引物设计黄金法则

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与Cross dimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于 4.5 kcal/mol）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△
G值越大，则双链越稳定。

应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。

引物3′端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。

在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：
1)避免重复碱基，尤其是G.
2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.
4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp）。

7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。

对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。

一般情况下，93℃～94℃ 5min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。

此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。

由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。

对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。

复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃150核苷酸/S/酶分子
70℃60核苷酸/S/酶分子
55℃24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。

PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA 片段，延伸时间1min是足够的。

3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。

延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。