在患CyHV-2病的异育银鲫肠道黏膜中胆固醇、胆汁酸代谢通路基因的差异表达
低温处理对异育银鲫腹部脂肪组织能量代谢相关基因表达的影响
生物资源2020,42(6):698〜703Biotic ResourcesDO I:10. 14188/j. a jsh. 2020. 06. 012低温处理对异育银鲫腹部脂肪组织能量代谢相关基因表达的影响李威h2,贺江燕2,翟刚2”3,胡玉才\殷战(1.大连海洋大学,辽宁大连116000; 2.中国科学院水生生物研究所,湖北武汉430070;3.中国科学院大学,北京100000)摘要:本文以异育银鲫为研究对象,将其在4水温条件下暂养12 h,研究其脂肪组织在低温环境下的基因表达变化H E:染色切片和透射电镜拍照结果显示,并未观察到由低温处理导致的组织学显著变化,如明显的线粒体结构增多现象.利用W e s t e r n b l o t分析手段,检测了常温和低温处理异育银鲫腹部脂肪组织中的线粒体蛋白分子C()X I V的表达水平,发现经过低 温处理,异育银鲫脂肪组织中的线粒体蛋白C O X I V略有增加.荧光定量P C R的结果显示,在低温环境下.异育银鲫腹部脂肪组织中的Cell Death hiducing DFF A Like Effector A (cideu),Perujcisome proliferator-uctivated receptor gumma coactivatur-1 alpha (pgcl) ,Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (pparg) , Peroxisome proliferator-activated receptor gamma c(mctivator l-beta(ppargcul ),iwcoupling prutein l(u cp l ),uncoupling protein 2(ucp2 )热 u?K〇upling protein 3(ucp录表达均出现了显著上调:这是首次证实鱼类腹部脂肪组织中的U C P分子均可以被低温诱导上调表达关键词:低温处理;脂肪;异育银鲫;基因表达中图分类号:Q754文献标识码:A文章编号:2096-3491(2020)06-0698-06Effect of cold treatm ent on the expression of genes related to energy metabolismin abdom inal adipose tissue of gible carpLI Wei 2, HEJiangyan-, Z H AIG ang2*, H U Y ucai1, YIN Zhan(1. D a l i a n O c e a n U n i v e r s i t y,D a l i a n116000,L i a o n i n g,C h i n a;2. Institute o f H y d r o b i o l o g y,C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s,W u h a n 430070,H u b e i,C h i n a;3. U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s,B e i j i n g 100000,C h i n a)A bstract:I n t h e p r e s e n t s t u d y,c o l d t r e a t m e n t(4 °C for 12 h o u r s)h a s b e e n c o n d u c t e d o n g i b e l c a r p(Carassius aura tus gibe/io),a n d n o s i g n i f i c a n t h i s t o l o g i c a l c h a n g e s in g i b e l c a r p v i s c e r a l a d i p o s e t i s s u e(V A T) h a s b e e n o b s e r v e d.T o i nv e s t i g a t e t h e e x p r e s s i o n v a r i a t i o n o f g e n e v S r e l a t e d t o e n e r g y m e t a b o l i s m,u t i l i z i n g W e s t e r n b l o t a n a l y s i s,s l i g h t l y e l e v a t e dl e v e l s o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n C O X I V in g i b e l c a r p V A T c o u l d b e o b s e r v e d a f t e r c o l d t r e a t m e n t.I n fact, t h e l e v e l s o ft h e t r a n s c r i p t i o n a l e x p r e s s i o n s o f cidea, p g c l a/b,p p a r^, sirt3, u cp l, ucp2a n d ucp3in t h e g i b e l c a r p V A T a f t e r c o l d t r e a t m e n t h a v e b e e n s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d in r e a l-t i m e r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e P C R test. T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e s t h a t t h e e l ev a t e d lipid m e t a b o l i s m a c t i v i t i e s in g i b e l c a r p V A T c a n b e i n d u c e d b y c o l d t r e a t m e n t.Key w ord s:c o l d t r e a t m e n t;f a t;g i b e l c a r p;g e n e e x p r e s s i o n收稿 U 期:2020-07-31 修回日期:2020-08-17 接受日期:2020-08-24作者简介:李威(1995-),男,硕士生;主要研究方向为鱼类分子内分泌学。
不同方法保存的患病异育银鲫中鲤疱疹病毒2型DNA提取和PCR扩增效果分析
第45卷第6期Vol.45 No.6淡水渔业Freshwater Fisheries2015年11月Nov.2015不同方法保存的患病异育银鲫中鲤疱疹病毒2型D N A提取和P C R扩增效果分析卢俊,陆宏达,岳蒙蒙,操艮萍(上海海洋大学水产与生命学院,上海201306)摘要:以患鲤疱瘆病毒2型(C y A n i h#AeOTAu 2, CyHV-2)疾病的异育银卿(C a ra s u auratos —纟!/)肾脏为实验材料,采用-20丈冷冻、100%乙醇、Dafan o P液、10%福尔马林、Zenker P液、Muller S液、 2.5%戊二醛、Hel-l y p液、Mossmanp液、Bouinp液和Cam oyp液不同方法进行保存,通过微量分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳探讨不同保存方法对病毒DNA提取效果、常规PC R扩增效果和巢式PC R扩增效果的影响。
结果表明:从病鱼肾脏中提取D NA时,除100%乙醇保存方法与-20丈冷冻保存组一样可以提取高质量的DNA外,其它保存方法对DNA提取有不同程度的影响,100%乙醇保存方法和保存的材料可以用作于鲤疱疹病毒2型D N A的提取;常规PCR扩增时,100%乙醇、ZenkemS液、 2.5%戊二醛、Helly P液、BO u in P液和CamO y P液保存方法与-20m冷冻保存组具有相同的效果,在362 b p处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这6种保存方法及其保存的材料可以用作鲤疱疹病毒2型的常规PCR扩增;巢式PCR扩增时,100%乙醇、DafanoP液、10%福尔马林、Zenkers液、Muller’s液、2. 5%戊二醛、H ellyp液、Mossman’s液、Bouin’s液和Carnoy’s液所有保存方法与-20 m冷冻保存组具有相同的效果,在339 b p处出现明亮一致的清晰单一目的条带,这些保存方法及其保存的材料均可以用作于鲤疱疹病毒2型的巢式P CR扩增,在采用巢式PCR进行检测和诊断患鲤疱疹病毒2型疾病上具有应用价。
恩诺沙星在异育银鲫肝微粒体中代谢及对P450主要亚酶影响的初步研究
恩诺沙星在异育银鲫肝微粒体中代谢及对P450主要亚酶影响的初步研究摘要细胞色素P450酶系(Cytochrome P450,简称CYP或者P450)是参与药物代谢最主要的一组同工酶。
P450介导了药物在生物体内的代谢过程,而药物可能对参与其代谢的P450相关酶活产生诱导或抑制作用。
本试验选取我国普遍养殖的淡水品种异育银鲫(Carasius auratus gibelio)为研究对象,以第三代氟喹诺酮类药物恩诺沙星(Enrofloxacin)为主要研究药物,考察恩诺沙星在其肝微粒体的代谢情况及对主要P450亚型酶活影响进行初步研究。
以期为该类药物对鱼类P450的进一步深入研究,指导临床合理应用提供理论基础。
应用差速离心法提取银鲫微粒体,以CO还原差示光谱法测定肝、肾、鳃、肠、肌肉微粒体的细胞色素P450及b5含量。
结果显示,细胞色素P450及b5含量均以肝微粒体最高,其P450及b5含量分别为0.312±0.008nmol/mg,0.142±0.010 nmol/mg,其次为肾、鳃、肠微粒体,肌肉最低,其P450及b5含量分别为0.008±0.032 nmol/mg,0.0015±0.033 nmol/mg。
用紫外分光光度法测定CYP2B型氨基比林N-脱甲基酶(Aminopyrine N-demethylase,APD)、CYP3A型红霉素N-脱甲基酶(Erythromycin N-demethylase,ERND)及CYP2E型苯胺-4-羟化酶(4-aniline-hydroxylase,AH)活性。
APD及ERND活性在上述组织中分布差异性类似,均表现为肝微粒体中最高,分别为 1.668±0.104nmol/min/mg和0.941±0.061nmol/min/mg,其次为肾、鳃、肠微粒体,肌肉微粒体中最低,两者活性分别为0.245±0.011 nmol/min/mg和0.078±0.019nmol/min/mg;AH活性以肝微粒体最高,为0.052±0.009 nmol/min/mg,其次为鳃微粒体,为0.044±0.007 nmol/min/mg,肌肉微粒体不能检出。
胆汁酸在鱼类养殖研究中的应用
养殖技术 2021.2胆汁酸在鱼类养殖研究中的应用向瑶(重庆师范大学 生命科学学院,动物生物学重庆市重点实验室,重庆 401331)摘 要:胆汁酸是胆固醇代谢的主要终产物。
作为鱼类饲料添加剂,胆汁酸在鱼类养殖过程中的使用范围也越来越广泛,对养殖鱼类品质有显著提高。
本文综述了胆汁酸的主要生理功能及在鱼类养殖研究中的应用,旨在为今后胆汁酸在鱼类养殖中的深入研究和开发应用提供科学依据。
关键词:胆汁;胆汁酸;鱼类养殖1 胆汁酸与胆汁胆汁是脊椎动物特有的由肝脏细胞分泌的有色粘性液体。
除鸟类、单蹄类动物和部分鱼类无胆囊外,绝大部分脊椎动物均有胆囊。
胆汁中含有胆汁酸、胆色素、胆固醇、磷脂酰胆碱、粘蛋白、酶和激素以及各种无机盐和大量的水分。
其中,胆汁酸是胆汁的主要成分,也是肝脏胆固醇代谢的主要产物。
依据结构胆汁酸可分为游离型胆汁酸和结合型胆汁酸,结合型胆汁酸是游离胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸的结合物;依据来源不同可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。
初级胆汁酸由肝细胞以胆固醇为原料直接合成,经肠道微生物修饰转化等作用进一步形成次级胆汁酸。
不同生物胆汁酸的成分组成不同,牛胆汁主要含结合型胆酸,游离型胆汁酸较少;熊胆中以牛磺熊去氧胆酸为主[1];鸡胆汁中则以鹅脱氧胆酸为主[2];硬骨鱼类通常以胆酸为主,部分鱼类如鲶鱼、鲫、黑鲷等还含有少量鹅胆酸[3]。
胆汁酸是既亲水又亲脂的两性物质,拥有较强的界面活性;通过扩大脂肪与脂肪酶的实际接触面积,加速脂类的消化。
同时,胆汁酸也带动了脂溶性维生素的吸收[4]。
胆汁酸可促进肝脏分泌更多低浓度的胆汁,清除胆汁淤积,排出药物、重金属等有毒物质,从而保持胆道畅通[5]; 。
胆汁酸破坏病原的磷脂双分子层引起细胞膜破裂,促进病原自溶,或通过调节肠道pH值影响肠道菌群蛋白质的表达,抑制肠道内有害病原的增殖[6]。
此外,胆汁酸还可作为信号分子激活各种受体有助于机体调节糖、脂代谢及炎症反应[7]。
2 胆汁酸在鱼类养殖研究中的应用目前胆汁酸在鱼类养殖中的应用研究主要集中在饲料添加胆汁酸对鱼体的生长性能、饲料消化率、肠道消化酶活力、抗氧化指标等方面。
江西省鲫鱼造血器官坏死病病毒(CyHV-2)感染流行病学研究
江西省鲫鱼造血器官坏死病病毒(CyHV-2)感染流行病学研究田飞焱;刘彬;欧阳敏;谢世红;王龙;徐节华;刘文珍;花麒;孟霞;银旭红【摘要】为了解江西省鲫鱼造血器官坏死病的流行状况和特征,2015~2017年,从江西省22个区(县、市)的水产养殖(苗种)场采集80批鲫样品,使用聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR(qPCR)进行病原鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的监测,扩增部分基因片段,进行测序和做进化树分析.结果显示,80批鲫样品检出CyHV-2型阳性样本6批,阳性检出率为7.5%,江西省存在CyHV-2散在性分布;系统进化分析显示江西省监测的所有CyHV-2毒株与YC110907、SY-C1、JS2012、H.Fukuda等CyHV-2病毒株属同一分支.鉴于目前江西省CyHV-2尚未成扩散的趋势,需加强苗种引种检疫,筑牢产业生物安全屏障.【期刊名称】《江西水产科技》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】5页(P33-37)【关键词】江西地区;鲫鱼造血器官坏死病;鲤疱疹病毒Ⅱ型;流行病学【作者】田飞焱;刘彬;欧阳敏;谢世红;王龙;徐节华;刘文珍;花麒;孟霞;银旭红【作者单位】江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;彭泽县水产局,江西九江,332700;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046;江西省水产技术推广站,江西南昌330046【正文语种】中文【中图分类】S941.41+40 引言鲫鱼作为江西省食用鱼的主要品种之一,2016年江西省鲫鱼养殖产量达21.21万吨,产量稳步持续增长。
湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6分子特征及其多克隆抗体制备
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2023,54(9):2692-2701ISSN 2095-1191; CODEN NNXAABDOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.09.020湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6分子特征及其多克隆抗体制备胡聂文,唐仪阳,冯孟哲,周泽军*(省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室/湖南师范大学生命科学学院,湖南长沙410081)摘要:【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体,为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。
【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列,采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Proteomics Server、SignalP 5.0、PSORT Ⅱ Prediction、SoftBerry-Psite、SWISS-MODEL及MEGA 11.0等在线软件进行生物信息学分析;利用原核表达系统表达融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体,基于免疫组织化学分析3nLGR6在湘云鲫2号肠组织中的分布情况。
【结果】3nLGR6基因ORF序列全长2874 bp,共编码957个氨基酸残基;3nLGR6蛋白理论分子量约105.4 kD,理论等电点(pI)为5.44,在其N端有1个亮氨酸重复序列结构域,C端存在1个7次跨膜结构的GPCR结构域,且在18Gly与19Ser间存在信号肽切割位点(Sec信号肽)。
3nLGR6与其他硬骨鱼类的LGR6氨基酸序列高度同源,其中与二倍体斑马鱼的相似性为92.28%。
与鱼类LGR6作用密切的基因有LGR4、RNF43、RSPO2、CTNNB1、APC和CTNNA1,主要涉及Wnt信号通路和Adherens junction信号通路。
注射热休克蛋白促进剂或抑制剂后异育银鲫感染CyHV-2时生理状态的响应
文章编号:1006-3188(2019)03-0008-05注射热休克蛋白促进剂或抑制剂后异育银鲫感染CyHV-2时生理状态的响应董华雨1,陈胜峰1 ,吴萍1 ,税典章1 ,许凡2 ,高璐1(1.苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏 苏州 215123;2.江苏华辰水产实业有限公司,江苏 盐城,224100)摘要:鉴于异育银鲫鳃出血病与温度相关的发病特征,分别对异育银鲫注射HSP70抑制剂和促进剂进行了其体内热休克蛋白的人工干预。
研究发现,养殖池塘自然发病的具有鳃出血病典型症状的异育银鲫,其肝脏内HSP70基因的表达量与健康异育银鲫相比明显升高,人工感染CyHV-2病毒后,肝脏内HSP70表达量在24h 后显著增加,当鱼体表现出发病症状时,HSP70表达量极显著上升。
对照组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶在鱼体发病时显著升高,且在发病时与注射促进剂和抑制剂组都有极显著差异;注射HSP70促进剂组在人工感染CyHV-2后,血清中天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶在12h 时显著升高。
注射HSP70抑制剂的异育银鲫体内病毒数在感染病毒后12h 时,就达到最高点,明显高于对照组及注射促进剂组的同时间段病毒数。
说明HSP70在抵御病毒的增殖中具有一定的积极作用。
关键词:异育银鲫,热休克蛋白,CyHV-2,谷氨酰胺,槲皮素中图分类号:S94 文献标识码:A 江苏省农业科技自主创新项目(CX(17)2027);江苏省水产三新工程重大项目(D2015-12)。
董华雨(1993-),男,硕士研究生,研究方向:从事水产动物遗传育种研究。
同等贡献作者:陈胜峰。
吴萍(1972-),女,副教授,研究方向:水产动物遗传育种。
基金项目:作者简介:通信作者:鳃出血病是异育银鲫(Carassius auratus gibelio )因感染鲤Ⅱ型疱疹病毒(CyHV-2)而致的一种疾病,初期病鱼表现为食欲减退,离群独游,后期则表现为鳃部出血,胸部、腹部有出血点,腹部肿胀,尾鳍、背鳍明显发白。
异甘草素调控肠道菌群和肠屏障功能改善小鼠非酒精性脂肪性肝病的作用机制
异甘草素调控肠道菌群和肠屏障功能改善小鼠非酒精性脂肪性肝病的作用机制Δ曾海燕 1*,简丽娜 2,吴辉星 2,周本杰 3, 4,乡世健 3, 4 #[1.中国科学院大学深圳医院(光明)检验科,广东 深圳 518106;2.广东医科大学药学院,广东 东莞 523808;3.中山大学附属第七医院药学部,广东 深圳 518107; 4.深圳市中药活性物质筛选与转化重点实验室,广东 深圳 518107]中图分类号 R 965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408(2023)23-2848-07DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2023.23.06摘要 目的 研究异甘草素对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD )模型小鼠肠道菌群和肠屏障功能的调控作用,阐明其改善NAFLD 的机制。
方法 将30只雄性C 57BL/6J 小鼠随机分为正常组(超纯水)、模型组(超纯水)和异甘草素组(100 mg/kg ),每组10只。
模型组和异甘草素组喂食高脂饲料19周建立NAFLD 模型;造模同时,各组小鼠灌胃相应药物/超纯水。
记录各组小鼠体重变化,计算小鼠肝指数、白色脂肪指数和棕色脂肪指数;观察小鼠肝脏组织和结肠组织的病理变化以及肝脏脂质堆积情况;检测小鼠血清或肝脏中总胆固醇(TC )、甘油三酯(TG )、天冬氨酸转氨酶(AST )和丙氨酸转氨酶(ALT )水平;检测小鼠血清中白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平和肝脏组织中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 表达水平;取小鼠粪便进行16S rRNA 测序,考察异甘草素对模型小鼠肠道菌群结构的影响;检测小鼠结肠组织中肠黏膜屏障功能相关蛋白[闭合蛋白4(Claudin-4)、闭合蛋白(Occludin )、紧密连接蛋白1(ZO-1)]的表达水平。
结果 与模型组比较,异甘草素组小鼠体重、肝指数,肝脏和血清中TC 水平以及血清中AST 、ALT 水平,血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平,肝脏组织中TNF-α mRNA 表达水平均显著降低;棕色脂肪指数显著升高;肝脏组织炎症与损伤显著改善,NAFLD 活动评分和脂质染色面积占比均显著减少(P <0.05)。
南京地区异育银鲫出血性败血症病原的鉴定
南京地区异育银鲫出血性败血症病原的鉴定近年来,鲤疮疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV2)感染的流行对我国异育银鲫的养殖造成了严重的经济损失。
该病原在中国大陆部分省市地区引起的疫情已受到越来越多的关注,特别是在江苏省主要水产养殖地区。
此外,其它细菌性病原,特别是嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)也引起鲫鱼的出血性败血症。
2015年,南京地区的部分异育银鲫饲养塘口相继出现了出血性败血症疫情。
本试验采集病料42份,首先分离纯化细菌,基于气单胞菌DNA促旋酶B亚单位(gyrB)基因序列设计引物,PCR扩增后测序,进行细菌性病原的检测;同时,提取各病料样本基因组,PCR扩增CyHV2解旋酶(hel)基因,进行病毒性病原的鉴定。
结果表明,28份检测样本有气单胞菌感染,其中6份为维氏气单胞菌(A.veronii),11份为简达气单胞菌(A.jandaei),3份为温和气单胞菌(A.sobria),8份为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。
在42份病料中,34份为CyHV2阳性,其中在30份病死鲫鱼样本中,26份为CyHV2阳性;在12份临床健康鱼样本中,8份为CyHV2阳性,阳性率分别为86.66%和66.67%。
其中值得注意的是,CyHV2和气单胞菌均阳性的样本共20份,占47.62%;两者均阴性的样本1份;CyHV2阴性而气单胞菌阳性的样本8份。
结果表明,CyHV2和气单胞菌的混合感染是引起此次鲫鱼出血性败血症的主要致病原,其中,CyHV2的分布更为广泛。
在病原鉴定的基础上,选择3株嗜水气单胞菌进行毒力测定,其对斑马鱼的半数致死量在1.4×103~3.7×103CFU/fish,且多位点序列分型显示均为ST251型。
同时,采用差速离心结合蔗糖浓度梯度离心,进行了 CyHV2病毒粒子的纯化,电镜观察显示,在各浓度层及层交界处均有病毒粒子分布,特别是在25%与35%蔗糖溶液交界处和35%蔗糖溶液层CyHV2病毒粒子浓度及纯度均较高。
不同脂肪源对异育银鲫形体与血液生化指标的影响
不同脂肪源对异育银鲫形体与血液生化指标的影响於叶兵;江世贵;林黑着;王煜恒;王爱民【期刊名称】《湖南农业大学学报(自然科学版)》【年(卷),期】2012(038)002【摘要】在基础料中分别添加4%的鱼油、豆油、猪油、花生油和混合油(鱼油、豆油、猪油质量比为3∶4∶3),制成5种等氮试验饲料,饲喂初始体质量为(6.04±0.05)g的异育银鲫60 d,以考察5种脂肪源对异育银鲫形体指标和血清生化指标的影响.结果表明:猪油组的肝体指数与脏体指数均最高,猪油组肝体指数显著高于鱼油组,猪油组脏体指数显著高于混合油组(P<0.05);各试验组鱼体肥满度差异不显著(P>0.05);各试验组总蛋白(TP)含量和白蛋白(ALB)含量的变化趋势相似,均为鱼油组显著高于猪油组(P<0.05),其余各组之间差异不显著(P>0.05);各试验组谷草转氨酶(AST)活性和谷丙转氨酶(ALT)活性的变化趋势相似,均为猪油组显著高于鱼油组(P<0.05),其余各试验组之间差异不显著(P>0.05);鱼油组甘油三酯(TG)含量最低,豆油组其次,均显著低于混合油组(P<0.05);鱼油组高密度脂蛋白(HDL-C)含量最高,花生油组其次,均显著高于猪油组(P<0.05);各试验组球蛋白(GLB)、胆固醇(CHO)、葡萄糖(BGLU)、低密度脂蛋白(LDL-C)、皮质醇、胰高血糖素(Glu)和胰岛素(Ins)的含量和碱性磷酸酶(AKP)活性差异不显著(P>0.05).在本试验5种脂肪源中,鱼油对异育银鲫形体与血液生化指标的作用效果最好,豆油、花生油和混合油其次,猪油最差.【总页数】6页(P192-197)【作者】於叶兵;江世贵;林黑着;王煜恒;王爱民【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院水产种质资源与养殖技术重点开放实验室,广东广州510300;盐城工学院海洋技术系,江苏盐城224051;盐城工学院江苏省沿海池塘养殖生态重点实验室,江苏盐城224051;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院水产种质资源与养殖技术重点开放实验室,广东广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东广州510300;中国水产科学研究院水产种质资源与养殖技术重点开放实验室,广东广州510300;南京农业大学动物科技学院,江苏南京210095;盐城工学院海洋技术系,江苏盐城224051;盐城工学院江苏省沿海池塘养殖生态重点实验室,江苏盐城224051【正文语种】中文【中图分类】S965.117【相关文献】1.不同脂肪源对异育银鲫的生长、体组成和肌肉脂肪酸的影响 [J], 陈家林;韩冬;朱晓鸣;杨云霞;解绶启2.不同脂肪源对朗德鹅产肝性能及血液生化指标的影响 [J], 周淑世;张贇;牛淑玲;张晶;廉传江;朱彤;孙亮;邢沈阳;宋广文;张子昌3.不同脂肪源对异育银鲫生长性能、机体成分、血清生化指标、体组织脂肪酸组成及脂质代谢的影响 [J], 张媛媛;刘波;戈贤平;刘文斌;谢骏;高启平;顾夕章4.不同过瘤胃脂肪源对安格斯牛育肥性能及血液生化指标的影响 [J], 谭亚楠;吴树峰;杨文强;张拴林;刘强;郭刚5.不同过瘤胃脂肪源对安格斯牛育肥性能及血液生化指标的影响 [J], 谭亚楠;吴树峰;杨文强;张拴林;刘强;郭刚因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
恩诺沙星在异育银鲫体内和体外肝微粒体中代谢产物分析
恩诺沙星在异育银鲫体内和体外肝微粒体中代谢产物分析周帅;李国烈;胡琳琳;房文红【期刊名称】《东北农业大学学报》【年(卷),期】2013(044)006【摘要】采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法(UPLC/Q-TOF MS)对恩诺沙星在异育银鲫体内和体外肝微粒体中代谢产物进行定性分析.结果表明,异育银鲫血浆中除以恩诺沙星原形药物为主外,还可检测到少量N-去乙基代谢产物环丙沙星、葡萄糖醛酸结合物;而在肝微粒体体外孵育体系中除检测到原形药物外,只有少量N-去乙基代谢物环丙沙星.无论是体内还是体外,代谢产物生成量都很少.推测恩诺沙星在异育银鲫体内代谢反应主要是脱乙基反应和葡萄糖醛酸结合反应,而在体外肝微粒体恩诺沙星代谢反应主要是脱乙基反应.【总页数】6页(P101-106)【作者】周帅;李国烈;胡琳琳;房文红【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海20009;南充农产品质量监测检验中心,四川南充637000;中国水产科学研究院东海水产研究所农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海20009;中国水产科学研究院东海水产研究所农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室,上海20009【正文语种】中文【中图分类】S859.2;O657.63【相关文献】1.肝微粒体体外温孵法与基因重组P450酶系在药物体外肝代谢研究中的应用进展[J], 刘颖;马小军2.恩诺沙星在凡纳滨对虾体内和体外肝微粒体中的代谢产物比较分析 [J], 周帅;胡琳琳;孙贝贝;房文红3.异育银鲫肝微粒体体外恩诺沙星 N-脱乙基酶酶促反应动力学初步研究 [J], 贾娴;房文红;胡晓;汪开毓4.东莨菪内酯在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物分析及其含药血清对大鼠肝星状细胞的影响 [J], 杨增艳; 张颖; 李嘉; 陈少锋; 黄鑫; 靳洪涛5.姜黄素和吉马酮的体外肝微粒体代谢产物分析 [J], 苏少锋;黄国林;严枫;冯洁因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
聚六亚甲基胍对异育银鲫造血器官坏死症的防治效果研究
聚六亚甲基胍对异育银鲫造血器官坏死症的防治效果研究俞军;孙琪;王会聪;蒋新益;胡鲲;杨先乐;黄保华【摘要】分别采用腹腔注射含鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)的组织浆和患病鱼直接感染的方法进行人工感染实验,并对实验鱼发病组织病毒DNA进行巢式PCR检测,将扩增产物进行测序比对,研究聚六亚甲基胍( Polyhexamethylene guanide, PHMG)对异育银鲫( Carassius auratus gibelio)感染鲫造血器官坏死症( Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)的防治效果。
结果显示:两种人工感染的方法出现相似的感染症状,但后者感染周期相对较短;实验毒株与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因具有高度同源性(99.0%),该毒株与JSSY、 YC110907等CyHV-2其他病毒株属同一分支。
药物预防实验表明:当PHMG浓度≥0.5 mL/m3时,保护率可达60%以上,对该病有显著抑制作用。
治疗实验表明,药物对感染3 d后的鲫具有显著抑制作用,当PHMG浓度≥0.75 mL/m3时,保护率达63.33%以上,对该病有较好的治疗效果;当PHMG浓度≥2.5 mL/m3时,对感染5 d后的鲫具有显著抑制作用,保护率达63.33%以上。
低浓度的药物治疗效果虽不显著,但可延长病鱼的存活时间。
%Intraperitoneal injection containing the tissue homogenate of Cyprinid herpesvirusⅡ(CyHV-2) and infection by diseased fish were used in artificial infection.Detect DNA of the virus from the infected Carassius auratus gibelio by nes-ted-PCR assay and the amplification product was analyzed to study the effect of polyhexamethylene guanide ( PHMG) on preventing and curing Crucian Carp Hematopoietic Necrosis in C.auratus gibelio.The result showed the two methods ap-peared the similar symptoms and the latter one took theshorter infection cycle.The strain in the experiment shared so high identity (99.0%) with the published DNA helicase gene sequence of CyHV-2 stains in GenBank, forming an independent branch on the phylogenetic tree with other CyHV-2 strains such as JSSY, YC110907.Also, the results showed that when the concentration of PHMG was more than 0.5 mL/m3 , affected the disease it remarkably, with the protection rate of more than 60%.Meanwhile, the test of cure showed PHMG inhibited the fishes infected for 3 days significantly and when the concentration of drug was more than 0.75 mL/m3 , it had good therapeutic effect on the disease with the protection rate of more than 63.33%; at the same time, when the concentration of drug was more than 2.5 mL/m3 , it inhibited the fishes infected for 5 days significantly, and the protection rate was more than 63.33%.Though the effect of low concentration was not significant, the time of survival can be extended.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】7页(P49-55)【关键词】鲤疱疹病毒Ⅱ型;聚六亚甲基胍;异育银鲫(Carassius auratus gibelio);鲫造血器官坏死症;防治【作者】俞军;孙琪;王会聪;蒋新益;胡鲲;杨先乐;黄保华【作者单位】上海海洋大学国家水生动物病原库,上海 201306;上海海洋大学国家水生动物病原库,上海 201306; 上海黛龙生物工程科技有限公司,上海201414;江苏农林职业技术学院,江苏句容 212400;上海海洋大学国家水生动物病原库,上海 201306;上海海洋大学国家水生动物病原库,上海 201306;上海海洋大学国家水生动物病原库,上海 201306;上海黛龙生物工程科技有限公司,上海201414【正文语种】中文【中图分类】S948异育银鲫(Carassius auratus gibelio)属辐鳍鱼纲(Actinopterygii)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲫属(Carassius),具有生长快、个体大、抗逆性强等特点,目前在我国已成为主要的鲫养殖品种。
异育银鲫各组织器官中细胞色素P450药酶活性的比较
异育银鲫各组织器官中细胞色素P450药酶活性的比较贾娴;胡琳琳;房文红;汪开毓;胡晓【期刊名称】《大连海洋大学学报》【年(卷),期】2011(026)001【摘要】对异育银鲫Carassius auratus gibelio肝胰脏、肾、鳃、肠和肌肉等组织器官中细胞色素P450(CYP450)主要药酶活性进行检测,研究其在异育银鲫各组织中的分布。
结果显示:以CO还原差示光谱法测得异育银鲫肝胰脏、肾、鳃、肠、肌肉微拉体的细胞色素P450及b5含量均以肝胰脏微粒体中最高,其次为肾、鳃、肠微粒体,肌肉中最低。
以氨基比林N-脱甲基、红霉素N-脱甲基、苯胺-4-羟化反应分别作为CYP2B、CYP3A和CYP2E的探针反应,测得氨基比林N-脱甲基酶(APD)及红霉素N-脱甲基酶(ERND)活性在上述组织中分布差异性类似,均表现为肝胰脏微粒体中最高,分别为(1.668±0.104)、(0.941±0.061)nmol/(min.mg),其次为肾、鳃、肠微粒体,肌肉微粒体中最低,分别为(0.245±0.011)、(0.078±0.019)nmol/(min.mg);苯胺-4-羟化酶(AH)活性以肝胰脏微粒体最高,为(0.052±0.009)nmol/(min.mg),其次为鳃微粒体,肌肉微粒体中最低,不能检出。
研究表明,异育银鲫主要组织微粒体中具有细胞色素P450亚型活性,且它们在异育银鲫体内的分布和活性存在着组织和器官差异性,以肝胰脏组织中的含量和活性为最高。
【总页数】5页(P74-78)【作者】贾娴;胡琳琳;房文红;汪开毓;胡晓【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】S948【相关文献】1.异育银鲫各组织器官中细胞色素P450药酶活性的比较2.人细胞色素P4502E1基因在胚胎鼻咽组织、鼻咽癌细胞和组织中的表达3.二恶英对内膜组织中细胞色素芳香化酶P450表达的影响4.淇河鲫不同器官组织中抗氧化酶活性和丙二醛含量的比较5.氟甲喹对异育银鲫细胞色素CYP450主要药酶的影响因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
异育银鲫口服不同剂量淀粉后血糖和血脂代谢变化
异育银鲫口服不同剂量淀粉后血糖和血脂代谢变化王芬;谭青松;解绶启;朱晓鸣;沈建忠【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2008(032)004【摘要】碳水化合物是鱼类饲料中易得且价廉的非蛋白能源,可以节约蛋白质分解供能,但大多数鱼类对糖的耐受量很低,表现出一种类似糖尿病的症状。
反映鱼类的血糖调节能力的首要指标是糖耐量实验,Wilson早在1994年就通过灌喂方式进行糖耐量实验来研究鱼类对糖的耐受情况。
鱼类对糖的利用能力因鱼的种类不同而不同。
在糖耐量实验中,对于肉食性的鱼类,需要在饲料中给予较低水平的碳水化合物才会产生一个基础血糖水平,如果没有对这种含碳水化合物的饲料进行适应,它们对血糖的调节能力极为低下。
杂食性鱼类对葡萄糖的耐受量要比肉食性鱼类高。
【总页数】5页(P610-614)【作者】王芬;谭青松;解绶启;朱晓鸣;沈建忠【作者单位】华中农业大学水产学院,武汉,430070;华中农业大学水产学院,武汉,430070;中国科学院水生生物研究所,武汉,430072;中国科学院水生生物研究所,武汉,430072;华中农业大学水产学院,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】S965.117【相关文献】1.不同剂量洛伐他汀对糖尿病合并高血脂患者血浆大内皮素、脑钠肽、血糖以及血脂的影响 [J], 张军;赵锐;徐杰;丁太龙;秦月芬2.精神分裂症患者药物治疗后血糖、血脂和尿酸代谢变化及相关因素分析 [J], 徐爱良;金燕君;蔡文治3.异育银鲫口服不同剂量葡萄糖后的代谢反应 [J], 蔡春芳;刘影;陈立侨;宋学宏;吴萍4.异育银鲫口服葡萄糖后血糖、血脂和肝糖原的变化 [J], 蔡春芳;陈立侨;宋学宏;吴萍;丁磊5.来得时及捷诺维对口服降糖药血糖控制不佳的2型糖尿病患者的血糖、血脂、空腹胰岛素水平的影响 [J], 鞠振华因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
肠道菌群与鱼类病毒感染互作模型研究
肠道菌群与鱼类病毒感染互作模型研究我国水产养殖业体量巨大,给人们提供了大量的优质蛋白,是我国养殖业的支柱产业之一。
病毒病是危害水产养殖业的主要传染性疾病,传统的治疗手段无法有效的杀灭鱼体的病毒和控制其传播。
肠道菌群如今已被证实参与机体和病毒互作,调控机体抗病毒免疫,与此相应的,部分研究表明益生菌可有效控制水生病毒对养殖鱼类的感染和传播。
我们首先分析了同一发病鱼塘中感染和不感染鲤鱼疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的鲤鱼(Cyprinus carpio)的肠道菌群,发现发病鲤鱼肠道肠杆菌和假单胞菌的丰度与正常鲤鱼有着明显差异,但整体的菌群结构未见显著性区别。
之后我们分析了对CyHV-2有不同抗性的两种异育银鲫(Carassius auratus gibelio)的肠道菌群,发现两种异育银鲫品系的肠道菌群结构高度相似,二者只是在个别低丰度的属种出现显著性的差异。
为了进一步在实验室可控的条件下研究肠道菌群对鱼类病毒感染的可能影响,我们在实验室条件下,成功模拟了鲤鱼春季病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)的自然传播途径,建立了基于成年斑马鱼的病毒感染模型。
通过给3月龄正常成年斑马鱼腹腔注射10~8 copies的SVCV,在其发病后与正常1月龄斑马鱼共浴,使1月龄斑马鱼感染SVCV。
并且检测了共浴鱼中高带毒鱼体和不带毒(或带毒量极低)鱼体肠道菌群及抗病毒相关基因的表达。
结果显示不带毒鱼体中抗病毒免疫相关基因Rig-I、MxB、pkz、IFN phi1、IFN phi2的表达量均显著高于高带毒鱼体,说明不带毒鱼体的天然抗病毒免疫反应高于高带毒鱼。
然而,不带毒鱼体和高带毒鱼体的肠道细菌数量和主要门和属的丰度无显著性差异。
最后,我们采用了无菌斑马鱼生产技术,建立了无菌斑马鱼病毒浸浴感染模型。
使用约10~8copies/mL SVCV浸浴感染无菌斑马鱼。
低蛋白饲料补充必需氨基酸对异育银鲫生长、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因的影响
低蛋白饲料补充必需氨基酸对异育银鲫生长、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因的影响何林岳;刘昊昆;韩冬;朱晓鸣;金俊琰;杨云霞;解绶启【期刊名称】《水生生物学报》【年(卷),期】2024(48)1【摘要】实验以初重为(12.71±0.11)g的异育银鲫“中科5号”(Carassius gibelio var.CAS V)为研究对象,基于异育银鲫必需氨基酸需求量,探究在低蛋白饲料中补充必需氨基酸对异育银鲫生长、消化、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因表达的影响。
实验设计3组等能饲料:CON组(35%粗蛋白)、LP组(28%粗蛋白)和LP+EAA组(28%粗蛋白+晶体氨基酸),养殖周期为50d。
实验结果显示:低蛋白饲料中补充必需氨基酸显著提高异育银鲫生长性能(P<0.05),并与CON组无显著差异(P>0.05);LP+EAA组的肝脏谷草转氨酶活性显著高于LP组(P<0.05),而谷丙转氨酶活性各组间无显著差异(P>0.05);补充必需氨基酸对肠道中胰蛋白酶和淀粉酶活性有显著影响(P<0.05),而对糜蛋白酶和脂肪酶无显著影响(P>0.05)。
肠道中cat2、asct2和b0at1三种氨基酸转运蛋白显著上调(P<0.05),LP组的b0,+at 的相对表达量显著下调(P<0.05),而pept1的表达各组间无显著差异(P>0.05);肝脏中LP组tor相对表达量显著降低(P<0.05),LP+EAA组的s6k1表达水平显著上调(P<0.05),而4ebp2和eif4e的相对表达量在各组间无显著差异(P>0.05);背肌中LP+EAA组的tor表达水平显著上调(P<0.05),LP组的eif4e表达水平显著下调(P<0.05),而s6k1和4ebp2的相对表达量在各组间无显著差异(P>0.05)。
综上所述,向异育银鲫“中科5号”幼鱼饲料中补充必需氨基酸至需求量可以将饲料蛋白水平由35%降至28%,而不会对生长、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因表达等产生负面影响。
银鲫线粒体基因组序列分析及ENU诱变银鲫F1代遗传差异分析的开题报告
银鲫线粒体基因组序列分析及ENU诱变银鲫F1代遗传差异分析的开题报告一、研究背景和意义银鲫(Carassius auratus)是重要的淡水经济鱼类,主要分布于我国南北各地。
近年来,随着水产养殖业的发展,银鲫成为了重要的经济鱼类之一。
然而,在银鲫的生长过程中,难以避免出现各种疾病,这不仅会直接影响银鲫的生长和质量,还会带来经济损失。
因此,开展银鲫品种改良和疾病防治研究具有重要的科学意义和经济价值。
线粒体基因组是细胞内的一种细胞质DNA,对于生命的维持和发展起着重要的作用。
在近年来,越来越多的研究表明线粒体基因组序列的分析可以为物种进化、遗传多样性和疾病等方面的研究提供重要的数据。
ENU是一种高效的诱变剂,被广泛应用于植物和动物的遗传变异研究。
在银鲫的ENU诱变中,可以针对特定性状进行筛选,对于银鲫的品种改良和疾病防治具有重要的意义。
因此,本研究旨在对银鲫线粒体基因组序列进行分析,并结合ENU诱变银鲫F1代,分析其遗传差异,为银鲫品种改良和疾病防治提供重要的理论和实践基础。
二、研究内容和方法1.银鲫线粒体基因组序列分析将银鲫的线粒体基因组DNA提取,通过二代高通量测序技术对其进行测序,结合基因组装软件进行组装和注释,分析银鲫的线粒体基因组序列特征和遗传多样性。
2.银鲫ENU诱变及遗传差异分析将正常银鲫F0代用ENU处理,获得银鲫F1代,通过基因组测序技术对不同个体进行测序,获得遗传变异信息。
结合基因型分析和表型观察,分析银鲫ENU诱变F1代的遗传差异,并探究其遗传特性。
三、预期成果本研究预期获得银鲫线粒体基因组序列,并分析其特征和遗传多样性。
同时,通过ENU诱变银鲫F1代进行遗传差异分析,探究其遗传特性。
预期发表相关科研论文1-2篇,为银鲫品种改良和疾病防治提供理论和实践基础。
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doi: 10.7541/2017.119在患CyHV-2病的异育银鲫肠道黏膜中胆固醇、胆汁酸代谢通路基因的差异表达叶元土1吴萍1蔡春芳1林秀秀1吴代武1何杰1张宝彤2萧培珍2 (1. 苏州大学基础医学与生物科学学院, 江苏省水产动物营养重点试验室, 苏州 215123; 2. 北京营养源研究所水产动物系统营养研究开放试验室, 北京 100000)摘要: 为了探讨CyHV-2疾病条件下异育银鲫胆汁酸肠肝循环代谢途径主要基因表达活性的变化, 以患CyHV-2病的、正常的异育银鲫肠道黏膜为材料, 提取总RNA, 采用RNA-Seq测序、对单一基因进行注释, 并进行KEGG富集分析、单一基因差异表达分析。
结果显示, 肠道黏膜组织有7770个基因显著性差异表达, 其中, 差异表达上调基因数为3335个、差异表达下调的基因数为4435个, 表明CyHV-2病的发生对肠道黏膜组织基因表达产生了重大的影响。
病鱼胆固醇、胆汁酸生物合成代谢途径的酶、蛋白质的基因显著性差异表达, 显示肠道黏膜胆固醇、胆汁酸合成代谢受到显著性影响。
参与胆固醇、胆汁酸合成代谢调节作用, 以及胆固醇、胆汁酸分泌、吸收、转运等生理过程的蛋白质、酶的基因也是差异表达下调, 胆汁酸肠肝循环有出现代谢障碍的趋势。
结果表明, CyHV-2病的发生对肠道黏膜组织基因表达产生了严重影响, 对胆固醇、胆汁酸的合成代谢途径、胆汁酸肠肝循环途径的基因表达产生了严重影响, 将导致病鱼体内胆固醇、胆汁酸量的不足。
患CyHV-2病病鱼血清胆汁酸含量下降了99%、胆固醇含量下降了10%, 证实了上述基因差异表达的趋势。
关键词: 氧化鱼油; 黏膜; 胆固醇; 胆汁酸; 异育银鲫中图分类号: S917 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2017)05-0956-07油脂是水产动物饲料的主要营养物质和能量物质, 而油脂易氧化, 其氧化的中间产物、终产物对水产动物具有氧化损伤作用[1, 2]。
在草鱼饲料中添加氧化鱼油[3]或者对草鱼灌胃氧化鱼油[4], 导致草鱼肝胰脏、肠道黏膜胆固醇生物合成通路基因差异表达, 血清、肠道内胆汁酸含量显著下降; 胆汁酸的肠肝循环受到严重的障碍, 而胆汁酸的肠肝循环对于维护肝胰脏和肠道组织结构完整性和功能完整性具有重要的生理作用[4]。
异育银鲫(Carassius auratus gibelio)受到鲤疱疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)感染后出现全身性出血症状, 并导致主要器官组织如肝胰脏、脾脏、肾脏、肠道黏膜、血液等组织严重损伤; 同时, 病鱼血清的胆固醇和胆汁酸含量显著下降[5—7]。
肠道黏膜是动物体内代谢活跃的器官组织, 也是胆固醇、胆汁酸合成的重要器官组织之一, 本文分别以正常的、患CyHV-2病的异育银鲫肠道黏膜为材料, 提取总RNA后采用高通量测序技术(RNA-Seq)进行转录组分析, 以正常异育银鲫的结果为对照, 在转录组水平上, 对参与胆固醇、胆汁酸生物合成通路的蛋白质、酶的基因进行功能注释和差异表达活性分析, 探讨在患CyHV-2病的情况下, 异育银鲫肠道黏膜组织中胆固醇、胆汁酸合成代谢的酶、蛋白质基因表达活性的变化, 以及参与胆汁酸肠肝循环的酶、蛋白质基因表达活性的变化, 从一个侧面、从转录组水平较为宏观的视觉探讨异育银鲫患CyHV-2病的病理代谢变化, 为该病的病理分析和防治提供参考。
1 材料与方法1.1 试验鱼江苏盐城大丰市池塘养殖的异育银鲫。
正常鱼无CyHV-2病发病特征, 病鱼则是具有CyHV-2病发病特征、经过PCR定量检测带有CyHV-2病毒的异育银鲫[5—7]。
第 41 卷第 5 期水生生物学报Vol.41, No.5 2017年 9 月ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA S e p.,2017收稿日期: 2016-09-07; 修订日期: 2016-12-24基金项目:江苏省水产三新工程项目(D2015-12)资助 [Supported by the Jiangsu Province, Three New Aquatic Projects (D2015-12) Funding]通信作者:叶元土, 教授, 硕士生导师, E-mail: yeyt@, Tel./Fax: +86-139********参照林秀秀等[5—7]对异育银鲫CyHV-2病鉴定方法, 用于血清胆固醇、胆汁酸含量分析的试验鱼包括正常(H)组(CyHV-2的PCR检测结果阴性)、携带CyHV-2(CyHV-2的PCR检测结果阳性)但未出现病症(IH)组、典型的CyHV-2病症(I)组(CyHV-2的PCR检测结果阳性)异育银鲫, 体重为350—510 g,每组各9尾、共27尾。
用于总RNA提取并进行转录组分析的患Cy-HV-2病异育银鲫9尾、正常异育银鲫9尾。
平均体重(365±15) g/尾。
1.2 血清采集与总RNA提取按照常规方法采集正常组(H)、携带CyHV-2但无病症组(IH)、患CyHV-2病并具有典型病症组(I)的异育银鲫血清, 用雅培C800全自动生化分析仪测定血清胆固醇和胆汁酸含量。
正常组、患CyHV-2病组异育银鲫肠道黏膜各9个样本(每尾鱼为1个样本), 分别用试剂盒(EASYspin Plus)每尾鱼独立用于提取总RNA, 电泳检测RNA 质量。
正常组、病鱼组分别选取电泳条带亮度高、清晰、无拖尾的高质量RNA进行等量混合, 正常组、病鱼组各1个样本(每个样本至少有5尾试验鱼的总RNA样本组成), RNA质量约4 μg。
同样方法再混合一个RNA样本, 其余的RNA舍弃。
正常组、病鱼组分别得到2个(n=2)平行样本用于RNA-seq分析。
1.3 转录组分析RNA-Seq 样品总RNA用DNaseⅠ消化DNA后, 用Oligo d (T)磁珠纯化总RNA中的mRNA,向得到的mRNA中加入适量打断试剂, 在高温条件下使其片段化, 再以片段后的RNA为模板, 合成cDNA, 经过磁珠纯化、末端修复、3'末端加碱基A、加测序接头后, 进行PCR扩增, 从而完成整个文库制备工作。
构建好的文库用Agilent 2100 Bioana-lyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System质检和测序。
读段长度125 bp。
无参转录组的转录本拼接与基因功能注释 经过质控(QC)、过滤后得到读段(clean reads)用Trinity (版本: v2012-10-05, min_kmer_ cov为2)软件进行无参考基因组的转录本拼接。
对拼接好的转录本利用不同的数据库进行uni-gene基因注释。
各数据库及功能注释所用到的方法: ①与SwissProt、KOG、KEGG GENES序列数据库的比对采用NCBI blast 2.2.27+, 经过Swissprot 注释得到了38071个、KOG注释得到32345个单一基因。
②PFAM蛋白结构域预测采用HMMER 3.0 package-hmmscan, 经过Pfam注释得到10227个单一基因。
③GO功能注释为基于Swissprot和Pfam两部分的蛋白注释结果, 软件为Blast2GO v2.5, 经过GO注释得到36838个单一基因。
基因差异表达分析与KEGG通路分析采用RSEM软件, 以Trinity拼接得到的转录组作为参考序列, 将每个样品的clean reads对参考序列做比对进行基因表达定量。
差异表达分析用edgeR软件包进行分析。
对于所有基因, 当其表达量在正常组、病鱼组两个不同样品间具有差异且统计分析中调整P值(假阳性率)<0.05时, 认为其在两个不同样品中具有显著差异表达。
以KEGG Pathway为单位, 应用超几何检验, 找出与整个基因组背景相比、在差异表达基因中显著性富集的Pathway。
以corrected P-value≤0.05为阈值, 满足此条件的定义为在差异表达基因中显著富集的KEGG条目。
2 结果2.1 血清胆固醇、总胆汁酸含量由表 1可知, 异育银鲫携带CyHV-2后, 在IH组、I组, 其血清中胆汁酸和胆固醇含量显著下降。
与正常鱼体的结果比较, 病鱼血清总胆汁酸含量下降了99%、血清胆固醇含量下降了10%。
2.2 基于转录组分析的基因差异表达基于通过注释的单一基因结果, 在正常、患CyHV-2病异育鲫鱼样本间进行了基因差异表达分析, 总共有7770个显著差异表达的基因, 其中, 显著差异表达上调基因数为3335个, 占差异表达基因总数的43%; 显著表达下调的基因数为4435, 占57%。
由表 2可知, 在KEGG类固醇合成通路的21个基因中, 有15个基因差异表达, 占通路基因总数的71%;在KEGG初级胆汁酸合成通路的20个基因中, 有14个基因显著差异表达, 占通路基因总数的70%;上述2个KEGG通路差异表达均达到显著性水平表 1 异育银鲫血清胆固醇和总胆汁酸含量与比较Tab. 1 Gibel carp serum total cholesterol and bile acid content 指标Index正常组(H)Normal携带CyHV-2但无病症组(IH)Early stages患病组(I)Illness总胆汁酸Total bile acid(μmol/L)13.7±5.6b7.767±5.066ab0.203±0.784c与正常组比较Compared withnormal group (%)––43–99胆固醇Cholesterol(mmol/L)5.447±0.562a 4.32±0.572b 4.877±1.671ab与正常组比较Compared withnormal group (%)––21–105 期叶元土等: 在患CyHV-2病的异育银鲫肠道黏膜中胆固醇、胆汁酸代谢通路基因的差异表达957(P<0.05)。
上述结果显示, 异育银鲫在患CyHV-2病后, 肠道黏膜组织的基因发生了显著性的差异表达,其中胆固醇、胆汁酸的生物合成通路基因也发生了显著性的差异表达。
2.3 胆固醇合成通路基因的差异表达基于患CyHV-2病与正常的异育银鲫肠道黏膜转录组分析结果, 统计了胆固醇生物合成途径有18个具有差异表达的基因(表 3)。
将注释得到的单一基因序列, 利用NCBI/ Blast进行相对于不同物种相同基因的同源性分析。
表 3中的18个基因与斑马鱼、安水金线鲃、犀角金线鲅、滇池金线鲃中相同基因的同源性较高, 同源性达到78%—100%。