SDS-PAGE电泳法测定蒜头果蛋白的相对分子质量

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SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂, 它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
4、加样
用移液器分别取10 l样品液,小心将样品加 到凝胶凹形样品槽底部。
5、电泳 将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接, 打开电泳仪开关,设置电压为110V,电泳 80mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部,停止 电泳,关闭电源。
6 、染色与脱色 电泳结束后,取下玻板,在自来水下用特制板撬开短 玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,在两侧溴 酚蓝染料区带中心,插入细铜丝作为前沿标记。加入染 色液染色60 mins,再用脱色液脱色,直至蛋白质区带 清晰,即可计算相对迁移率。
2、凝胶的制备
2)浓缩胶的制备
配 制 3% 浓 缩 胶 。 在 烧 杯 中 依 次 加 入 重 蒸 水 3.12ml,浓缩胶缓冲液1.25ml,10%SDS 0.05ml,凝 胶储备液0.6ml,10% 过硫酸铵 25ul和TEMED 5ul(两块胶的量???)。混匀后用注射器加到已 聚合的分离胶上方,直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。
【操作方法】 1、垂直板电泳槽
2、凝胶的制备
1)分离胶的制备
配 制 12% 分 离 胶 。 在 烧 杯 中 依 次 加 入 重 蒸 水 3.35ml,分离胶缓冲液2.5ml,10%SDS 0.1ml,凝胶 储备液4.0ml,10% 过硫酸铵50ul和TEMED 10ul (两块胶的量???)。由于AP和TEMED相遇后 凝胶即开始聚合,所以应立即混匀混合液,用移液 枪抽取3.2~3.5ml凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝 内.再用注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一 层重蒸水,用于隔绝空气,使胶面平整。37℃烘箱下 聚合(约30 -60min)。待凝胶完全聚合.将贮槽的 蒸馏水倒去 ,用细条滤纸吸去残留的水液。

实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

实验一 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

3.浓缩胶的制备 按下表配制浓缩胶, 按下表配制浓缩胶,将浓缩胶混 匀后直接灌注在已聚合的分离胶 立即插入梳子, 上,立即插入梳子,将凝胶垂直 放于室温下聚合。 放于室温下聚合。
浓缩胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 浓缩胶缓冲液(pH6.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 4%(ml) 3.05 0.65 1.25 0.05 2小滴 小滴 0.05 5ml
4.样品预处理: 样品预处理: 取样品液与等体积样品缓冲液 混合,100℃加热1 分钟。 混合,100℃加热1~2分钟。 5.待浓缩胶聚合完全后,小心移出 待浓缩胶聚合完全后, 梳子, 梳子,然后将胶板固定于电泳装置 上下槽各加入电极缓冲液。 上,上下槽各加入电极缓冲液。 6.加样: 加样: 用微量进样器加样。 用微量进样器加样。 每个样品孔加入20ul样品 样品。 每个样品孔加入20ul样品。 同时加一个标准品。 同时加一个标准品。
分离胶的配制
H2O 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺 分离胶缓冲液(pH8.8) 分离胶缓冲液(pH8.8) 10% SDS TEMED 10%过硫酸铵 过硫酸铵 总体积 10%(ml) 10 10 7.5 0.3 1滴 滴 0.1 30ml
将分离胶混匀后立即灌注于玻板间 隙中,上层小心覆盖一层正丁醇。 隙中,上层小心覆盖一层正丁醇。 将胶板垂直放于室温下, 将胶板垂直放于室温下,待分离胶 聚合完全后, 聚合完全后,倾去正丁醇并用滤纸 吸干。 吸干。
操作步骤 1.安装制胶模具 A 、要用琼脂进行封边,防止 要用琼脂进行封边, 凝胶泄露, 凝胶泄露,尤其注意边角的 地方。 地方。 B、安装时,要将螺丝拧紧, 安装时,要将螺丝拧紧, 也是为了防止泄露。 也是为了防止泄露。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量SDS-PAGE电泳是现代生物学和生物化学研究中最常用的方法之一,可用于测定蛋白质的相对分子质量、纯度和数量等指标。

下面将就SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量进行介绍。

SDS-PAGE电泳的原理:SDS-PAGE电泳是一种基于PAG(聚丙烯酰胺凝胶板)的矩阵上运行的直流凝胶电泳。

相对分子质量(MW)是以电泳迁移距离为单位来表示的。

蛋白质在PAG上被限制在孔道中运动,因此,蛋白质分子迁移距离与分子大小成正比。

通过使用外部标准,可以精确地将样品的迁移距离转换为分子量。

这种分离方法受到电荷和大小作用的影响,电势梯度使带电的蛋白质分子在凝胶中迁移。

SDS-PAGE电泳的过程:SDS-PAGE电泳的过程主要包括:样品加载、电泳和染色步骤。

(1)样品加载:样品的制备:蛋白质样品通常经过还原和变性,以便将所有蛋白质中的二硫键断裂并且在孔道中呈现线性的多聚蛋白质结构。

这需要在治疗过程中对样品添加SDS缓冲液,然后在热水浴或高压下暴露于还原剂,例如2-硫代乙酸(DTT)或β-巯基乙酸(MEA)。

(2)电泳:将处理过的样品通过凝胶基质中的丝状孔道。

随着电场的施加,蛋白质会在SDS凝胶板上自由迁移,从而分离出蛋白系列。

(3)染色:电泳结束后,将凝胶板进行染色。

目前较常用的方法是银染、共染和Coomassie Brilliant Blue染色法。

SDS-PAGE电泳的应用:SDS-PAGE电泳广泛应用于研究蛋白质相对分子质量、活性定量、纯度评估、亚基分离等方面。

其中,蛋白质相对分子质量的测定是SDS-PAGE电泳的最主要应用之一。

通过将未知蛋白与已知分子质量蛋白一起电泳,可以通过线性回归计算未知标本的分子大小。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS_PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告:SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、实验目的通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定蛋白质相对分子质量,了解其基本原理和实验操作流程。

二、实验原理SDS-PAGE是一种常用的测定蛋白质相对分子质量的方法。

它利用十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白质的结合性质,将蛋白质变性并带负电荷,使得蛋白质在电场中的迁移率仅取决于相对分子质量,而与蛋白质的等电点、电荷性质无关。

通过比较标准蛋白质的迁移率和已知相对分子质量的蛋白质,可确定待测蛋白质的相对分子质量。

三、实验步骤1.准备试剂和器材:SDS-PAGE所需试剂包括丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、十二烷基硫酸钠、tris缓冲液、G250染料、乙醇等;器材包括电泳槽、制胶板、移液器、电泳仪、电源等。

2.制备标准蛋白样品:选择已知相对分子质量的标准蛋白样品,将其与G250染料混合,煮沸变性,冷却后作为标准蛋白样品。

3.制备样品:将待测蛋白质样品与G250染料混合,加入适量SDS-PAGE缓冲液,煮沸变性,冷却后作为待测样品。

4.制胶:将丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、tris缓冲液等混合,倒入制胶板中,插入样品梳子,静置凝固。

5.电泳:将凝胶放入电泳槽中,加入适量电泳液,将标准蛋白样品和待测样品分别加入对应的孔中。

打开电源,调整电流和电压,开始电泳。

6.染色和脱色:电泳结束后,将凝胶取出,用G250染料进行染色,然后进行脱色处理,以呈现清晰蛋白质条带。

7.相对分子质量测定:通过比较标准蛋白样品的迁移率和已知相对分子质量的蛋白样品,可确定待测蛋白质的相对分子质量。

四、结果分析通过本实验,我们成功地得到了SDS-PAGE凝胶电泳图谱,并测定了待测蛋白质的相对分子质量。

通过与标准蛋白样品的迁移率进行比较,发现待测蛋白质的相对分子质量约为50kDa。

此外,我们还发现不同浓度的待测蛋白质样品在凝胶电泳图谱上的条带位置也存在差异,表明它们具有不同的相对分子质量。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。

学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。

实验原理SDS-PAGE电泳法,即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法,。

1.在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。

2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),SDS是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质),使各种蛋白质—SDS 复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3. 当蛋白质的分子量在15000~200000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系,符合下列方程:1gMr =K―bm R式中:Mr为蛋白质的分子量;K为常数;b为斜率;mR为相对迁移率。

在条件一定时,b 和K均为常数。

若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

仪器、原料和试剂仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。

原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。

可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。

试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH8.9):取1mol/L盐酸48mL,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH6.7):取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

5 SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量

实验SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子量一、目的了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。

二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开,是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故,如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度,这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。

SDS是十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)的简称,它是一种阴离子去污剂,它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物,其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷,也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别,这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

本实验用目前常用的垂直平板电泳,样品的起点一致,便于比较。

三、试剂和器材(一)试剂1. 凝胶贮备液:丙烯酰胺(Acr)29.2g和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)0.8g重蒸水溶解后,定容至100ml,棕色试剂瓶4℃保存,30天内使用。

2. 分离胶缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl,pH8.8。

18.15 Tris(三羟甲基氨基甲烷),少许重蒸水溶解,用1M HCl调pH8.8,重蒸水定容至100ml,4℃保存。

3. 浓缩胶缓冲液:0.5mol/LHCl,pH6.8。

6gTris,少许重蒸水溶解,用1M HCl调pH6.8,重蒸水定容至100ml,4℃保存。

4. 10%SDS,室温保存。

5. 两类样品缓冲液:2倍还原缓冲液(2×reducing buffer)0.5mol/L HCl,pH6.8 2.5 ml甘油 2.0 ml质量浓度10%SDS 4.0ml质量浓度0.1%溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇 1.0 ml总体积10 ml6. 电极缓冲液,pH8.3。

Tris3g,甘氨酸14.4g,SDS1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml,4℃保存。

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量

SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量一、实验目的:1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。

2、学习并掌握SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。

二、实验原理:SDS-PAGE电泳法,即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法,。

1.在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。

2.在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),SDS 是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

三、仪器、原料和试剂1、仪器:垂直板型电泳槽;直流稳压电源;50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅,染色槽;烧杯;吸量管;常头滴管等。

2、原料:低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。

可配制成单一蛋白质标准液,也可配成混合蛋白质标准液。

3、试剂:(1)分离胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH8.9):取1mol/L盐酸48mL,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

(2)浓缩胶缓冲液(Tris-HCl缓冲液PH6.7):取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

(3)30%分离胶贮液:配制方法与连续体系相同,称丙烯酰胺(Acr)30g 及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g,溶于重蒸水中,最后定容至100ml,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃保存。

(4)10%浓缩胶贮液:称Acr 10g及Bis 0.5g,溶于重蒸水中,最后定容至100mL,过滤后置棕色试剂瓶中,4℃贮存。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

【实验原理】
SDS与蛋白质结合后,还引起蛋白质构象的改变。蛋白 质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中 的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复 合物的短轴长度都一样,而长轴则随蛋白质相对分子质量的 大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁 移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是椭圆棒 的长度,也就是蛋白质相对分子质量的函数。
【实验步骤】
一、安装垂直板型电泳装置
一、安装垂直板型电泳装置
将装好的电泳装置垂直放置,在长玻璃片下 端与硅胶框交界的缝隙内加入用电极缓冲溶液配 制的1%琼脂糖溶液,待其凝固后,即堵住凝胶 模板下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。
分离胶的配制
10%(ml)
H2O
10
30%丙烯酰胺
10
分离胶缓冲液(pH8.8)
【实验原理】
SDS是一种阴离子型去污剂,在蛋白质溶解液中加入 SDS和巯基乙醇后,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还 原;SDS能使蛋白质的非共价键(氢键、疏水键)打开,并 结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS 结合比为1.4 g SDS/g蛋白质),形成蛋白质-SDS复合物。由 于SDS带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,所带的负电 荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量,因而掩盖了不同种 类蛋白质间原有的电荷差异。
剥胶示意图
七、染色和脱色
倾出固定液,加入染色液。染色过夜。 染色完毕,倾出染色液,加入脱色液。数小时 换一次脱色液,直至背景清晰,约需一昼夜。
八、Mr的计算
量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mr:
蛋白质样品迁移距离(cm) 相对迁移率mr = 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。

催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。

化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。

在聚合过程中,TEMED 催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。

PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。

电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。

SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量

实验 6 SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的学习并掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法;掌握垂直板电泳的操作方法;运用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量及染色鉴定。

实验原理1、在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),使蛋白样品与SDS结合形成带负电荷的复合物,由于复合物分子量的不同,在电泳中反应出不同的迁移率。

根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线,推算出被测蛋白样品分子量的近似值。

2、在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带电荷多少等因素所造成的电泳迁移率有差别。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中,加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS),形成蛋白质-SDS复合物,这种复合物由于结合了大量的SDS,使蛋白质丧失了原有的电荷状态,形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异,此时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小,而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。

3、当蛋白质的分子量在15000~200000之间时,电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系,符合下列方程:㏒10Mr = -b·m R+ K(式中:Mr为蛋白质分子量,m R为相对迁移率,b为斜率,K为截距。

在条件一定时,b 和K均为常数。

)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图,可获得一条标准曲线。

未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

实验步骤1.装板:将垂直板型电泳装置内的板状凝胶模子取出,将玻璃片洗净、凉干、嵌入凹槽中,形成一个“夹心”凝胶腔,把装好的凝胶腔置于仰放的电极上槽。

将电泳槽、凝胶模子串成一体的垂直板型电泳装置,垂直放置在水平台面上。

(夹子离梳子底边约2mm)2. 制备分离胶:在烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。

项目分离胶的配制(10ml)30% 丙烯酰胺(ml) 3.4分离胶缓冲液,pH8.8(ml) 2.4H2O (ml) 4.110% 过硫酸铵(ml)0.1TEMED(μl)10凝胶液的灌注和聚合:将所配制的分离胶缓冲液沿着凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓注入,然后加乙醇。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

• 聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有两种: • (1)化学聚合:通常采用过硫酸铵(AP)为催化剂, 四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在TEMED 催化下,过硫酸铵可使丙烯酰胺单体的双键打开、 活化形成自由基丙烯酰胺,从而引发聚合作用。 • (2)光聚合:通常采用核黄素作催化剂,核黄素 在光照下光解成无色基,后者再被氧化成自由基 而引发聚合作用。光聚合的凝胶孔径较大,而且 随时间延长而逐渐变小,不太稳定。化学聚合的 凝胶孔径较小,且各次制备的重复性好。故一般 采用化学聚合。
四 电泳
• 将上槽接负极,下槽接正极,打开电源, 开始时将电流控制在15~20 mA,待样品进 入分离胶后,改为30~50 mA。待蓝色染 料迁移至下端约1~1.5 cm时,停止电泳, 约需1~2小时。
五 剥胶
取下凝胶模子,将凝胶片取出,滑入一白 瓷盘或大培养皿内,在染料区带的中心插 入细铜丝作为标志。
六 染色和脱色
染色 用一块胶,另一块胶用于转膜。 加入染色液,染色45分钟。 脱色 染色完毕,倾出染色液,加入脱色液。 20~30min换一次脱色液,2~3次后可初步 观察电泳条带,然后脱色过夜,直至背景 清晰。
七 Mr的计算
• 通常以相对迁移率(mr)来表示迁移率。相对迁 移率的计算方法如下:用直尺分别量出样品区带 中心及铜丝与凝胶顶端的距离,按下式计算: • 相对迁移率(mr) = 样品迁移距离(cm)/染料 迁移距离(cm)。 • 以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率 作图,得到标准曲线。根据待测样品的相对迁移 率,从标准曲线上查出其相对分子质量
牛血清 样品2 样品1 蛋白 样品1 marker 样品2 牛血清
第一组加样
第二组加样
第二块胶加样顺序与第一块胶相同

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

CH2=CH C=O NH2
CH2=CH
丙烯酰胺
C=O NH CH2
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH C=O C=O C=O NH2 NH NH2 CH2 NH C=O CH2-CH
NH C=O CH2=CH N, N’-甲叉 N’双丙烯酰胺
( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )m CH2-CH
当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时, 当蛋白质的分子量在17,000~165,000之间时, 蛋 17,000 之间时 白质-SDS复合物 复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系: 数呈线性关系:
lgMW = K - bm
C=O NH2 C=O NH2
化学性质稳定, PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变 机械强度好 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得 不同孔径的凝胶。 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。 浓度或Acr 的比例可以得到 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。 连续系统电 PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统 电 分为连续系统和不连续系统两大类 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同. 泳体系中 缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场 缓冲液 pH 值与凝胶中的相同 作用下,主要靠电荷和分子筛效应 不连续系统中带电 靠电荷和分子筛效应。 作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应, 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具 有浓缩效应, 有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告实验报告:SDS测定蛋白质相对分子质量一、实验目的:通过SDS-技术测定蛋白质的相对分子质量。

二、实验原理:SDS-是一种常用的蛋白质电泳分离技术。

在该技术中,蛋白质样品与SDS(十二烷基硫酸钠)和还原剂混合后,加热可以使蛋白质完全还原并且与SDS结合,形成具有负电荷的复合物。

这些复合物在电场中按照其分子质量大小被分离。

蛋白质样品在SDS-中首先经过堆胶,即在样品中添加聚丙烯酰胺凝胶,蛋白质被沿着凝胶的宽度扩散,形成连续的蛋白质稜。

然后,电泳阶段开始,电场通过凝胶,带动带电的蛋白质稜向阳极迁移。

三、实验步骤:1.准备SDS-电泳胶液:根据使用说明配制3种浓度的聚丙烯酰胺凝胶胶液,即5%堆胶胶液、12%分离胶液和4%扩散胶液。

2. 准备样品:取相应的蛋白质样品,如细胞裂解液,将其与试剂R (含有30%甘油和2%β-巯基乙醇酰胺)和Laemmli试剂混合,以加热破坏蛋白质的二级结构。

3.堆胶:将堆胶胶液慢慢注入电泳槽中,留出足够的空间来注入分离胶液。

4.加载样品:在样品孔中加入相应数量的样品、分子量标记和模板。

5.电泳:将电泳槽连接到电源,调节电压,使电流保持稳定。

首先进行堆胶阶段,然后切换到电泳阶段,直至蛋白质移动到凝胶底部。

6. 凝胶染色:取下凝胶,用凝胶染色剂对凝胶进行染色。

一般常用染色剂有银染和Coomassie蓝染。

四、实验结果:根据实验步骤描述的方法进行实验后,我们观察到在凝胶上出现了多条蛋白质条带,每条条带代表一个蛋白质。

条带的颜色越深,表示其含量越多。

通过与分子量标记的对照,可以确定蛋白质的相对分子质量。

五、实验讨论与分析:根据实验结果,我们可以推断蛋白质的相对分子质量。

相对分子质量可以通过标准曲线法来计算,即通过已知相对分子质量的蛋白质标准品的移动距离与其相对分子质量之间的线性关系来推断未知蛋白质的相对分子质量。

通过SDS-技术测定蛋白质相对分子质量具有许多优点:能够同时分离多个蛋白质;能够对蛋白质进行集中分析;精确测量蛋白质的相对分子质量以及群体分子质量等。

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量

2)浓缩胶的制备
配制5%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶缓 冲液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8) 1.25ml,10% SDS 0.05ml, 凝胶储备液0.8ml,10% 过硫酸铵25ul和TEMED 10ul。由 于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合,所以应立即混匀混合 液,用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内,灌满 后 小 心 插 入 梳 齿 , 避 免 混 入 气 泡 , 37℃ 烘 箱 下 聚 合 ( 约 30 min)。
CH2=CH N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
PAG机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,改变 Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电 泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场 作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电 颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具 有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者 佳。
8、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么?
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
SDS-PAGE测定蛋白质 相对分子质量
【目的要求】
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色 鉴定。
【实验原理】
电泳 带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现 象。在一定的电场强度下,分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分 子的大小、构型和带电量的大小。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过 硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此 凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的 双重作用。

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理

sds-page测定蛋白质相对分子质量原理
SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)是一种常用的蛋白质分析技术,用于测定蛋白质的相对分子质量。

SDS-PAGE原理基于以下几个关键步骤:
1. 蛋白样品的准备:将待测蛋白样品与SDS(十二烷基硫酸钠)混合,使蛋白质表面被负电荷包裹。

2. 样品加载和电泳过程:将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)中的孔洞中。

通常采用垂直电泳方式进行,将正电极和负电极连接至凝胶两端,通过电场使蛋白质向电泳方向迁移。

3. 分子分离:在电泳过程中,由于SDS的存在,样品中的蛋白质被完全解聚并带负电荷,使每个蛋白质分子的移动速率只与其相对分子质量成正比。

较小的蛋白质能够在凝胶中更快地迁移,较大的蛋白质则移动速率较慢。

4. 染色和可视化:电泳结束后,使用染色剂(如Coomassie蓝染色剂)将蛋白质染色,使其可见。

通过测量蛋白质在凝胶上的迁移距离,可以估计蛋白质的相对分子质量。

总结:SDS-PAGE利用SDS使蛋白质解聚并带负电荷,在电泳过程中按照相对分子质量的大小分离蛋白质,通过染色和测量蛋白质的迁移距离来估计其相对分子质量。

SDS—PAGE测定大蒜功能性蛋白的相对分子质量

SDS—PAGE测定大蒜功能性蛋白的相对分子质量
察大蒜 冻干粉中的蛋 白组分 , 对标准蛋 白进行直线 回归分析 , 确定大蒜冻干粉 中功能性蛋 白的相对 分子质量 。此法供试 品的处理方 便 、 量少 , 离胶 ( 用 分 交联 度 为 1 .% , 烯 酰 胺 总 浓 度 为 30 ) 0O 丙 . % 中能 较 清 晰 显 示 相 对 分 子 质 量 低 的 蛋 白条 带 , 一 种 测 定 相 对 分 子 是 质量低蛋 白较好 的方法 。
关键词 : 大蒜功能性蛋白;D — A E 相对分子质量; SS P G ; 膜分离; 超氧化物歧化酶( O ) S D
M oe u a eg tDee m i a in o lc l r W i h t r n to fFunci n lPr t i n Ga l DS —PAGE to a o en i ri by S c
(D S S—P G )m to .S p rt ngl t ihr cya iecn et t n 1 . % T 3 O C)w s sfl e o r A E ehd e aa o e a hg e rlm d o cnr i (0 0 i a ao , .% a ue t df a um h o
P ENG j —qa i in,XU Ku n a
( ol eo h m s yadC e cl n ier g C nrl ot nvr t,H n nC agh 10 3 hn ) C l g f e i r n h mi gn ei , et uhU i s y u a hn sa 0 8 ,C ia e C t aE n aS ei 4
21 年 3 0 1 9卷第 l 4期
广 州化 工
・9・ 9
S S—P G D A E测定大蒜 功能性蛋 白的相对 分子质量 木

实验 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量20页文档

实验 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量20页文档
实验 SDS-PAGE测定蛋白质相对分子 质量

6、黄金时代是在我们的前面,而不在 我们的 后面。

7、心急吃不了热汤圆。

8、你可以很有个性,但某些时候请收 敛。

9、只为成功找方法,不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。

10、只要下定决心克服恐惧,便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为,请 记住, 除了在 脑海中 ,恐惧 无处藏 身。-- 戴尔. 卡耐基 。
SDS-PAGE测定蛋白质 相对分子质量
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液,SDS是一种很强的阴离子表面活性剂, 它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
7、 结果处理 量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区 带中心与加样端的距离(cm),按下式计算相对迁移率mR:
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
【思考题】
1、在上样缓冲液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴 酚兰的作用分别是什么?
2、在SDS-PAGE中,分离胶中的TEMED和AP的 作用是什么?
当蛋白-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对 数呈线性关系:
lgMW = K - bm
将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE 中的电泳迁 移率对分子量的对数作图,即可得到一条标准曲线。 只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁 移率,就能根据标准曲线求得其分子量。

SDS-PAGE法测定蒜酶相对分子质量及含量

SDS-PAGE法测定蒜酶相对分子质量及含量

SDS-PAGE法测定蒜酶相对分子质量及含量李心雨;朱丽;李新霞【摘要】Objective The relative molecular mass and content of alliinase were determined by reducing SDS-polyacrylamide gel(SDS-PAGE)method.Methods The gel electrophoresis conditions for the deter-mination of garlic enzyme were determined.The gel of separation was 12%,the gel of concentration was 5%,the initial voltage was 80 V,and the separation gel was adjusted to 100 V.The alliinase in the extrac-ted garlic and garlic sample was determined.Results The SDS-PAGE method was used to determine the enzyme content and relative molecular mass of garlic with phosphate buffer solution as the solvent and the concentration of alliinase was 27.2 mg/mL.The average relative molecular mass of alliinase was 50.84 KDa,The relative content of alliinase in the total protein band of the enzyme test sample reached 52.39%.garlic was used as the sample,the relative content of garlic enzyme in the total protein band reached 6.28%.Conclusion The SDS-PAGE method was used to determine the alliinase content and molecular weight.The method was simple,and the result was accurate and reliable.%目的采用还原型 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法测定蒜酶的相对分子质量及含量.方法建立测定蒜酶的凝胶电泳条件:分离胶 12%,浓缩胶 5%,初始电压 80 V,进入分离胶时电压调至 100 V,测定经提取纯化后的蒜酶和大蒜样品中蒜酶的分子质量及含量.结果通过 SDS-PAGE法确定以磷酸盐缓冲液为溶剂,蒜酶供试品浓度 27.2 mg/mL 进行蒜酶含量和相对分子质量测定;蒜酶供试品中蒜酶平均相对分子质量50.84 KDa,蒜酶供试品中蒜酶在总蛋白条带中平均相对含量为 52.39%,大蒜中蒜酶在总蛋白条带中平均相对含量为 6.28%.结论 SDS-PAGE法测定蒜酶含量及其相对分子质量,方法简便易行、结果准确可靠.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2018(041)006【总页数】5页(P751-755)【关键词】蒜酶;大蒜;SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)法【作者】李心雨;朱丽;李新霞【作者单位】新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830011;新疆师范大学化学化工学院,乌鲁木齐 830054;新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830011;新疆医科大学中心实验室,乌鲁木齐 830011【正文语种】中文【中图分类】R914大蒜(Allium sativumL.)为百合科葱属植物蒜的地下鳞茎,作为药食两用植物,已有数千年的历史[1-3],大蒜具有抗菌、保肝、降血脂、降血压、抗氧化及抗肿瘤等多种药理活性作用[4-5]。

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3 .澳 大 利 亚 迪 肯 大 学 生命 与 环 境 科 学 学 院 化 学 与生 物技 术 中 心 , 澳大利 亚 吉朗 V I C 3 2 1 6 )
摘 要 :蒜 头果蛋 白( m a l a n i n ) 是从 广 西 、 云 南特 有植 物 蒜 头 果 中分 离、 纯化 出的 一种 新 的 、 具 有抗
h t t p: / /x b. y nn i . e d u .C B
S D S—P A GE 电 泳 法 测 定 蒜 头 果 蛋 白 的 相 对 分 子 质 量
袁 燕 , 王红斌 , B AR R 0 W பைடு நூலகம்C o l i n J , 杨 文荣
( 1 .云南 民族大学 民族 药资源化学 国家 民委 一 教育部重 点实验室 , 云南 昆明 6 5 0 5 0 0 ; 2 .云南 民族 大学 云南省生物高分子功 能材 料工程技术研究 中心 , 云南 昆明 6 5 0 5  ̄ ) ;
云 南 民族 大 学 学 报 : 自然 科 学 版 , 2 0 1 5 , 2 4 ( 2 ) : 1 2 3—1 2 5
d o i : 1 2 . 3 9 6 9 / j . i s s n . 1 6 7 2— 8 5 1 3 . 2 0 1 5 . 0 2 . 0 1 0
CN 5 3 —1 1 9 2 /N I SS N 1 67 2—8 5l 3
( B i o m公 司 ) ; B一疏 基 乙醇 、 N, N, N , N 一四 甲基 乙
免疫 毒素 治疗 癌症 的应 用前 景 .
聚丙 烯 酰 胺 凝 胶 电泳 ( p o l y a c r y l a mi d e g e l e l e c . t r o p h o r e s i s , P A G E ) 是 以聚丙 烯 酰胺 凝胶 作 为支 持 介 质 的一种 常用 电泳 技术 , 由于其 机械 强度 好 , 透 明有 弹性 , 有较 好 的化 学稳定 性 和热稳 定 性 , 没有 吸 附作 用和 电渗 作用 , 可 通 过 改 变 丙烯 酰胺 的浓 度 和 交 联 度而 制成 不 同孔 径 的凝 胶 等 优 点 , 故 被 广 泛 应 用 于
相 对分 子 质 量 , 而 与 它 的形 状 及 所 带 电荷 无 关 . 因
此, 要 测定某 一 蛋 白质分 子 的相对 分 子质量 , 只需 比 较 该蛋 白质 与 其 他 已 知相 对 分 = 质 量 的 蛋 白质 在 S D S— P A G E凝胶 电泳 上 的迁 移 率 即 可 . 本文 通 过变性 S D S—P A G E凝 胶 电泳 , 以相 对 分 子 质 量 的
1 9 6 7年 S h a p i r o等 发 现 , 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 系
统 中加 入 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ( s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ,
树科 ( O l a c a c e a e ) 蒜 头果属 , 是 中国特有 单种 属稀有
1 实 验 材 料 与 方 法
1 . 1 实验 材料
7 . 7 1×1 0一m o l ・ L
, 说 明 ma l a n i n具有 非 常强 的
抗 肿 瘤 活性 , 可作 为抗 癌药 物 的先 导分子 , 具 有用 于
丙 烯 酰 胺/ 亚 甲基 双丙 烯 酰 胺 ( P h a r m a c i a公 司) ; 十二 烷 基 硫 基 钠 ( S D S ) 、 考 马 斯 亮 蓝 G一2 5 0
铵沉淀 、 疏 水 色谱 层析 等方 法从 广西 、 云南 特 有植 物
蒜 头果 ( ma l a n i a o l e i f e r a ) 中分 离 纯 化 出 一 种 新 的 、 具 有 抗肿 瘤 活性 的糖 蛋 白 J . 体 外 抗 肿 瘤 活 性 表 明 m a l a n i n具 有 明 显 抑 制 人 宫 颈 癌 ( H e L a ) 、 人 白血 病 ( K 5 6 2 )、 人乳腺 癌( MC F一7 ) 和神经瘤 ( P C一1 2 )
对 数 为纵 坐 标 , 迁 移 率 为 横 坐 标 作 回归 方 程 , 计 算
ma l a n i n的相 对分 子 量 , 为 ma l a n i n的基 本 理 化 性 质 提 供参 考数 据 .
等肿 瘤细 胞体 外 增 殖 的能 力 , 其半致死浓度 I c 。 值
分别 为 1 . 5 4× 1 0 。 、 1 . 5 8×1 0~、 1 . 1 2×1 0 和
关键 词 : 蒜 头果蛋 白 ; S D S—P A G E; 相 对分子 质 量 中图分 类号 : Q 5 1 6 文献标 志码 : A 文章编 号 : 1 6 7 2—8 5 1 3 ( 2 0 1 5 ) 0 2—0 1 2 3— 0 3
蒜 头果 ( m a l a n i a o l e i f e r a c h u n e t S . L e e ) 属 于铁青
植物 , 国家二 级保 护树种 _ 2 J , 广 西重 点保 护野 生植 物 ,
S D S ) 后, 则 蛋 白质 分 子 的电泳 迁 移 率 主要 取 决 于其
仅分 布于云南东南部和广西西部 的狭窄地带 j .
蒜头 果蛋 白 ( m a l a n i n ) 是通过粉碎 、 抽提 、 硫 酸
肿 瘤 活性 的植 物蛋 白质 . 采 用 变性 十二 烷 基 硫 酸 钠 一聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 泳 ( S D S—P A G E) 测 定
m a l a n i n的相 对分 子 质 量. 结 果表 明 , m a l a n i n是 一种 双链 蛋 白质 , 由 A、 B 2条肽 链 通过 二 硫键 连 接 而成 , 其 相对 分子 质量 约 为 6 5 . 9 4×1 0 ’ . 方 法具有 简单 、 快速 、 直观 的特 点.
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