能在夜间22∶ 00 ～ 23∶ 00 时又是最旺盛的时间。

所以，洋葱根尖有丝分裂在不同的时间观察到的分裂相是不同的。

虽然是在不同的时间取下的根尖，但是有可能观察到相同的分裂相，只是按平均数统计来算在不同的时间分裂相数目，这样得出的在不同时间分裂相是不同的。

结合环保的理念更进一步证明了采用冷藏和常温交替培养预处理方法进行处理洋葱根尖，是得到分裂期细胞的一个好方法，值得在教学中推广使用。

以上探究，仅限于洋葱根尖的分裂期的控制，还有很多问题可以在中学生物教学中进一步启发学生进行自主探究实验。

比如是否可以采用类似 SM 营养液来培养根尖;是否可以长时间地让洋葱球茎处于光照15℃～20℃的环境中生长; 是否可以提高冷藏常温交替培养预处理组的分裂期的稳定性等等。

压片: 染后材料水洗几分钟后入蒸馏水待压片。

取表面皿加45%冰醋酸后将根尖放于皿内并夹碎进行软化和分色,大约1h 后可陆续压片;取清洁载片,上放少许软化材料、加盖片后用镊子尖轻轻地向有材料的地方敲打,使之细胞分离成一薄层、再用两镊尖执住盖片材料的两边,用铅笔杆或小木棒轻轻敲压, 见材料细腻可镜检,挑选分散好,分散相多的压片将盖片朝下斜入50%的酒精中脱盖片,分离后进行脱水透明,如材料分别粘在载片上可分别进行封藏。

洋葱根尖作为染色体组型分析的材料与蚕豆、玉米等相比较其根尖更容易获得, 而且洋葱鳞基部的发根数量比较多, 呈梯次发根,可多次取材。

我们在实验中用一个洋葱经过反复利用完成了植物染色体观察、组型分析和分带等三个实验。

经饱和对二氯苯处理过的洋葱根尖停留在中期分裂相较多,而两次低渗处理可以使在固定和解离过程中因酸而凝缩的染色体膨大。

我们在处理的过程中更换低渗液可以使KCl的浓度相对保持的0.75M不发生变化,保证了低渗液的浓度。

在染色过程中用染色液压片可使临时装片在观察的过程中不会因为在强光中暴露时间过长, 着色变淡。

解离可使根尖变得酥软易于压片,在解离的过程中一定要保持在60,温度过高会破坏染色体的结构,温度太低又达不到解离的效果。

关于解离时间以8 m in左右为宜,根据我们的实验解离的根中能够看到气泡说明解离完全, 这时应该停止解离进行下一步实验。

［1］王辉，石延茂，李双铃，等． 2008．不同预处理对花生根尖细胞有丝分裂制片的影响．花生学报， 37( 2) :28 ～31［2］杨洁，柳红． 1999．洋葱根尖细胞有丝分裂高峰期的研究．辽宁师专学报， 2( 2) :26 ～29［3］徐伟平． 2001．根尖细胞有丝分裂装片制作新见解．生物学教学，26( 6) :15 ～17［4］高汝勇．低温预处理对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响．农业科技与设备，2009( 1)［5］赵东利等．秋水仙素对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响．北京农学院学报，2009( 1)三、实验原理利用核酸分子上的磷酸根和碱性染料形成盐键而在原位沉淀显色的原理，根据DNA和RNA对碱性染料的亲和力有差别，用Unna试剂（甲基绿-派洛宁染色液）进行选择性染色是显示核酸的方法之一。

在Unna试剂中甲基绿与空间构型完整的DNA亲和力高，并且甲基绿分子中的两个含N基团带正电荷正好与DNA分子的负电基团相结合，这样DNA被Unna试剂中的甲基绿染成绿色或蓝绿色。

而RNA则被Unna试剂中的派洛宁（Pyronin G）染成红色。

三、实验用品（一）材料洋葱鳞茎或根尖、植物幼苗。

（二）仪器、用具显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸，混匀器，高速冷冻离心机、移液器、液氮罐、1.5mleppendorf 管、2mleppendorf管等。

（三）试剂1、1mol/L乙酸缓冲液（pH4.8）：A液：冰乙酸6ml ，加水至100ml。

B液：乙酸钠13.5g，加水至100ml。

使用时，将A液和B液按2:3比例混合。

置于4℃冰箱中备用。

2、Unna试剂：甲基绿-派洛宁染色液。

甲液：5%派洛宁水溶液6ml，2%甲基绿水溶液6ml，去离子水16ml。

乙液：1mol/L乙酸缓冲液（pH4.8）16ml。

甲、乙两液置于4℃冰箱中备用，使用前再将甲、乙两液混匀待用。

3、5%三氯乙酸。

4、卡诺固定液：无水酒精3份:冰醋酸1份或无水乙醇6份，氯仿3份，冰醋酸1份。

乙醇对样品具有收缩作用，冰醋酸则对样品有膨胀作用。

氯仿：三氯甲烷。

四、方法步骤DNA和RNA的Unna显示法1. 取材与固定：待洋葱根尖长1cm 时，于上午8时剪下根尖，经过预处理后投入卡诺固定液中固定2-24h。

固定后，保存在70%的酒精中，放入冰箱中冷藏供用。

2.水解试管1：取洋葱根尖数条，投入试管，用清水洗3次。

试管2（对照）取洋葱根尖数条，投入试管，先用清水洗3次，再用5%三氯乙酸（TCA）浸没根尖，放入恒温水浴锅中在90±0.5℃下水解15分钟，再用清水洗5min。

以下各步骤两试管相同。

（水解是本实验成败的关键之一。

重要的是温度，应保持在90±0.5℃之间。

如果温度过高或时间过长，造成水解过度，醣与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，反之，不能出现潜在的醛基，都不能呈现颜色反应。

）3. 染色两试管中均滴加Unaa染液，浸没根尖，立即置于暗处处理0.5h，然后用水漂洗3次，丙酮分色3-20秒，再用水漂洗2次，每次2min。

4.压片镜检。

分别取上述两试管中的根尖，置于载玻片上，滴加1滴45%醋酸，然后压片镜检。

三、预期的结果和创新性DNA的Unna显示法染色的结果：DNA被甲基绿染成绿色，RNA被哌洛宁染成红色DNA的Schiff显示法染色的结果：DNA被染成紫红色，RNA由于孚耳根反应被分解。

创新性：DNA的Unna显示法和DNA的Schiff显示法均采用对照的方法来研究三氯乙酸的作用，且DNA的Unna显示法和DNA的Schiff显示法也可以互为对照来研究染色后细胞质和细胞核内的染色结果有何不同，也可比较两种染色方法的优缺点。

四、导师的评语及评分签字：年月日。