尼可地尔后处理对心肌缺血-再灌注损伤大鼠心肌的保护作用

［
文章编号］　１６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０６－１１６０－０４［收稿日期］　２０１２－０６－
１３［基金项目］　吉林省卫生厅科研基金资助课题（２００９ｚ００４
）［作者简介］　李悦玮（１９７５－），女，吉林省长春市人，讲师，在读医学博士，主要从事心血管疾病的基础和临床研究。

［通信作者］　张科强（Ｔｅｌ：０４３１－８８７９６７５４，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｋｅｑｉａｎｇ
＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ）尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤大鼠心肌的保护作用
李悦玮１，张文琪２，孙景辉１，张科强３
（１．吉林大学第一医院儿内五科，吉林长春１３００２１；２．吉林大学中日联谊医院心内科，吉林长春１３００３３；
３．吉林大学第二医院医务部，吉林长春１３００４１
）［摘　要］　目的：观察尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤（ＭＩＲＩ）大鼠心肌的保护作用，并探讨其作用机制。

方法：２６只ＳＤ大鼠随机分为对照组（８只）、盐酸异丙肾上腺素（ＩＳＯ）组（８只）和尼可地尔后处理组
（１０只）。

对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水，ＩＳＯ组大鼠腹腔注射ＩＳＯ　５ｍｇ·ｋｇ－１
，每隔２４ｈ重复注射１次，连续注射３ｄ；尼可地尔后处理组于注射ＩＳＯ　１ｈ后尾静脉注射尼可地尔（１ｍｇ·ｋｇ－１
）
，每日１次，连续３ｄ。

于第３次注射ＩＳＯ后２４ｈ断尾取血后处死，检测各组大鼠血清中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）、磷酸激酸（ＣＫ）活性；常规ＨＥ染色观察各组大鼠心肌组织形态学表现；免疫组织化学染色法检测Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白的表达；ＴＵＮＥＬ法检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况。

结果：尼可地尔后处理组与对照组比较血清ＬＤＨ和ＣＫ活性差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但２组均低于ＩＳＯ组（Ｐ＜０．０５）。

ＨＥ染色，ＩＳＯ组大鼠局部心肌组织变性坏死，伴有炎细胞浸润；尼可地尔后处理组大鼠坏死心肌细胞明显减少，炎症反应轻微；对照组大鼠心肌无异常表现。

免疫组织化学染色，ＩＳＯ组大鼠大量心肌细胞胞浆表达Ｃａｓｐａｓｅ－３，对照组和尼可地尔后处理组大鼠Ｃａｓｐａｓｅ－３无表达。

尼可地尔后处理组细胞凋亡指数（ＡＩ）较ＩＳＯ组明显降低（Ｐ＜０．０１）。

结论：尼可地尔可减轻大鼠ＭＩＲＩ，其作用机制可能与抑制Ｃａｓｐ
ａｓｅ－３激活、减少细胞凋亡有关。

［关键词］　心肌缺血－再灌注损伤；尼可地尔；缺血后处理；药物后处理；细胞凋亡［中图分类号］　Ｒ５４２．２ ［
文献标志码］　ＡＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｏｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ　ｏｆｒａｔｓ　ｗｉｔｈ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ
ＬＩ　Ｙｕｅ－ｗｅｉ　１，ＺＨＡＮＧ　Ｗｅｎ－ｑｉ　２，ＳＵＮ　Ｊｉｎｇ－ｈｕｉ　１，ＺＨＡＮＧ　Ｋｅ－ｑｉａｎｇ
３
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ
ｃｈｕｎ　１３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ　Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００３３，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｄｍｉｎｉｓｉｔｒａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ
ｃｈｕｎ　１３００４１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｏｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｗｉｔｈｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ（ＭＩＲＩ）ｉｎ　ｒａｔｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ｄｉｓｃｕｓｓ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２６ＳＤ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（ｎ＝８），ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（ＩＳＯ）ｇｒｏｕｐ（ｎ＝８）ａｎｄ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　
ｇｒｏｕｐ（ｎ＝１０）．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ　
ｗｉｔｈ　ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ（５ｍｇ·ｋｇ－１
）ａｔ　ａｎ　ｉｎｔｅｒｖａｌ　ｏｆ　２４ｈｆｏｒ　３ｄ；ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ｏｎｌｙ　
ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ａｎ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓａｍｅ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｓａｌｉｎｅ；ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ　ｗｉｔｈ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ（１ｍｇ·ｋｇ－１
）１ｈａｆｔｅｒ　ＩＳＯ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｎｃｅ　ａ　ｄａｙ，ｌａｓｔｉｎｇ　ｆｏｒ　３ｄ．Ｔｈｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｋｉｌｌｅｄ　２４ｈａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＯ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ｃｒｅａｔｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ（ＣＫ）ａｎｄ　ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ；ｔｈｅ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｙ　ｒｏｕｔｉｎｅ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ；ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｐｒｏｔｅｉｎｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ０
６１１第３８卷　第６期
２０１２年１１月吉　林　大　学　学　报　（医　学　版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｊｉｌｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．６　
Ｎｏｖ．２０１２
ＴＵＮＥＬ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＣＫ　ａｎｄ　ＬＤＨ　ｂｅｔｗｅｅｎｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５），ｂｕｔ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＣＫ　ａｎｄ　ＬＤＨ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ　ＨＥ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄｌｏｃａｌ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ，ｂｕｔ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｎｏ　ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔＣａｓｐａｓｅ－３ｗａｓ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ　ｐｌａｓｍａ　ｉｎ　ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ；ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌａｎｄ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｅｘ（ＡＩ）ｉｎ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｃａｎ　ａｔｔｅｎｕａｔｅ　ＭＩＲＩ　ｏｆ　ｒａｔｓ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｐａｔｈｗａｙ　ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ；ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ；ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ；ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
缺血性心脏病一直是引起患者心力衰竭和死亡的主要原因［１］。

冠心病无论在发达国家还是发展中国家，已经成为严重危害人类健康和致死的主要疾病之一［２］。

尽管近年来血运重建技术（溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术和冠状动脉旁路移植术）已经取得了很大进展，但在缺血性心脏病再灌注治疗中，如何保护缺血心肌免于心肌缺血－再灌注损伤（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ，ＭＩＲＩ）一直是研究热点。

缺血后处理（ｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ＩＰＯ）和药物后处理因适于临床操作成为研究热点。

已有研究［３－４］表明：尼可地尔在临床上作为治疗心绞痛的药物，对缺血－再灌注心肌有保护作用。

但目前关于尼可地尔心肌ＭＩＲＩ的保护作用机制的研究较少。

本研究利用大鼠心肌缺血模型，在分子和细胞水平上观察尼可地尔药物后处理对缺血－再灌注大鼠心肌的保护作用。

１　材料与方法
１．１　动物、主要试剂及仪器　ＳＤ大鼠２６只，雄性，体质量１８０～２００ｇ，由吉林大学基础医学院实验动物中心饲养（许可证号：ＳＣＸＫ－吉２００８－０００５）；尼可地尔购自Ｓｉｇｍａ公司，盐酸异丙肾上腺素（ＩＳＯ）购自上海禾丰制药厂，乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）试剂盒、磷酸激酸（ＣＫ）试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Ｃａｓｐａｓｅ－３购自美国ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司，ＴＵＮＥＬ法检测试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司；ＧＦ－Ｄ　２００型半自动生化分析仪为山东高密彩虹分析仪器公司产品。

１．２　实验分组及模型制备　将２６只ＳＤ大鼠随机分为３组：对照组８只，盐酸异丙肾上腺素（ＩＳＯ）组８只，尼可地尔后处理组１０只。

对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水；ＩＳＯ组大鼠给予腹腔注射ＩＳＯ　５ｍｇ·ｋｇ－１，每隔２４ｈ重复注射１次，
连续注射３ｄ。

尼可地尔后处理组大鼠于注射ＩＳＯ１ｈ后尾静脉注射（１ｍｇ·ｋｇ－１），每日１次，连续３ｄ。

ＩＳＯ组和尼可地尔后处理组于第３次注射ＩＳＯ后２４ｈ处死，同时处死对照组大鼠。

１．３　大鼠血清样本的制备　分别于处死大鼠前穿刺尾静脉或断尾获取外周血１ｍＬ，３　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心５ｍｉｎ，取上清，再于高速低温离心机１３　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，取上清，－２０℃冻存备用。

ＬＤＨ和ＣＫ活性检测按试剂盒说明书操作。

１．４　大鼠心脏病理组织学检测标本的制备　第３次注射后２４ｈ处死各组大鼠，消毒后取出大鼠心脏，放入ＰＢＳ中冲洗，１０％甲醛溶液固定；常规石蜡包埋，４μｍ连续切片，行ＨＥ和免疫组织化学染色（ＳＰ法）。

ＴＵＮＥＬ法具体步骤按照试剂盒说明书操作。

标记前用ＤＮＡ酶处理切片作为阳性对照，用标记液代替ＴＵＮＥＬ反应液作为阴性对照。

在４００倍光镜下观察心肌细胞凋亡情况，随机选取１０个视野，以心肌细胞凋亡数占总心肌细胞数的百分比计算心肌细胞凋亡指数（ＡＩ）。

１．５　ＡＩ结果判定标准　Ｃａｓｐａｓｅ－３以心肌细胞胞浆出现棕黄色颗粒，其着色强度高于背景染色者判定为阳性，否则为阴性。

ＴＵＮＥＬ法以胞核出现棕黄色颗粒为阳性，否则为阴性。

结果判定由２名观察者独立完成，若判定结果不一致，则２人在共览显微镜下共同观察判定。

１．６　统计学分析　采用ＳＰＳＳ　１１．０软件处理数据。

各组大鼠血清ＣＫ和ＬＤＨ活性以ｘ±ｓ表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

２　结　果
２．１　各组大鼠血清ＣＫ和ＬＤＨ活性　ＬＤＨ检测，ＩＳＯ组大鼠血清ＬＤＨ活性高于对照组（Ｐ＜０．０５），尼可地尔后处理组血清ＬＤＨ活性明显低
１
６
１
１
李悦玮，等．　尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤大鼠心肌的保护作用
于ＩＳＯ组（Ｐ＜０．０５）；ＣＫ检测，ＩＳＯ组大鼠血清ＣＫ活性高于对照组（Ｐ＜０．０５），尼可地尔后处理组明显低于ＩＳＯ组（Ｐ＜０．０５）。

见表１。

表１　各组大鼠血清ＣＫ和ＬＤＨ活性
Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｓｅｒｕｍ　ＣＫ　ａｎｄ　ＬＤＨ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ（ｘ±ｓ）
Ｇｒｏｕｐ　ｎ
ＣＫ
［λＢ／（ｍＵ·Ｌ－１）］
ＬＤＨ
［λＢ／（Ｕ·Ｌ－１）］
Ｃｏｎｔｒｏｌ　８　４４．７１±３．８３　４　２９７．７０±５９９．９５ＩＳＯ　８　６１．２６±７．６９＊６　９９２．３７±８２８．５８＊Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ
　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ
１０　４７．１２±５．０９△４　７００．２３±８１２．６７△ ＊Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；△Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ　ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ．
２．２　各组大鼠心肌组织形态学表现　ＨＥ染色，ＩＳＯ组大鼠心内膜内皮不完整，在心肌细胞间可见小血管扩张及少量红细胞渗出，部分心肌细胞肿胀、变性坏死，心肌组织内血管扩张、炎细胞渗出、浸润和其包绕血管形成的血管周围炎；尼可地尔后处理组大鼠心肌横纹清晰，核居中，无明显组织坏死、血管扩张和炎细胞浸润轻微。

见图１（插页四）。

２．３　各组大鼠心肌细胞凋亡情况　ＴＵＮＥＬ法检测，ＩＳＯ组大鼠可见大量的凋亡细胞，凋亡阳性的细胞核呈棕黄色。

尼可地尔后处理组大鼠凋亡细胞明显减少。

对照组、ＩＳＯ组、尼可地尔后处理组大鼠的ＡＩ分别为（０．６６±０．３５）％、（２２．３８±３．６５）％和（７．５７±１．８４）％。

尼可地尔后处理组的ＡＩ明显低于ＩＳＯ组（Ｐ＜０．０１）。

见图２（插页四）。

２．４　各组大鼠心肌组织中Ｃａｓｐａｓｅ－３的表达　对照组和尼可地尔后处理组大鼠心肌细胞中无阳性物质；ＩＳＯ组注射ＩＳＯ后３ｄ大鼠心肌细胞胞浆可见大量棕黄色颗粒。

见图３（插页四）。

３　讨　论
２００３年，Ｚｈａｏ等［５］首先提出ＩＰＯ的概念，即于缺血后持续再灌注前给予多次短暂重复缺血－再灌注，能提高心肌对缺血－再灌注损伤的耐受性。

为缺血性心脏病的治疗开辟了新途径。

通常情况下，心肌细胞线粒体钾通道处于关闭状态，但能被钾离子开放剂激活，参与保护缺血后的心肌［６］。

钾离子通道开放剂通过促进线粒体基质中钾的摄入，形成稳定的钾离子流，从而抑制钙超载［７］。

钙超载可引起线粒体通透性转换孔开放，许多大分子非选择性地由胞浆向线粒体扩散，导致线粒体电位破坏和功能障碍，使能量代谢发生障碍，引起心肌细胞死亡。

在缺血预处理的研究［８－１０］中，钾离子通道开放剂尼可地尔能够保护缺血性损伤的心肌。

尼可地尔通过开放心肌细胞线粒体钾离子通道，保护线粒体，减轻ＭＩＲＩ，减少心肌细胞坏死或凋亡，从而保护心肌。

本研究以保护线粒体为切入点，旨在为临床心肌缺血缺氧的对症治疗提供新思路。

本实验利用ＩＳＯ腹腔注射制作心肌缺血性损伤模型，并观察尼可地尔后处理对缺血心肌的保护作用。

大剂量ＩＳＯ导致心脏β１受体过度兴奋，心率加快，心肌收缩力增加，心肌耗氧增加；β２受体兴奋，扩张外周血管，降低外周血管阻力，血压降低，特别是舒张压降低，减少冠状动脉供血，结果使心肌缺血缺氧［１０－１２］。

血清酶学变化是心肌损害程度的主要标志，本研究结果显示：连续大剂量给予ＩＳＯ后大鼠血清ＣＫ、ＬＤＨ活性增高，表明该方法能够完全模拟心肌损伤的病理生理过程，复制心肌损伤的模型。

尼可地尔后处理能够减轻ＩＳＯ对心肌的缺血性损伤。

心肌病理学检查是心肌缺血损害程度的直接证据。

大剂量ＩＳＯ注射后，ＨＥ染色显示：心肌细胞发生变性坏死，伴有大量炎细胞浸润；免疫组织化学染色见大量心肌细胞表达Ｃａｓｐａｓｅ－３；ＴＵＮＥＬ染色见大量心肌细胞凋亡。

尼可地尔后处理组大鼠ＨＥ染色示心肌细胞无明显变性、坏死，炎细胞浸润轻微；Ｃａｓｐａｓｅ－３免疫组织化学染色显示：少量大鼠心肌细胞表达Ｃａｓｐａｓｅ－３；并见少量凋亡的心肌细胞。

这些结果说明心肌缺血影响线粒体功能，导致细胞能量代谢障碍，激活Ｃａｓｐａｓｅ－３细胞凋亡途径，引起心肌细胞发生不可逆性损伤甚至坏死。

［参考文献］
［１］Ｌｌｏｙｄ－Ｊｏｎｅｓ　Ｄ，Ａｄａｍｓ　ＲＪ，Ｂｒｏｗｎ　ＴＭ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅａｎｄ　ｓｔｒｏｋｅ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ－－２０１０ｕｐｄａｔｅ：Ａ　ｒｅｐｏｒｔ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｅａｒｔ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１０，１２１（７）：９４８－９５４．
［２］况志彬，何春蓉，周　艳，等．早发冠心病血运重建后临床危险因素及其与预后的相关性分析［Ｊ］．重庆医科大学学报，２０１２，３９（７）：８１７－８２０．
［３］Ｈｓｕ　ＣＹ，Ｆａｎｇ　ＳＹ，Ｃｈｅｎ　ＹＺ，ｅｔ　ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ＫＡＴＰ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｄｕｒｉｎｇ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－
ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ａｃｉｄｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｓｈｏｃｋ，２０１２，３７（６）：６５３－６５８．［４］Ｈｏｒｉｎａｋａ　Ｓ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｉｔｓｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｄｒｕｇｓ，２０１１，７１（９）：１１０５－１１１９．
［５］Ｚｈａｏ　ＺＱ，Ｃｏｒｖｅｒａ　ＪＳ，Ｈａｌｋｏｓ　ＭＥ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ
２
６
１
１吉林大学学报（医学版）　第３８卷　第６期　２０１２年１１月
ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｎｊｕｒｙ　ｂｙ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｄｕｒｉｎｇｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｈｅａｒｔ　Ｃｉｒｃ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００３，２８５（２）：Ｈ５７９．［６］Ｇａｒｌｉｄ　ＫＤ，Ｐａｕｃｅｋ　Ｐ，Ｙａｒｏｖ－Ｙａｒｏｖｏｙ　Ｖ，ｅ
ｔ　ａｌ．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉａｚｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＡＴＰ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｃａｒｄｉｏｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，１９９７，８１（６）：１０７２－
１０８２．［７］Ｗｕ　ＬＰ，Ｓｈｅｎ　Ｆ，Ｌｉｎ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏｐ
ｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｆｅｒｒｅｄｂｙ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＡＴＰ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｋ＋ｃｈａｎｎｅｌ　ｉｓｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｐ
ｏｒｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｌｅｔｔ，２００６，４０２（１／２）：１８４－１８９．［８］Ａｈｍｅｄ　ＬＡ，Ｓａｌｅｍ　ＨＡ，Ａｔｔｉａ　ＡＳ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｉｃａｌｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　
ｗｉｔｈ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ａｎｄ　ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｓｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊｕｒｙ　ｉｎ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　ＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２０１１，６６３（１－３）：５１－
５８．［９］Ｒａｖｅａｕｄ　Ｓ，Ｖｅｒｄｅｔｔｉ　Ｊ，Ｆａｕｒｙ　
Ｇ．Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｒｏｔｅｃｔｓ　ＡＴＰ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ　ｏｆ　ａｇｉｎｇ　ｒａｔｓ［Ｊ］．
Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ
，２００９，１０（５）：５３７－５４７．［１０］Ｒｏｎａ　Ｇ．Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ　ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ［
Ｊ］．Ｊ　Ｍｏｌ　ＣｅｌｌＣａｒｄｉｏｌ，１９８５，１７（４）：２９１－
３００．［１１］Ｉｌｉｏｄｒｏｍｉｔｉｓ　ＥＫ，Ａｇｇ
ｅｌｉ　ＩＫ，Ｇａｉｔａｎａｋｉ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．ＣａｔｈｅｒｉｎｅＧａｉｔａｎａｋｉｐ３８－ＭＡＰＫ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｏｓｔｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｂｙ　ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｉｎ　ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｅｕｒ　ＪＰｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，５７９（１－３）：２８９－
２９７．［１２］付双全．人参的心血管作用药理学研究进展［Ｊ］．长春中医
药大学学报，２０１２，２８（２）：３５７－
３５８．以突眼为首发症状的甲状腺功能亢进伴角膜溃疡１例报告
吉林大学第一医院内分泌科（吉林长春１３００２１
）　张然然，谢晓娜，朱栗文，高　影１　临床资料
患者，女性，３２岁。

因眼睑浮肿、眼球突出２年，视力下降７ｄ入院。

患者２年前无明显诱因出现眼睑浮肿、眼球突出，就诊于当地医院。

查甲功、吸碘率均正常，对症治疗后症状未见明显好转。

其后间断出现心慌、出汗、乏力、大便次数增多和体质量下降，但甲亢症状并不典型。

２个月后查甲功，诊断为甲状腺功能亢进症（甲亢），给予赛治（每次１０ｍｇ，每日３次）、优甲乐（２５μｇ
）治疗。

１个月后，患者眼睑浮肿、眼球突出加重，未系统治疗，４个月后自行停药。

７ｄ前患者无明显诱因出现双眼视力下降（右眼仅有光感），伴有畏光、复视、胀痛、流泪，眼球活动后疼痛，就诊于本院。

甲功检查：促甲状腺激素（ＴＳＨ）０．００５μＩＵ·ｍＬ－１，游离Ｔ３　１５．８２ｐｍｏｌ·Ｌ－１，游离Ｔ４　６１．７５ｐｍｏｌ·Ｌ－１，为系统诊治入住本科。

查体：双眼球突出（＞２３ｍｍ）、睑球结膜充血，角膜变白，右眼视力０．０１，左眼视力０．６，下睑缘内翻倒睫，双眼睑闭合不全（左２ｍｍ、右４ｍｍ）。

右眼混合充血，角膜中央及下方可见９ｍｍ直径溃疡，水肿，眼部分泌物增多，眼球外展功能略受限，眼球活动良好。

入院后查甲功五项示：ＴＳＨ　０．００５μＩＵ·ｍＬ－１，游离Ｔ３　１５．８２ｐｍｏｌ·Ｌ－１，游离Ｔ４６１．７５ｐｍｏｌ·Ｌ－１；眼球ＣＴ检查：视神经走行正常，双侧眼球和双侧上直肌、下直肌及内直肌改变。

根据病史、诊疗经过和辅助检查结果，明确诊断为甲亢、甲状腺相关性眼病（重度）。

给予赛治（１０ｍｇ，每日３次），甲强龙激素冲击治疗，１　０００ｍｇ隔日１次冲击３次，后给予泼尼松３２ｍｇ巩固维持治疗（早２０ｍｇ、晚１２ｍｇ，根据患者眼部症状和甲功检查结果调整泼尼松用量）及综合对症治疗。

出院１个月随诊，眼睑肿胀、畏光流泪、肿痛明显好转。

双眼视力：右眼０．３，左眼视力０．６，复查Ｔ３、Ｔ４和ＴＳＨ水平均恢复正常。

出院后随诊半年，患者右眼视力基本恢复（右眼０．６、左眼０．８），角膜溃疡基本痊愈，双眼球突出减轻（＜２１ｍｍ），其他眼部症状明显好转。

２　讨　论
Ｇｒａｖｅｓ眼病是一种伴有甲状腺激素分泌增多的多系统、器官特异性自身免疫性甲状腺疾病，按其病变程度可以分为单纯性突眼和浸润性突眼。

浸润性突眼是一种危及视力且影响外貌的自身免疫性疾病，该病发病机制尚未完全阐明，目前认为与遗传因素、吸烟和自身免疫有关。

近期的研究表明：细胞免疫和体液免疫均与突眼的发生有关。

眼部组织可能与甲状腺存在共同的抗原决定簇，ＴＳＨ受体抗体、甲状腺球蛋白－抗甲状腺球蛋白抗体和眼肌膜抗原等可能参与发病。

该病多见于女性，虽常并发于甲状腺功能亢进的患者，但临床上也可见于甲状腺功能低下患者或正常者。

５％患者仅有明显突眼而无甲亢症状或症状并不典型，因此临床上容易发生漏诊或误诊。

甲状腺眼病治疗的目的是缓解症状，抑制疾病进展，减少眼肌体积，保持或改善容貌，但目前为止尚无可靠的治疗方法完全达到上述目的。

目前临床上浸润性突眼的治疗方法主要是对症治疗、大剂量激素冲击治疗、免疫抑制剂联合激素冲击治疗、抗甲状腺药物治疗、生长抑素类似物法、血浆置换法、放射治疗、框内减压手术治疗和中药治疗等。

选择抗甲状腺药物和大剂量激素冲击治疗后给予泼尼松巩固维持治疗及综合对症治疗时应密切关注患者血压、血糖、离子、血常规和肝功能等变化。

出院后半年随诊，患者右眼视力基本恢复，角膜溃疡基本痊愈，双眼球突出减轻，其他眼部症状明显好转。

该患者以眼睑浮肿、眼球突出为首发症状，但甲亢等其他高代谢症状均不明显，因此临床上遇见眼球突出但相应临床症状不明显的患者仍需行甲功检查，对于甲功正常的患者仍需随诊，每隔１个月行甲功检查，以免漏诊。

本组患者虽明确甲亢诊断，但并未规律应用抗甲状腺药物，导致病情恶性发展，眼部症状加重，以致造成几近失明的后果。

建议对于甲亢伴突眼患者，一旦确诊甲亢，应告之患者一定进行积极正规治疗，并定期行相关检查。

３
６１１李悦玮，等．　尼可地尔后处理对心肌缺血－再灌注损伤大鼠心肌的保护作用
图１　不同强度微波辐射后Ｈｅｌａ细胞形态学表现（×１００）
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｒａｄｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ（×１００）Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ－Ｆ：ＨｅＬａ　ｃｅｌｌｓ　ｒａｄｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　２．５，５．０，１０．０，１５．０ａｎｄ　２０．０ｍＷ·ｃｍ－２　ｍｉｃｒｏｗａｖｅ．
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１１５８ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ
）
图１　各组大鼠心肌组织形态学表现（ＨＥ，×４００）
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎｖａｒｉｏｕｓ　ｇｒｏｕｐｓ（ＨＥ，×４００）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ：ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ；Ｃ：Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｇｒｏｕｐ．
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１１６２ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ）
图２　各组大鼠心肌细胞凋亡情况（ＴＵＮＥＬ，×４００）
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓｇｒｏｕｐｓ（ＴＵＮＥＬ，×４００）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ：ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ；Ｃ：Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ．（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１１６２ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ
）
图３　各组大鼠心肌组织中Ｃａｓｐａｓｅ－３表达（免疫组织化学染色，×４００）
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－３ｉｎ　ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｖａｒｉｏｕｓｇｒｏｕｐｓ（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ，×４００）
Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；Ｂ：ＩＳＯ　ｇｒｏｕｐ；Ｃ：Ｎｉｃｏｒａｎｄｉｌ　ｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ．
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１１６２ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ）图１　培养１周后的黑素细胞形态
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　１ｗｅｅｋ
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１１８８ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ
）
图２　培养至８０％融合时的黑素细胞形态
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆ　ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ　８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１１８８ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ）图１　奇异变形杆菌７ｃｍ胶条２－ＤＥ图
谱重复结果
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｒｅｐｅａｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　２－ＤＥ　ｍａｐｓ
ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　ｗｉｔｈ　７ｃｍ　ｓｔｒｉｐ
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１２２０ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ）
图２　奇异变形杆菌１７ｃｍ胶条２－ＤＥ图谱
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　２－ＤＥ　ｍａｐｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ　ｗｉｔｈ
１７ｃｍ　ｓｔｒｉｐ
Ａ：１ｍｇ　ｓａｍｐｌｅ，１３０Ｗ；Ｂ：１ｍｇ　ｓａｍｐｌｅ，８０Ｗ；Ｃ：２ｍｇ
ｓａｍｐｌｅ，８０Ｗ．
（ｓｅｅｎ　ｏｎ　ｐａｇｅ　１２２０，１２２１ｉｎ　ｐａｒａｇｒａｐｈ）。