Southern_blot和Western_blot分析鉴定志贺氏菌侵袭毒力表达
蛋白核酸杂交转印膜(PVDF膜和尼龙膜)介绍
蛋白、核酸杂交转印膜(PVDF、尼龙膜)技术介绍转印膜:用于蛋白质和核酸的转移和检验过程的微孔膜。
Southern blot:又称Southern 印迹杂交,是研究DNA 图谱的基本技术。
Northern blot:又称Northern 印迹杂交,与Southern blot 方法类似,是检测RNA的基本技术。
Western blot:又称Western 印迹杂交,与Southern blot 方法类似,是蛋白质检测分析的基本技术。
转印膜在蛋白质和核酸的转移和检测过程中应用广泛,不同的转印膜规格和参数不同,选择正确、均一稳定的转印膜对达到最佳的实验结果起到关键性的作用。
常用的转印膜对比:常用的三种转印膜:硝酸纤维素膜(NC 膜)、带正电的尼龙膜(N66膜)、聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)。
C ob e t t er三种转印膜结合DNA或RNA的能力:带正电尼龙膜>PVDF膜>硝酸纤维素膜。
三种转印膜机械强度比较:硝酸纤维素膜较脆,易破碎,不能重复使用;尼龙膜和PVDF 膜机械强度较高,可重复使用。
带正电的尼龙膜可结合短至10bp核酸片段,因此是最理想的核酸杂交转印膜。
PVDF膜机械强度高、耐高温,是蛋白印迹最理想的转印膜。
Cobetter专为蛋白核酸杂交研发了性能优良的转印膜,Cobetter杂交转印膜的种类如下:retteboC⏹N66尼龙转印膜⏹N66尼龙带正电荷转印膜⏹PVDF疏水转印膜⏹PVDF亲水转印膜Cobetter转印膜孔径有0.45um、0.22um 两种。
CobetterN66尼龙转印膜:相比起硝酸纤维素膜而言,其机械强度高,在经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形,可重复使用,非常适用于核酸检测。
制模过程中通过特殊的表面改性方法嫁接了亲水性的基团,使用过程中不需要再做预润湿处理。
通过在膜表面嫁接羟基基团,改变其表面电荷性能(正电),使得其能紧密结合DNA 而降低背景,快速结合DNA。
基因工程总结
简述Southern blot,northern blot,western blot的原理,比较它们的不同.答:Southern Blot 原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
DNA => 琼脂糖电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交(变性探针)=> 洗膜=> 放射自显影或显色Northern Blot原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。
mRNA提取=> 甲醛变性电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交(变性探针)=> 洗膜=> 放射自显影或化学发光Western Blot与 Southern Blot或 Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
《临床微生物学检验》题目 单选 多选 简答 论述
临床微生物学检验题目一、单选题1.下列检查中除哪项外均可用于霍乱的诊断:EA.大便悬滴法检查B.大便碱性蛋白胨水培养C.大便涂片革兰染色D.霍乱血清凝集试验找特异性抗体E.血培养找霍乱弧菌2.近年来发现对痢疾杆菌较敏感的抗菌药物为:DA.卡那霉素B.庆大霉素D.氟喹诺酮类E.氨苄青霉素3.在钩端螺旋体病血清学试验中,国内以下列哪种试验有较高的特异性和敏感性:AA.显凝试验B.炭凝试验C.红细胞凝集试验D.红细胞溶解试验E.补体结合试验4.乙脑患者早期的特异性诊断检查:EA.腰穿检测脑压B.脑脊液化验检查C.头颅CT检查D.补体结合试验检测乙脑IgG抗体E.酶联免疫吸附试验,检测乙脑IgM抗体5.流行性斑疹伤寒的实验室诊断方法常选:CA.血常规B.病原体接种分离C.外斐反应D.立克次体凝集试验E.补体结合试验6.血清流行病学调查时,若需要长期保存血清应置于:DA.-4℃冰箱B.-8℃冰箱C.-10℃冰箱D.-20℃冰箱E.以上都不对7.用于血清流行病学调查的静脉采血量一般为:E以下~2ml~3ml~5ml以上8.能长期或永久保存血清的温度条件是:E℃℃℃℃℃9.志贺菌属中,下列哪一项不正确:EA.在普通琼脂平板上生长形成中等大小、半透明的光滑型菌落抗原为型特异型抗原抗原为群特异性抗原D.分解葡萄糖,产酸不产气E.分解乳糖,产酸产气10.宋内氏志贺氏菌有两个变异相,急性患者分离的菌株一般是:AA.Ⅰ相B.Ⅱ相C.Ⅰ相或Ⅱ相D.Ⅰ相和Ⅱ相E.以上都不对11.有关细菌培养基的描述,哪项是不正确的:BA.按物理状态可分为液体、固体和半固体三类培养基属于鉴别培养基C.血琼脂平板属于营养培养基D.蛋白胨水为常用的基础培养基E.庖肉培养基属于厌氧培养基12.新从病人分离的肠道杆菌菌落是:B型型或S型和S型E.以上都不对13.接种立克次体的鸡胚应置于下列哪一个温度的孵卵箱中孵育:AA. 32~35℃B. 37~38℃C. 38~39℃D. 39~40℃E. 40~41℃14.用吉姆尼茨染色法染色立克次体时加石炭酸复红染色液一般需要:CA. 1分钟B. 2分钟C. 5分钟D. 10分钟E. 15分钟15.最早采用的检测方法为:BA. 分离培养B. 直接涂片镜检C. 血清学试验D. 动物试验E. 电镜检查16.下列哪种细菌的最适生长温度为25℃:CA. 肠炎沙门菌B. 空肠弯曲菌C. 假结核耶尔森菌D. O157:H7大肠杆菌E. 宋内志贺菌17.常用琼脂扩散试验的琼脂浓度为:B~2%~4%~6%~8%18.宋内志贺菌:DA. 快速发酵乳糖B. 为B群C. 包括10型D. 培养中常出现扁平的粗糙型菌落E. 为A群19.下列哪一项是痢疾志贺菌的特性:AA. 可产生志贺毒素B. 只有1型C. 迟缓发酵乳糖D. 有15个型E. 培养中常出现扁平的粗糙型菌落20.测定HIV感染的最简便方法是下列哪一个:AA. 测定HIV抗体B. 分离HIV病毒C. 测定HIV抗原D. 测定HIV核酸E. HIV基因测序21.庆大霉素培养基适用于培养何种细菌:CA. 鼠疫杆菌B. 布鲁氏菌C. 霍乱弧菌D. 白喉杆菌E. 奈瑟氏菌的抗原成分中哪一种与病毒的中和性作用有关:BA. HBvAgB. HBsAgC. HBcAgD. HBeAgE. HBuAg23.甲型肝炎实验室诊断方法主要依赖于检测患者血清中的下列哪种成分:CA. 抗HAV的IgAB. 抗HAV的IgGC. 抗HAV的IgMD. 抗HAV的IgDE. 抗HAV的IgE24.沙门菌属在普通平板上的菌落特点为:AA. 中等大小,无色半透明B. 针尖状小菌落,不透明C. 中等大小,粘液型D. 针尖状小菌落,粘液型E. 扁平粗糙型25.立克次体病原学检查,脏器组织和节肢动物可做切片检查,切法要求越薄越好,一般不超过:A~4微米~8微米~15微米~25微米~40微米26.做补体结合试验前血清加热灭活以破坏它所含有的补体,通常羊血清用下列哪一个温度灭活:BA. 48℃B. 58℃C. 68℃D. 78℃E. 88℃27.在CFT反应中为了查Ag,常常降低反应温度,称为冷CFT,冷CFT反应温度通常是:EA. 37℃B. 18℃C. 24℃D. 30℃E. 4℃28.当进行抗球蛋白试验查不完Ab时,其中一个重要试剂是第二Ab,在抗球蛋白试验中第二抗体是:AA. 双价抗体B. 单价抗体C. IgE抗体D. 半抗体E. IgD抗体29.在CFT反应中有5种成份:Ag、被检血清、补体、溶血素和SRBC,CFT反应中补体的作用是:EA. 特异性结合B. 指示剂C. 抑制剂D. 中和作用E. 非特异性结合30.在进行免疫血清学检查时进行Ag-Ab反应,进行此反应有许多影响因素,一般Ag-Ab反应中无电解质时:BA. 敏感性下降B. 不反应C. 敏感性上升D. 反应正常E. 提高特异性31.某菌属的一个血清群只有1个血清型,诊断时需同时含有Ⅰ相和Ⅱ相抗血清,这一菌属为:AA.志贺氏菌B.艾希氏菌C.沙门氏菌D.大肠杆菌E.耶尔森氏菌32.某菌属的一个血清群只有1个血清型,诊断时需同时含有Ⅰ相和Ⅱ相抗血清,这一菌属分为几个血清群:B33.某菌属的一个血清群只有1个血清型,诊断时需同时含有Ⅰ相和Ⅱ相抗血清,所述血清群为第几群:D群群群群E.以上都不对34.有关放射免疫测定,哪种说法是不正确的:DA.放射性强度常用毫居里mCi或微居里μCi表示B.广泛应用于蛋白质、酶的测定C.广泛应用于半抗原和药物的测定D.其特点是特异性强,但敏感性低E.可能存在的放射性污染为其缺点之一试验是测试细菌:CA.产生志贺样毒素的能力B.产生肠毒素的能力C.侵袭力D.产生内毒素的能力E.粘附能力36.军团菌培养时,BCYE-α琼脂与BCYE琼脂成分不同之处在于前者含有:BA.苏氨酸B.酮戊二酸C.头孢羟唑D.多粘菌素E.茴香霉素37.鲎试验用于何种物质的测定:CA. 外毒素B. 类毒素C. 内毒素D. 神经毒素E. 肠毒素38.可用于扩增未知序列的PCR方法是:BA. 对称PCRB. 反向PCRC. RT-PCRD. 不对称PCRE. 嵌套PCR39.把外源质粒导入细菌中的方法称为:BA. 转导B. 转化C. 转染D. 转入E. 克隆40.从有正常菌群存在的部位所采取的标本应接种在哪种培养基中分离培养病原菌:CA.增菌培养基B.营养培养基C.选择鉴别培养基D.基础培养基E.特殊培养基二、多选题1.可从粪便标本中分离的病毒有:ACDEA.甲型肝炎病毒B.麻疹病毒C.脊髓灰质炎病毒D.人类轮状病毒病毒2.血清学诊断法,正确的是:ABCDA.伤寒—肥达反应B.风湿病—抗“O”试验C.斑疹伤寒—外斐反应D.梅毒—瓦色曼试验E.莱姆病—IgA抗体检测三、简答题1.什么是PCR技术,典型的PCR技术分几个步骤答:PCR技术全称聚合酶链式反应Polymerase Chain Reacti-on技术,是一种扩增、复制小分子核酸片段的分子生物学技术;典型的PCR技术分为预变性,变性,退火,延伸,最后延伸5个步骤;2.什么是ELISA技术,依据原理不同ELISA技术一般可分为几类答:ELISA技术全称为酶联免疫吸附技术;依据原理不同ELISA技术可分为双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法和捕获包被法;3.常用的药物敏感性测试AST技术有哪些答:纸片扩散法K-B法、E-Test法、琼脂稀释法、肉汤稀释法仅列出要点;4.细菌培养基按照其用途不同可分为哪五类答:基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基仅列出要点;5.霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中培养形成菌膜的原因是什么答:霍乱弧菌为好氧、动力活泼菌,繁殖迅速,故在气液面形成菌膜仅列出要点;6.核酸探针杂交技术有哪几种答:共分为两种,分别为DNA印迹杂交Southern blot与RNA印迹杂交Northern blot 仅列出要点;三、论述题1.在食源性疾病暴发疫情的现场处置过程中,针对细菌性病原,如何进行样本采集与分离鉴定答:采集粪便用于细菌检测,最好是在病人使用抗菌药物之前,采集新鲜粪便;既可以使用灭菌棉拭子直接从消化道下端采集,也可以蘸取病人排泄物样本;采集的粪便样品一般有两种处理办法:1立即投入到相应致病菌增菌液中进行培养增菌,如用于霍乱增菌的APW和用于检测EHEC的mEC增菌肉汤中;2将采集的粪便拭子插入到Cary-Blair运送培养基中送至相关实验室进行检测;在进行分离鉴定时:1针对霍乱等弧菌,可将粪便拭子样本投入碱胨水APW中增菌6-8小时后用四号琼脂、庆大霉素琼脂或TCBS琼脂划线分离培养用于检测霍乱弧菌;而继续增菌16-18小时,接种麦康凯琼脂划线分离培养,可用以检测嗜水气单胞菌与类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌等;2针对肠杆菌,可将粪便拭子投入SBG/SF/SC增菌液中增菌16-18小时后用沙门科玛嘉平板划线分离检测沙门氏菌;可将粪便拭子投入mEC肉汤中增菌16-18小时后用O157免疫磁珠富集/科玛嘉平板划线分离检测EHEC O157;还可直接将粪便拭子转种麦康凯/SS培养基37度培养16-18小时检测志贺菌与大肠杆菌;对于可疑大肠埃希氏菌,可用多重PCR的方法检测EA/ET/EI/EP/EH五种致泻大肠杆菌;3针对弯曲菌,可将粪便拭子转种与CCDA或skirrow绵羊血平板,37度微需氧环境下培养24-48小时检测空肠、结肠弯曲菌等;在整个分离培养过程中获得的可疑菌落也可以根据实际情况使用API、Vitek等系统生化鉴定方法进行鉴定与报告;4在应急检测中,也可以使用PCR技术进行致病菌的核酸检测;技术近年来在传染性病原的快速诊断领域中得到越来越广泛的应用,请概述PCR技术的原理,反应的基本成分,基本步骤及操作注意事项;答:PCR技术的原理是:双链DNA在高温条件下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝,当温度降低后又可以复性成为双链;因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制;典型PCR反应的基本成分为:特异性引物,热稳定DNA聚合酶/缓冲液包含Mg离子,4种dNTPs,模板、灭菌去离子水;PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94-98℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火复性:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40-55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;PCR操作注意事项:1.严格操作,避免交叉污染与气溶胶污染; 2.确保引物、试剂与扩增模板质量与配比; 3.产物电泳小心处理EB染料,防止污染和对人体造成危害;3.请解释伤寒诊断中肥达氏反应O抗体与H抗体的诊断意义;答:肥达反应是诊断伤寒副伤寒的辅助诊断;其结果的解释必须结合临床变现和病程,病史,以及地区流行病学情况;机体患伤寒、副伤寒,一般于发病后1—2周内血液中出现特异性抗体并且随着病程延长而效价渐升,此时即可为阳性,第4周可达峰值,以后又逐渐降低;一般以“O”凝集效价在1:80或以上和“H”在1:160或以上为阳性;抗体主要是IgM,出现较早;H抗体主要是IgG,出现较晚;根据此特点,肥达试验结果有如下诊断价值:二者均超过正常值,患伤寒的可能性大;二者均在正常值内,患伤寒的可能性小;H抗体效价超过正常值,O抗体效价正常,可能是接种了伤寒菌苗或者是接种的回忆反应;O抗体效价超过正常值,H抗体效价正常,可能是伤寒早期或者其他沙门氏菌感染;一般间隔1—2周复查,若抗体效价比前次结果增高2—4倍,则具有诊断价值;4.霍乱是我国传染病防治法规定的甲类传染病,请列举霍乱弧菌实验室检测的方法及步骤,包括采样、增菌、分离培养、生化/血清学鉴定等环节; 答:霍乱检测的采样主要对象是病人呕吐物,粪便与环境水样;对于粪便与呕吐物,可直接分离培养或用碱性蛋白胨水APW37度增菌6小时必要时可二次增菌后进行检测;对于环境水样,可用10×APW进行增菌;增菌处理结束后可用接种环挑取表面增菌液划线分离于四号琼脂/庆大霉素琼脂/TCBS琼脂37度培养16-18小时后观察是否有可疑菌落生长四号琼脂上为无色半透明黑心菌落,庆大霉素琼脂为无色半透明菌落,TCBS琼脂上为黄色菌落;挑取可疑菌落进行氧化酶/拉丝试验,氧化酶阳性/拉丝试验阳性菌落可初步判定为霍乱弧菌,可将其转种于营养平板培养后进行系统生化鉴定;鉴定为霍乱弧菌的菌株还需进一步进行O1/O群、小川/稻叶血清分型;有条件的话还可以使用PCR/荧光定量PCR的方法检测其是否产CTX肠毒素;。
Southern blot实验方法和操作步骤
Southern Blot原理及实验方法Southern Blot原理及实验方法原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液:1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH。
中和液:0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.5),1.5mol/L NaCl。
20×SSC:3mol/L NaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC:用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL,加无菌水45mL。
6×SSC:用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL,加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶,切去边缘多于部分,EB染色,在紫外灯下照相(放一标尺,可从像片中读出DNA迁移的距离)。
2. 将凝胶置于200mL变性液中,浸泡45分钟,并温和地不断振荡,使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA,然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟,将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘,在底部放一块玻璃板(或一块海绵)使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面,在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸,滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中,在玻璃和滤纸之间,赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上,赶走两层之间出现的气泡。
Western Blot(WB)分析法
Western Blot(WB)分析法实验目的检测目的蛋白的表达情况。
实验原理Western Blot(WB)采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,例如硝酸纤维素薄膜(NC膜),固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤(一)蛋白胶的配制根据相关蛋白胶配制的说明书及目的蛋白的大小配制相适应浓度的分离胶和浓缩胶。
(二)跑胶浓缩胶的电压为80 V,分离胶的电压为120 V。
跑完胶后可根据原核或真核表达来选择是否进行染色,原核表达量高,可通过考马斯亮蓝染色观察表达情况,真核不易看出。
(三)转膜1. 转膜的定义将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体(例如NC膜)上,本实验室采用电泳印迹法。
常用的电泳转移方法有湿转和半干转。
两者的原理完全相同,只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
前者操作容易,转移效率高,但转移时间长;而后者适用于大胶的蛋白转移,所用缓冲液少。
2. 转移膜的选择杂交膜的选择是决定Western Blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western Blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物,在低离子转移缓冲液的环境下大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,但在非离子型的去污剂作用下结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小,选择不同孔径的NC 膜。
因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]1.熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
2.了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离,使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上;经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链),通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用,将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上;•经过干燥或紫外线照射处理,单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上;转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交;经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样,比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置(也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交)。
它把电泳分离和杂交结合起来,不但能检测出特异的DNA序列片段,而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准,精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标,移动距离(cm)为横坐标,连接各已知条带相应的点,得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离,在标准曲线上找出相应的Log10kb值,以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1.电热真空干燥箱2.硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3.大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4.滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜(Parafilm)、一次性手套等5.刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1.酸变性液:0.25mol/L HCl,用分析纯的盐酸(12Mol/L)稀释2.碱变性液:0.5mol/L NaOH, 1.5mol/l NaCl(pH13.1)3.中和液:0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4.20×SSC: 0.3mol/L柠檬酸,3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5.10×SSC和2×SSC:用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意:操作戴手套!1.凝胶处理:1)凝胶照像后,切去包括标记带在内的多余部分,将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记,以便于定位。
southern blot原理
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的,用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列,以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来,再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板,最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理,以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤:1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段;2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上;3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合;4). 将结合物暴露在感光材料上,从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于:1). 鉴定特定的DNA序列;
2). 鉴定DNA片段的长度;3). 检测突变;4). 检测某种重组;5). 筛选特定基因序列;6). 检测融合基因;7). 研究基因组学;8). 检测特定的核酸,如RNA、miRNA、siRNA等。
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基因操作习题和答案
第一章一. 名词解释:1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸(物质)分子插入到病毒,质粒或其它载体系统中,再整合到特定的宿主中,从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区,使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位,也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长,含有许多目的基因以外的DNA 片段时,在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行,将目的基因所对应的一小段DNA 找出来,这个过程叫“亚克隆”。
二. 填空题1. 基因操作(Gene manipulation)的核心部分是基因克隆(gene cloning),gene cloning 的基本要点有(),()和()。
参考答案:克隆基因的类型;受体的选择;载体的选择2. ()是遗传物质的基本单位,也是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段。
它可以是连续的,也可以是();可以是(),也可以是RNA;可以存在于染色体上,也可以()。
参考答案:基因;不连续的;DNA;存在于染色体之外(如质粒,噬菌体等)3. 基因操作并不是一个法律概念,除了包括基因克隆外,还包括基因的()、()、()和()等与基因研究相关的内容。
参考答案:表达;调控;检测;改造4. 启动子(Promotor)是指()。
通常一个Gene 是否表达,()是关键的一步,是起决定作用的。
在转录过程中,Promoter还是()的结合位点。
参考答案:基因转录过程中控制起始的部位;转录起始;RNA 聚合酶5. 原核生物的RNA polymerase 主要由两部分组成:()和(),其中σ-因子并不参与RNA 的合成,它的作用主要是()。
southern blotting原理和步骤
southern blotting原理和步骤嘿,咱今儿个就来唠唠 southern blotting 这档子事儿哈!你说 southern blotting 呀,那就像是一场分子世界里的奇妙探险!想象一下,我们就像一群好奇的探险家,要在那茫茫的分子海洋里找到我们想要的宝贝。
它的原理呢,其实挺有意思的。
简单来说,就是利用核酸分子杂交的特性,来检测特定的 DNA 片段。
就好像我们有一把专门的钥匙,能打开特定的那扇门。
这钥匙就是我们设计的探针,而那扇门就是我们要找的目标 DNA 呀!接下来讲讲步骤,这可真是个精细活儿!首先得把我们要研究的DNA 从细胞里提取出来,这就好比从一个大宝藏里把宝贝给挖出来。
然后呢,用限制性内切酶把这 DNA 切成一段段的,哎呀,这就像把一个大拼图给拆开了。
再之后,把这些切好的 DNA 片段通过电泳的方式,让它们在凝胶里排好队,这就像是让一群小朋友按高矮个站好一样。
接着,把这些排好队的 DNA 从凝胶里转移到膜上,这一步可关键啦,就像把宝贝从一个地方小心翼翼地搬到另一个地方。
然后呢,就是让我们的探针上场啦!这探针就像个机灵的小侦探,专门去寻找它的目标。
把膜和探针放在一起,让它们相互作用,就像两个好朋友见面聊天一样。
最后呀,通过一些检测手段,我们就能知道探针有没有找到它的目标啦!如果找到了,那就大功告成啦!你说这 southern blotting 是不是很神奇?它就像是在分子世界里搭建了一座桥,让我们能从茫茫的分子中找到我们想要的那一部分。
你想想,要是没有 southern blotting,我们怎么能这么准确地找到特定的 DNA 呢?它可是为我们打开了一扇了解基因的大门啊!所以说呀, southern blotting 虽然步骤有点多,有点复杂,但它的用处可大着呢!它就像一把神奇的钥匙,能帮我们解开很多基因的秘密。
咱可得好好记住 southern blotting 的原理和步骤,说不定啥时候就能派上大用场呢!是不是很有意思呀?哈哈!。
southern blot名词解释
southern blot名词解释
Southern blot是一种分子生物学技术,用于检测和分析DNA
序列的存在和数量。
它的名字来源于其开发者爱德华·南方(Edwin Southern)。
Southern blot技术利用DNA电泳、转移
与固定等步骤,将DNA在凝胶上进行分离,并通过杂交反应
检测特定序列。
首先,通过限制性内切酶将DNA剪切成片段,然后通过琼脂糖凝胶电泳将DNA分离成不同大小的片段。
接
下来,将DNA片段转移至固体载体(通常是尼龙膜或硝酸纤
维膜),形成DNA的复制。
在杂交反应中,使用标记有特定
探针的DNA或RNA序列与蛋白酶K处理后的膜进行结合,
以检测特定序列的存在。
通过观察标记物的信号强度和位置,可以确定DNA序列的存在和数量。
Southern blot技术通常用
于检测DNA重组、基因突变、基因表达等各种研究中。
《基因工程》每章思考题
《基因工程》双语课每章思考题第一章1什么是基因工程?2基因工程的操作步骤有哪些?3基因工程的应用范围?基因操作可以应用在哪些领域?4什么是GMO?5在基因工程领域有重要贡献的科学家有哪些?试例举三位及其贡献。
6基因工程的三个发展阶段?第二章1 DNA、RNA的主要区别?2 DNA(or RNA)的组成?3 DNA变性概念及诱发因素。
4 中心法则的主要内容。
5 遗传密码子的概念。
6 基因的概念、类型。
7 基因的表达。
8 原(真)核生物基因的结构及区别。
9 遗传物质及其相互联系。
10 某研究小组对一个克隆的DNA序列(非模板)进行测序,其碱基顺序(假定)如下:5’ -CCGGCGGCAATGGCGGCGTCGGCGACCCAGGAGGCCGACTAACGGACCG -3’(1)请写出模板链的碱基顺序及转录的碱基序列(2)翻译从何处开始、何处结束(3)可能编码的氨基酸序列(4)如果基因突变,那部分区段变异会影响该基因编码和蛋白质功能 (密码子见下表)第三章1 DNA提取的三个基本条件。
2 在DNA提取中,酚/仿提抽的目的是什么?3 纯化DNA或RNA时,通常将DNA溶解在哪种物质中,为什么?4 利用紫外分光光度比值来确定提取的DNA或RNA纯度时:当A260=1时,相当于含有μg•ml-1 dsDNA 或μg•ml-1 ddDNA当A260/ A280=1.8时,为较纯的,当A260/ A280=2.0时,为纯当A260/ A280>2.0 有杂质,当A260/ A280<1.8 有残留的物质5 请简述Southern杂交的原理和过程6 请简述Southern Blotting、Northern Blotting和Western Blotting的区别?7 请简述核酸电泳的原理。
第四章1 限制性核酸内切酶三种类型的特点?为什么基因工程中需选II型酶。
2 Type II restriction endonucleases的命名原则。
Western blot 实验技术及常见问题分析【精选-】
结合
1. 制备单克隆抗体或者重新选 取合成抗原多肽的位点
2. 设立不加一抗,只加二抗的 平行对照来检测二抗是否有 非特异结合
参照体系
分子量Marker:确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照:如果是表达蛋白需要做表达前的 内参:看家基因编码表达的蛋白
Gg!BbWw7Rs2Mn)Ii$DdYy9Tt4Op+J k&FfZAaVv6Qq1Lm( Gh!CcXx7Ss3Nn-Ij%EeYz9U un)Hi$DdYy8Tt4Oo+ J k&FfZ AaVv5Qq1Lm(Gh!Cc Wx7Ss3Nn-Ij %DeYz 9Tu4Pp0Kk*Fg#AbVw6Rr1M m)Hh$CdXy8St3Oo-Jj&EfZzaU v5Pq0Ll*Gg!BcWw7Rs 2Mn)Ii %DdYy9Tt4Op+Kk&F f#AaVv6Qr1Lm(Hh!CcXx7Ss3No-Ij %EeYz9Uu5Pp0Kl*Fg #BbWw6Rr2M m)Hi $CdXy8Tt3O8St3Oo+Jj&EfZzaU v5Qq0Ll(Gg!BcWx7Rs 2Nn)Ii %DeYy9Tu4Op+Kk&F f#AbVv6Qr1Lm(Hh$CcXx8Ss3NoJj%EeZz9Uu5Pq0Kl*Gg#BbWw6Rr2Mn)Hi$DdXy8T t4Oo+ J k&EfZ AaVv5Qq1Ll(Gh!Cc Wx7Ss2Nn-Ii% DeYz9Tu4Pp+ Kk*Fg#AbVw6Qr1M m)Hh$CdXx8St3Oo-J j&Wx7Rs2Nn-Ii%DeYy9Tu4Pp+Kk*Ff#AbVv6Qr 1M m(H h$CcXx8St3N o-Jj% EeZzaU u
Southern_blot实验方法与步骤
实验名称: Southern blot一、实验目的1.学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
三、试剂与仪器(一)器材:糖瓷盘,台式离心机,恒温水浴锅,电泳仪,水平电泳槽,杂交炉,杂交袋,尼龙膜或硝酸纤维素膜,转印迹装置,滤纸,吸水纸,紫外交联仪,摇床,X线胶片。
(二)试剂:限制性内切酶,DNA加样缓冲液,DNA Ladder Marker,0.25M HCl变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)中和液(0.5M Tris- HCl PH7.5,3M NaCl),转印迹液SSC(3M NaCl,0.3M柠檬酸钠,PH7.0)标记探针,20×SSC,预杂交液和杂交液,2×洗液(2×SSC,0.1%SDS)2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液(0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20)1×封阻液[1%(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液(0.1M马来酸,0.15M NaCl ,PH7.51×检测液(0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5)抗-地高辛-碱性磷酸酶。
四、实验步骤1、制备DNA分子(PCR)2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后,将胶小心从电泳槽中取出,用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪,然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤,当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出,用ddH2O涮洗两次,然后放入碱变性液(0.5 M NaOH)中处理45 min,使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。
Southern blot实验报告
医学分子生物学实验技术实验报告实验名称: Southern blot一、实验目的1.学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理1. Southern blot实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术,就是分子杂交(hybridization)。
指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下,根据碱基互补的原则缔结成双链分子。
Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术,检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
其主要步骤包括:⑴基因组DNA的限制性酶切;⑵DNA 酶切片段的电泳分离和转移;⑶杂交及检测。
三、实验步骤1、基因组DNA的限制性内切酶酶切1.1按如下方案进行基因组的酶切HL60基因组DNA 10 mg 5 ul10×Buffer E 2 ulEcoR I(10 u/ml) 2 ulddH20 11ul总体积 20 ul37℃保温1.5小时。
2、电泳分离2.1保温期间,浇一块凝胶板:称0.6g琼脂糖加60ml1xTAE,微波炉低火加热1分钟,让琼脂糖完全溶解,稍微冷却后,加6 ulGelRed,浇在封好的并已插上梳子的凝胶板上,移去气泡,室温放置40分钟以上。
2.2 DNA酶切后加1/5体积6x加样缓冲液。
2.3 取阳性对照10ul,含c-myc 4.7 kb线性片段300pg,加1/5体积6x加样缓冲液。
2.4取基因组DNA10ug,加ddH2O至10 ul,加1/5体积6x加样缓冲液。
同时去自己抽提的基因组DNA20ul,加1/5体积6x加样缓冲液。
2.5将凝胶放入电泳槽中,加入1xTAE,直到液面高出凝胶1mm,将以上各样品小心加入样品槽中,两组共用一块凝胶,共7个样,从左至右依次为:1未酶切自己基因组,2未酶切老师基因组,3 酶切老师基因组,4阳性对照(4.8kb线性c-myc),5酶切老师基因组,6未酶切老师基因组,7未酶切自己基因组。
蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0ml;β-巯基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24 g;加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液:考马斯亮兰0.2 g;甲醇80 ml;乙酸 2 ml;ddH2O118 ml。
Southernblot实验方法与步骤
Southernblot实验⽅法与步骤Southern blot实验⽅法与步骤⽤于检测重组DNA,也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA⽚段。
⽤于基因诊断,也可验证检测⽚段的分⼦量⼤⼩。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切,进⾏琼脂糖电泳,把分离后定位在凝胶上的不同分⼦量的DNA经碱变性处理,将凝胶中变性的DNA转移⾄⼀固相⽀持滤膜。
利⽤标记的某⼀DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发⽣同源性杂交,利⽤放射⾃显影(化学发光法或显⾊法)检测。
(⼀)器材:台式离⼼机,恒温⽔浴锅,电泳仪,⽔平电泳槽,杂交炉,杂交袋,尼龙膜或硝酸纤维素膜,转印迹装置,滤纸,吸⽔纸,紫外交联仪或80℃烤箱,摇床,X线胶⽚。
(⼆)试剂:限制性内切酶,DNA加样缓冲液,DNA Ladder Marker,0.25M HCl,变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl),中和液(0.5M Tris- HCl PH7.5,3M NaCl), 转印迹液20? wSSC (3M NaCl,0.3M柠檬酸钠,PH7.0),标记探针, 2?wSSC,预杂交液和杂交液,2×洗液(2×SSC,0.1%SDS),0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液(0.1M马来酸,0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20),1×封阻液[1%(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液(0.1M马来酸,0.15M NaCl ,PH7.5)],1×检测液(0.1M Tris- HCl,0.1MNaCl,PH7.5),抗-地⾼⾟-碱性磷酸酶。
注意:若基因组DNA过低,要以较⼤体积进⾏限制酶消化,消化完毕后,可以通过⼄醇沉淀、浓缩DNA⽚段,加少量DNA加样缓冲液点样。
2、消化好的样品点样于0.7%琼脂糖凝胶进⾏电泳;注意:为保证DNA均匀分散于加样孔,应缓慢将样品加⾄加样孔。
Western_Blot详解及问题分析
Western BlotFra bibliotekSDS:
阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电 荷量,消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开,使蛋白质分子线 性化。
Western Blot
Western Blot
Staking gel Separating gel
注意事项: 1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水!最好采用空气浴; 2.电泳Buffer最好不要重复利用,因为样品比较珍贵,而电泳液相对廉价; 3.Buffer一定要漫过梳子孔,否则就会发现蛋白跑不动; 4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶,再换高电压跑分离胶,不要追求速度, 慢慢跑条带会分离的更好,特别是对于高分子量的目的蛋白。
蛋白质-SDS胶束的特点:
(1)具有相同的形状,形状 像一个长椭圆棒
(2)平均1g 蛋白质结合
1.4g SDS (3)短轴对不同的蛋白质亚 基-SDS胶束基本上是相同的 (4)长轴的长度则与亚基分
子量的大小成正比
Western Blot
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时,不再受蛋白质电 荷与形状的影响,而只取决于蛋白质分子量的大小。
Western Blot
Western Blot 流程
蛋白样品的制备
•SDS-PAGE •转膜 •封闭 •一抗杂交 •二抗杂交 •底物显色
Western Blot
蛋白样品的提取
通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系 统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质 最常用的溶剂 。
SouthernBlot印记杂交常见问题解析
Southern Blot印记杂交常见问题解析1、针对不同的实验材料,southern杂交实验难度有差异么?答:不同的实验材料,在进行试验过程中难度差异很大,例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。
(1)、物种本身的基因组较大(例如小麦),检测操作难度大(2)、材料本身含有高糖多酚(例如葡萄)严重影响酶切操作(3)、物种品系复杂(例如玉米),在基因组信息研究层面还不透彻。
2、核酸质量对southern杂交实验的影响答:核酸质量对实验的影响是直接的,既要求客户提供的总量足够——实验消耗(上样量),又要求保证质量——按要求准备材料。
上样量指的是基因组DNA酶切消化后,回收后的DNA片段的量。
根据不同物种的基因组大小不同,上样量也有所区别。
基因组越大,上样量越多。
例如,拟南芥大概需要3ug ,酵母3ug,人8ug,小麦15ug。
酶切消化之后不能直接上样,需要回收纯化。
回收会有损失,最多能损失一半,所以需要客户提供足够量的样品,一般要求至少20 ug的基因组DNA。
(以上上样量均为一个泳道)DNA 样品一般对 OD 值和浓度有如下要求:OD260/280=1.8~2.0,OD260/230>2.0,浓度≥100 ng/ul 。
同时,需要对 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示该 DNA 样品无蛋白质和 RNA 等物质污染,无降解弥散,条带清晰。
(如图所示)3、探针设计是怎么回事,有哪些原则?答:探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列,可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。
探针设计有如下几个原则: (1)、长度适中。
探针的片段长度一般控制在300-1000bp,探针太长时会导致非特异性结合的概率增加,探针太短时,探针结合的地高辛标记物太少,会导致发光信号减弱。
(2)、特异性强。
最佳的探针序列是仅与目的基因同源,与整个基因组序列的同源片段低于30%。
Southernblot(自总结2)
Southern blot (J 版)1. 提取植物总DNA (CTAB法)试剂:1) 2×CTAB提取缓冲液(低于15℃会析出,加入材料前先65℃预热)0.1 mol/L Tris-Cl (pH 8.0)1.4 mol/L NaCl20 mmol/L EDTA (pH 8.0)20 g/L CTAB (2%)20g/L PVP-40(2%)使用前加入2% (体积比) 的巯基乙醇。
步骤:1)提取前将植物材料在暗处放置24小时,以降低材料的淀粉含量。
2)剪取大约1g 叶片,置于研钵中,倒入液氮研成粉末(一定研磨细致,非常重要),分装入2ml离心管中(样品约占0.5ml的体积),每管加入900ul CTAB提取缓冲液,温和彻底的混匀,静置,使裂解彻底。
3)65℃水浴保温1-1.5小时。
4)冷至室温后加900ul 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分温和混匀直到叶片粉末由绿转白(水相,酚相混匀成乳状液)。
5)室温下13,000 rpm离心10 min,吸取上层水相。
6)取上清(约900ul)再用等体积的氯仿:异戊醇 (24:1)再抽提一次。
13,000 rpm离心10min。
7)取上层水相(约700ul),加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
小心倒出每管中液体,将絮状DNA沉淀收集到一个新的 1.5ml EP管中(同一个样品)。
8)用70%乙醇洗涤沉淀3-5次,每次将沉淀适当浸泡以充分洗涤,最后一次稍加离心,将洗涤液尽量去除干净,通风橱中晾干约10min左右(不要过分干燥)。
9)加200ul灭菌的去离子水(或者TE),并加入2ul Rnase A(10mg/ml),37℃保温30-60min溶解沉淀,充分混匀,并消化RNA。
(可直接到第11步)10)(可省步骤)如需做此步骤,则上步中需用700ul ddH2O溶解沉淀,37℃保温消化RNA后再用等体积氯仿:异戊醇 (24:1)抽提,并离心,取上清。