金丝桃苷对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用研究

▲基金项目：广西自然科学基金（桂科自0991122）通信作者：孔晓龙，E-mail ：kxll92@yahoo．com．cn 金丝桃苷对过氧化氢损伤心肌细胞的保护作用研究▲梁凯孔晓龙覃振明莫凤珍汪永玲黄绍德郭梅红（广西医科大学药学院药理学教研室，南宁市530021；E-mail ：274514343@qq．com ）【摘要】目的研究金丝桃苷对过氧化氢(H 2O 2)损伤心肌细胞的保护作用。

方法以原代培养的乳鼠心肌细胞建立H 2O 2损伤模型。

实验分为7组:正常对照组、模型对照组、二甲基亚砜组(1%二甲基亚砜)、维拉帕米组(25μmol /L )、金丝桃低剂量组(0．6μmol /L )、金丝桃中剂量组(6μmol /L )、金丝桃高剂量组(60μmol /L )。

测定各组心肌细胞一氧化氮合酶(NOS )、Na +-K +-ATP 酶、Ca 2+-Mg 2+-ATP 酶、肌酸激酶同工酶MB (CK-MB )活性变化及心肌细胞肌钙蛋白(cTnI )的含量。

结果金丝桃苷中、高剂量组结构型一氧化氮合酶(cNOS )、总一氧化氮合酶(tNOS )、Na +-K +-ATP 酶、Ca 2+-Mg 2+-ATP 酶活性较模型对照组显著增加(P ＜0．01)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS )活性较模型对照组降低(P ＜0．05);金丝桃苷低剂量组、中剂量组、高剂量组上清液的CK-MB 、cTnI 含量较模型对照组低(P ＜0．01)。

结论金丝桃苷具有抗心肌细胞过氧化氢损伤作用，这可能与其提高心肌细胞膜的Na +-K +-ATP 酶和Ca 2+-Mg 2+-ATP 酶活性，并调节不同亚型NOS 活性有关。

【关键词】金丝桃苷;心肌细胞;过氧化氢损伤;心肌保护【中图分类号】R 542．2;R 96【文献标识码】A【文章编号】0253-4304(2012)12-1600-04Protective Effects of Hyperin on the Hydrogen Peroxide-Injured Myocardial CellsLIANG Kai ，KONG Xiao-long ，QIN Zhen-ming ，MO Feng-zhen ，WANG Yong-ling ，HUANG Shao-de ，GUO Mei-hong (Department of Pharmacology ，Pharmaceutical College ，Guangxi Medical University ，Nanning 530021，China )【Abstract 】Objective To study the protective effects of hyperoside (Hyp )on the hydrogen peroxide-injured(H 2O 2-injured )myocardial cells．MethodsA H 2O 2-injured model of the primary cultrued neonatal rat cell wasestablished．There were seven experimental groups :normal control group ，model control group ，DMSO group (1%DMSO )，verapamil group (25μmol /L )，low-，medium-and high-dosage Hyp groups (0．6，6，60μmol /L )．The activities of NOS ，Na +-K +-ATPase ，Ca 2+-Mg 2+-ATPase ，creatine kinase isoenzyme MB (CK-MB )and content of myocardial troponin I (cTnI )in myocardial cells of each group were detected．ResultsCompared with model control group ，the activities ofcNOS ，tNOS ，Na +-K +-ATPase ，Ca 2+-Mg 2+-ATPase increased significantly (P ＜0．01)and the activity of iNOS decreased in medium-and high dose Hyp groups (P ＜0．05)．The contents of CK-MB ，cTnI from the supernatant in low-，medium-，high-dose groups were lower than those of model control group (P ＜0．01)．Conclusion Hyp has protectiveeffect on the H 2O 2-injured myocardial cells ，its mechanism may be related to increasing the activities of Na +-K +-ATPase ，Ca 2+-Mg 2+-ATPase and regulating the activities of different subtypes of NOS．【Key words 】Hyperoside ;Myocardial cell ;Hydrogen peroxide injury ;Myocardial protection 金丝桃苷（hyperoside ，Hyp ），又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，属于黄酮醇苷类化合物，具有多种生理活性，可以抗炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化等作用［1］。

金丝桃苷对心肌细胞没有毒性作用，并且在一定浓度范围内，可以降低过氧化氢（H 2O 2）损伤心肌细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase ，LDH ）活性，呈现心肌细胞保护作用［2］。

本实验通过原代培养SD 大鼠乳鼠心肌细胞，建立心肌细胞氧化应激损伤模型，研究金丝桃苷对心肌细胞相关生化指标的影响，旨在探讨金丝桃苷对H 2O 2损伤心肌细胞的保护作用。

1材料与方法1．1实验动物出生1 3d SD 大鼠乳鼠96只，雌雄各半，体重5 8g ，由广西医科大学实验动物中心提供（生产许可证：SCXK 桂2009-0002）。

1．2主要试剂贯叶金丝桃苷购自南京郎泽植物提取有限公司，纯度≥98%，批号：111521-200303；胎牛血清购自Hyclone公司，批号：NWK0489；DMEM培养基购自GIBCO公司，批号：NXH06087；二甲基亚砜（DMSO）、含乙二胺四乙酸（EDTA）的0．25%胰酶均购自Solarbio公司；一氧化氮合酶（NOS）试剂盒（分型）、ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号分别为20110101、20110422；肌钙蛋白（cTnI）酶联免疫吸附测试试剂盒、肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶联免疫吸附测试试剂盒购自武汉优尔生科技股份有限公司，批号分别为：L110428081、L110428082；其他试剂均为市售分析纯。

1．3主要仪器311型CO2培养箱（Thermo Forma 公司）；XD-111型CKX41相差显微镜（OLUMPUS公司）；MK3型Model450自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1．4方法1．4．1贯叶金丝桃苷含药培养液的配制：将贯叶金丝桃苷与含1%DMSO的培养液配成10g/L的母液。

经0．45μm的微孔滤膜，再经0．22μm徽孔滤膜过滤除菌后，置4ħ冰箱保存备用。

实验时用含1% DMSO的培养液将贯叶金丝桃苷母液稀释成所需浓度。

1．4．2心肌细胞的分离与培养：取出生1 3d的SD大鼠乳鼠，置超净工作台中。

开胸取心，去除心房及心外膜的结缔组织，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2遍，将心室肌剪成1 2mm3大小的组织块；加入适量0．125%胰酶，用吸管轻轻吹打，至上清液出现浑浊，弃去上清液，重复消化至组织块消化完全，200目细胞筛过滤，收集细胞悬液。

加入含10%胎牛血清的DMEM 培养液终止消化，PBS洗涤。

1000r/min离心2次，每次10min。

弃上清，沉淀物中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，吹打成均匀的单细胞悬液，置于培养箱（37ħ，95%O2，5%CO2）中培养2h，差速贴壁后除去贴壁细胞，调整细胞浓度为1ˑ105 3ˑ105/ml，接种于96孔板，每孔190μl，前48h加入5-溴脱氧尿嘧啶，使其终浓度为100μmol/L，以抑制非心肌细胞的生长。

置于CO2培养箱中孵育，每24h更换培养液。

待培养3 4d，观察到心肌细胞己长满视野95%以上且成片搏动时，用于实验［1］。

1．4．3分组与给药：选择生长良好、搏动规律的心肌细胞，随机分为7组：（1）正常对照组；（2）模型对照组；（3）DMSO组（1%DMSO）；（4）维拉帕米组（25μmol/L）；（5）高剂量组（金丝桃苷60μmol/L）；（6）中剂量组（金丝桃苷6μmol/L）；（7）低剂量组（金丝桃苷0．6μmol/L），每组设6个复孔。

（4） （7）组按上述方法加入维拉帕米及金丝桃苷2h后，除正常组外，其余各组均加入终浓度为600μmol/L的H2O2损伤，继续培养24h用于以下实验。

1．4．4金丝桃苷对心肌细胞NOS活力的影响：按1．4．2方法处理细胞后，每孔吸取40μl上清液，按NOS试剂盒要求测定各型NOS的活力。

1．4．5金丝桃苷对心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力的影响：按1．4．2方法处理细胞后，将细胞消化，离心，弃上清，留下层细胞，每管加入0．2ml生理盐水制备成1ˑ106 1ˑ107/ml的细胞悬液。

反复冻融3次破碎细胞。

按照试剂盒要求，测定Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力，考马斯亮蓝法测定总蛋白。

1．4．6金丝桃苷对心肌细胞CK-MB、cTnI含量的影响：按1．4．2方法处理细胞后，按酶联免疫吸附测试试剂盒CK-MB、cTnI要求测定CK-MB、cTnI含量。

1．5统计学分析采用SPSS13．0软件进行统计分析，计量资料以xʃs表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果2．1金丝桃苷对H2O2损伤心肌细胞NOS活性的影响各组结构型一氧化氮合酶（cNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、总一氧化氮合酶（tNOS）活力比较，差异有统计学意义（P＜0．05）；与正常对照组比较，模型对照组cNOS活力明显降低（P＜0．05），而iNOS、tNOS活力明显增加（P＜0．05）；DMSO组和金丝桃苷低剂量组cNOS、iNOS、tNOS活力与模型对照组相比，差异无统计学意义（P＞0．05）；与模型对照组比较，高剂量组、中剂量组及维拉帕米组则cNOS、tNOS 活性显著性增加，iNOS活性显著性降低（P＜0．05），且呈一定的剂量依赖性。