酶工程制药
合集下载
第2章第五节 酶工程制药技术基础
⒊化学合成法 采用合成仪进行酶的化学合成和人工合成 改造。 化学合成成本高。 只能合成化学结构清楚的酶。 应用在酶的化学修饰和人工模拟方面。
三、药用酶的修饰
酶的分子修饰：通过各种方法使酶分子的 结构发生改变，从而改变酶的某些特性和 功能的技术过程。 酶的变化：①提高生物学活性 ②增强稳定性 ③降低生物识别能力
第五节 酶工程制药技术基础
一、概述
酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展 而成的生物技术，是通过人工操作获得人们 所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化 功能的技术。 酶工程制药包括药用酶的生产和酶法制药。 药用酶是指具有治疗和预防疾病作用的酶。 酶法制药是在一定条件下利用酶的催化作用， 将底物转化为药物的技术过程。
酶修饰主要方法
⑴侧链集团的化学修饰 巯基的化学修饰
烷基化试剂：碘乙酸和碘乙酰胺，在发生羧甲基 化，防止半胱氨酸的降解。 N-乙基马来酰亚胺：专一性强并伴随光吸收的变 化，可以通过光吸收的变化确定反应的程度 5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB) DTNB可以与巯基反应形成二硫键同时释放一个TNB 阴离子，可以通过光吸收监测反应的程度
修饰后，可导致蛋白质活性丧失，需要去除。去除时用强
碱进行处理。
⑵交联修饰
利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连接在一起。
常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子
中的赖氨酸残基侧链相连接。
⑶定点突变与化学修饰结合法 基因突变技术是通过在基因水平上对其编 码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用 来研究蛋白质结构功能的一种方法。 根据其特点，基因突变分为两类： 定点突变 区域定向突变
⒉酶的固定化方法
⑴吸附法 物理吸附和离子交换吸附。 条件温和，酶的构象变化小，酶与载体之间结合 力弱，易脱落。 ⑵包埋法 载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应， 通过物理作用将酶固定在载体的网格中。 不涉及酶的构象以及酶分子的化学变化，反应条 件温和，酶的回收率高。 扩散限制，催化反应受影响。
第6章 酶工程制药(二)
基因工程技术：通过基因工程技术对酶的基因进行改造和优化，提高酶的产量和稳定性
细胞培养技术：通过ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞培养技术，在细胞内高效表达酶，提高酶的生产效率
发酵工程技术：利用微生物发酵技术，通过优化发酵条件，提高酶的产量和纯度
蛋白质工程技术：通过蛋白质工程技术，对酶的蛋白质结构进行改造和优化，提高酶的活性 和稳定性
酶的提取：从生物材料中分 离和纯化酶的过程
提取和纯化的方法：沉淀法、 色谱法、电泳法等
提取和纯化的目的：获得高纯 度、高活性的酶，用于药物研
发和生产
微生物发酵法：通过微生物发酵产生酶，是最常用的生产方式 基因工程法：通过基因工程技术生产酶，具有更高的生产效率和特异性 化学合成法：通过化学合成方法生产酶，但成本较高且难以大规模生产 提取法：从动植物或微生物中提取酶，但提取量有限且成本较高
酶的化学修饰：通过化学方法对酶进行修饰，改变酶的性质和功能 单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶的组合生物合成：通过组合生物合成技术，将不同酶的基因组合在一起， 形成具有新功能的酶
单击此处输入你的项正文，文字是您思想的提炼，言简意赅的阐述观点。
酶工程在疾病诊断中的应用
蛋白质工程：通过基因工程技术对 酶的蛋白质结构进行改造，提高酶 的催化效率和稳定性
蛋白质与小分子结合：通过将小分 子与酶结合，改变酶的活性和选择 性
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
蛋白质进化：利用进化算法对酶进 行优化，提高酶的适应性和催化效 率
蛋白质与蛋白质结合：通过将不同 的酶结合在一起，形成具有协同作 用的复合酶
酶作为药物的诊断工具：酶可以作为药物的诊断工具，通过催化特定的化学反应，产生信号或 标记，用于诊断疾病或监测治疗效果。
05—酶工程制药
一般健康人体内所含有的某些酶的量是
恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时， 则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引 起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。 故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，
而诊断出某些疾病。
17
（二）用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：
人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀 下来 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀， 而不影响所需的酶
35
复合沉淀法 选择性变性沉 淀法
三、酶的纯化
过滤与膜分离 电泳
离子交换层析
36
第三节 酶和细胞的固定化
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术
水不溶性酶
（固定化酶）
酶应用过程中的一些不足
酶的基础知识
（一）酶是生物催化剂
酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催 化剂。 催化高效性 专一性：结构专一性；立体异构专一性 酶具有不稳定性 反应条件温和
（二）酶的化学本质
单纯酶
酶 蛋白质 结合酶 辅酶 辅因子 辅基 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。
的一种。
多数是蛋白质水解酶，分解发炎部位纤维蛋白的
凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。
其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的
嘌呤和嘧啶，降低脓液的粘性、达到净洁创口、
消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。
主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶，α-淀粉酶、
胰脱氧核糖核酸酶等。
25
血凝和解凝类：这类酶都是从血液中提取出来的。
第六章酶工程制药
13
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
14
24
25
(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
17
18
19
20
21
• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
22
2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米 的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要 求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变 性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。
14
24
25
(四)、固定化酶的形状与性质
1、固定化酶的形状 （1）颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制 备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶 铢。 （2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝 的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。 此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。 （3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可 用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也 可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。
17
18
19
20
21
• （二）固定化细胞的制备 • 1、固定化细胞的定义 • 将细胞限制或定位于特空间位置的 方法，是第二代固定化酶。
22
2、固定化细胞的特点 （1）无需进行酶的分离纯化； （2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高； （3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高； （4）细胞内酶的辅因子可以自动再生； （5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应 （6）抗污染能力强。 3、固定化细胞的制备技术 （1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载 体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶 活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。 （2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。 （3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少 用。 （4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。 23 通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。缺点是机械强度差。
酶工程制药
五、产酶菌株的制备和优化
1、产酶菌株的培养条件
2、菌种的分离筛选 3、菌种的变异诱导技术 4、原生质体诱导实际生产例子
1、产酶菌株的培养条件
（1）产酶促进剂 （2）影响酶产量的各种因素 （3）诱导剂和抑制剂
（1）产酶促进剂
在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物 质就能增加酶的产量，则这类物质就称为产酶 促进剂。 产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是表面活性 剂，常用的产酶促进剂有： （A）吐温-80 （B）脂肪酰胺磺酸钠 （C）聚乙烯醇 （D）糖脂 （E）乙二胺四乙酸（EDTA）
4、裂合酶 天冬氨酸-β -脱羧酶 β -酪氨酸酶 延胡索酸酶 谷氨酸脱羧酶 5、异构酶 氨基酸消旋酶 葡萄糖异构酶
（来源于细菌） （来源于细菌） （来源于细菌） （来源于细菌）
（来源于细菌、霉菌、酵母） （来源于细菌、放线菌
四、酶的生产菌种
1、对生产菌种的要求 （1）产酶量高、酶的性质应符合使用要求，最好是产 生胞外酶的微生物菌种 （2）不能含有致病菌，系统发育应该与病原体无关， 也不会产生毒素 （3）菌种稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体 （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养
第四章
酶工程制药
第一节 酶工程制药概论 第二节 药用酶的来源和生产
第三节 固定化酶工程
第四节 酶工程研究进展 第五节 酶工程应用实例
第一节 酶工程制药概论
一、酶的定义和分类 二、酶的特性 三、酶的来源 四、酶的生产菌种
五、产酶菌株的制备和优化
酶工程制药是将细胞或活细胞固定化后用于药 品生产的技术。 现代酶工程制药的基本技术主要包括酶和细胞 固定化、酶的非水相催化、酶法的手性药物合 成、酶的化学修饰技术
第七章 酶工程制药
酶由国际酶学委员会分为六大类： 氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、 裂合酶类、异构酶类、合成酶类。
二、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发 展而形成一门新的技术学科。 它是从应用的目的出发研究酶、应用酶 的特异性催化功能，并通过工程化将相应 原料转化成有用物质的技术。
20世纪20年代初出现，当时主要是自然 酶制剂在工业上的大规模应用，1953年提 出固定化酶技术，1969年利用该技术成功 拆分了混旋氨基酸。 1971年第一届国际酶工程会议提出的酶 工程主要内容是：酶的生产、分离、纯化、 固定化、固定化的反应器、酶与固定化酶 的应用。
五、提高药用酶产量的措施 1、添加诱导物 诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产Байду номын сангаас量显著提高。 乳糖诱导β -半乳糖苷酶，纤维二糖诱 导纤维素酶。 诱导物可分为三种：酶的作用底物、酶 的反应产物、酶的底物类似物。
2、控制阻遏物浓度 有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用， 应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。 3、添加表面活性剂 表面活性剂的离子型对细胞有毒害作用， 只能使用非离子型表面活性剂， 表面活性剂可聚集在细胞膜上，增加细 胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的 产量。
酶和细胞固定化模式
4、酶和细胞的固定化载体 （1）吸附载体：（物理吸附、离子吸附）矾 土、膨润土、活性炭、氧化铝、纤维素、 碳酸钙等。 （2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶等。 （3）共价结合载体：纤维素、琼脂、聚丙烯 酰胺等。
5、固定化酶制备技术 （1）吸附法制备固定化酶技术 （2）包埋法制备固定化酶技术 ①界面沉降法；②界面聚合法 （3）交联法制备固定化酶技术 （4）共价结合法制备固定化酶技术
第七章
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
第4讲酶工程制药技术1
从猪心中提取辅酶Q10，从槐花米中提取芦丁， 从提取链霉素后的废液中提取B12等。
维生素C的生产工艺
❖ VC是细胞氧化-还原反应中的催化剂，参与机体 新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。用于防止 坏血酸和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合， 以及用作辅助药物治疗。
VC化学结构和性质
白 色 粉 末 ， 无 臭 、 味 酸 、 熔 点 190192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶 于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还 原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在 碱液中或有微量金属离子存在时，分解 更快，但干燥结晶较稳定。
❖ 又称为连接酶，能够催化一切必须与ＡＴＰ分解 相偶联的，并由两种物质合成一种物质的反应。
❖ A + B + ATP + H-O-H → A3/4B + ADP +Pi
核酸类酶（R酶）的分类与命名
❖ 核酸类酶的分类原则
❖ （1）根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是 其他分子，将核酸类酶分为分子内催化R酶和分 子间催化R酶两大类。
❖ （2）在每个大类中根据酶的催化类型不同，将 R酶分为若干亚类。
1、分子内催化R酶
❖ 分子内催化酶是催化本身RNA分子进行反应的一 类核酸类酶。
❖ （1）自我剪切酶：在一定条件下催化本身RNA 分子进行剪切反应的R酶。它们都是RNA前体， 可以在一定条件下进行自我催化，使RNA前体生 成成熟的RNA分子和另一个RNA片断。
蛋白类酶（P酶）的分类
❖ 根据酶的催化作用类型，将已知蛋白类酶分为六 大类：
❖ （1） 氧化还原酶类 ❖ （2） 转移酶类 ❖ （3） 水解酶类 ❖ （4） 解（合）酶类 ❖ （5） 异构酶类 ❖ （6） 合成酶类
❖ （1） 氧化还原酶类
维生素C的生产工艺
❖ VC是细胞氧化-还原反应中的催化剂，参与机体 新陈代谢，增加机体对感染的抵抗力。用于防止 坏血酸和抵抗传染性疾病，促进创伤和骨折愈合， 以及用作辅助药物治疗。
VC化学结构和性质
白 色 粉 末 ， 无 臭 、 味 酸 、 熔 点 190192℃，易溶于水，略溶于乙醇，不溶 于乙醚，氯仿及石油醚等。它是一种还 原剂，易受光、热、氧等破坏，尤其在 碱液中或有微量金属离子存在时，分解 更快，但干燥结晶较稳定。
❖ 又称为连接酶，能够催化一切必须与ＡＴＰ分解 相偶联的，并由两种物质合成一种物质的反应。
❖ A + B + ATP + H-O-H → A3/4B + ADP +Pi
核酸类酶（R酶）的分类与命名
❖ 核酸类酶的分类原则
❖ （1）根据酶作用的底物是其本身RNA分子还是 其他分子，将核酸类酶分为分子内催化R酶和分 子间催化R酶两大类。
❖ （2）在每个大类中根据酶的催化类型不同，将 R酶分为若干亚类。
1、分子内催化R酶
❖ 分子内催化酶是催化本身RNA分子进行反应的一 类核酸类酶。
❖ （1）自我剪切酶：在一定条件下催化本身RNA 分子进行剪切反应的R酶。它们都是RNA前体， 可以在一定条件下进行自我催化，使RNA前体生 成成熟的RNA分子和另一个RNA片断。
蛋白类酶（P酶）的分类
❖ 根据酶的催化作用类型，将已知蛋白类酶分为六 大类：
❖ （1） 氧化还原酶类 ❖ （2） 转移酶类 ❖ （3） 水解酶类 ❖ （4） 解（合）酶类 ❖ （5） 异构酶类 ❖ （6） 合成酶类
❖ （1） 氧化还原酶类
第五章 酶工程制药技术
抗炎净创类：目前在治疗上发展最快。 多数为蛋白水解酶，分解发炎部纤维蛋白的凝结物，
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
消除伤口周围坏疽、腐肉和碎屑。 有些可以分解脓液中核蛋白，达到净洁创口、消炎
目的。 主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶。
➢ 血凝和解凝类：这类从血液中提取。 凝血酶 使血液凝固，防止微血管出血
纤维蛋白溶解酶 溶解血块，治疗血栓静脉炎、 冠状动脉栓塞。
➢ 作用力：离子键
➢ 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖 凝胶、CM-纤维素
优点：条件温和，操作简便，酶活力损 失少。
缺点：结合力弱，易解吸附。
➢ 2.共价偶联法
借助共价键将酶 的活性非必需侧 链基团和载体的 功能基团进行偶 联。
➢ （1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
➢ （3）水解酶：
催化由水分子介入使基质共价键水解反应，切断键有酯键、糖苷键、醚键、 肽键。
➢ （4）裂解酶：
催化用水解以外的方法使原子团和基质分离，在基质上生成双键反应，
➢ （5）异构酶：
催化不伴有基质分子水解、转移、氧化还原的分子异构反应。
➢ （6）连接酶：
催化将ATP或类似三磷酸化合物的焦磷酸键切断，使连个分子连接反应。
第五章 酶工程制药技术
重点内容：酶固化技术；
第一节 酶工程概述
➢ 一、酶工程简介（Enzyme Engineering） 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合和
发展而成的一门新的技术学科。它是从应 用的目的出发研究酶、应用酶的特殊催化 性能，并通过工程化将相应原料转化成有 用物质的技术。
➢ 酶工程这个名字出现在20世纪20年代，主 要指自然酶制剂在工业上的规模应用。
纤维素
葡聚糖凝胶
酶工程制药BETA
高效合成。同时，通过对发酵过程的优化和控制，可以提高产物的纯度
和收率。
03
酶工程制药工艺流程
原料选择与预处理
原料选择
选择适合酶催化反应的底物，如生物 大分子、有机小分子等，确保原料的 纯度和质量。
预处理
对原料进行必要的预处理，如破碎、 溶解、除杂等固定化技术
固定化方法
酶的固定化可以通过物理吸附、化学交联、包埋法等方法实现， 将酶固定在载体上，提高酶的稳定性和重复使用性。
固定化酶的性质
固定化酶具有与游离酶相似的催化活性，同时具有良好的稳定性、 可重复使用性和易于与产物分离等优点。
固定化酶的应用
固定化酶在药物合成中可以用于连续反应、多步反应和固定床反应 器等，提高药物合成的效率和经济性。
血管紧张素转化酶抑制剂 生产
利用酶工程技术改进血管紧张素转化酶抑制 剂生产工艺，提高产量和纯度。采用固定化
酶技术降低生产成本和简化操作。
06
酶工程制药挑战与解决方案
技术挑战及应对策略
酶的表达与纯化
提高酶的表达水平，优化纯化方法，以获得高纯度、高活性的酶 制剂。
酶的固定化与修饰
研究新的固定化方法和修饰技术，提高酶的稳定性、选择性和催化 效率。
性、密封性等因素。
操作方法和注意事项
发酵罐操作前应检查设备是否完好，对培养基和接种物进行预处理，控 制好温度、pH、溶氧等参数，避免污染和发酵异常。
离心机操作前应检查设备是否平衡，选择合适的转子和转速，控制好进 料速度和分离时间，避免设备过载和酶活性损失。
层析柱操作前应选择合适的层析介质和缓冲液，对样品进行预处理，控 制好流速和洗脱条件，避免层析柱堵塞和酶活性损失。同时应注意设备 的清洗和保养，以延长使用寿命。
08酶工程制药
消除抗原性
酶
精氨酸酶 尿酸酶
从游离酶到固定化酶 固定化的方法 固定化酶的性质 固定化细胞
固定化酶的最大特点：既具有生物催化剂的功能， 又具有固相催化剂的特性。
从游离酶到固定化酶
固定化酶的优点
从游离酶到固定化酶 固定化的方法 固定化酶的性质 固定化细胞
1、可以多次使用，且酶的稳定性提高
固定化的葡萄糖异构酶：60-65℃，1000h 固定化黄色短杆菌的延胡索酸酶：反应1年活力不变
主要技术包括: 药用酶的发酵生产 药用酶的分离纯化 药用酶的分子修饰
S1 酶工程制药概述
酶法制药 药用酶的生产
S1 酶工程制药概述
酶法制药 药用酶的生产
S1 酶工程制药概述
酶法制药 药用酶的生产
S1 酶工程制药概述
至2004年2月美国FDA批准的生物技术药物
产品 Reteplase，t-PA突变体 Rasburicase，尿酸降解酶 alteplase, tPA urokinase，尿激酶 Laronidase，粘多糖--L艾杜糖醛酸水解酶 Imiglucerase，葡糖脑苷脂 酶 Algasidase beta，半乳糖 苷酶- dornase alfa，DNA酶 Tenecteplase，t-PA突变体 商品名 Retavase(大肠杆菌) Elitek(酵母) Activase (CHO) Abbokinase(胎肾细胞) Aldurazyme (CHO) Cerezyme (CHO) Fabrazyme (CHO) Pulmozyme (CHO) TNKase (CHO) 公司 Centocor SanofiSynthelabo Genentech Abbott Genzyme Genzyme Genzyme Genentech Genentech 首次批 准时间 1996.10 2002.7 1987.11 2002.10 2003.4 1994.5 2003.4 1993.12 2000.6
第六章酶工程制药
工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶， 工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是 微生物发酵法生产的。其特点是： 微生物发酵法生产的。其特点是： A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都能从微生物中得 、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶， 到； B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提 、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便， 高酶的产量； 高酶的产量； C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的 、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段， 高产菌珠。 高产菌珠。
11
第二节、 第二节、酶的来源和生产菌 1、酶的来源： 、酶的来源： 提取分离、 提取分离、 化学合成、 化学合成、 细胞培养、 细胞培养、 微生物发酵
12
酶的生产目前多以直接从生物体中提取分离。 酶的生产目前多以直接从生物体中提取分离。 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、 木瓜蛋白酶。 年来， 木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、 年来 研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、 成本高。 成本高。
16
第三节、 细胞、 第三节、酶、细胞、原生质体的固定化
（一）固定化酶的制备 固定化酶（ enzyme）的定义: 1971年 1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:（1971年）指限制或固定于特 定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即 运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固 酶的固 定化。固定化所采用的酶 固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或 定化 固定化所采用的酶 细胞碎片上的酶或酶系。 2、固定化酶的特点 （1）可以多次使用，酶的稳定性提高； （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制； （4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少； （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。 3、酶和细胞的固定化方法 载体结合法： （1）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。 物理吸附法： A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。 优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定 优点 化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。
酶工程制药
• 交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2,2-二磺 酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、己二酰亚胺 二甲酯。 • 酶蛋白功能团：N -末端α-氨基、赖氨酸的 ε-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基 • 共价键结合 • 反应条件强烈、酶活性回收较低（降低交联 剂浓度、缩短反应时间）
• 交联法固定化酶颗粒小、结构性能差、酶活 性低，常与吸附法或包埋法联用。 • 酶的功能基团参与反应致活性中心结构改变、 酶活性降低 • 添加辅助蛋白（牛血清白蛋白）提高稳定性。
• 异构酶类（topoisomerase II）
• 合成酶（连接酶）类（glutamine synthetase）
二、酶工程（Enzyme Engineering）
• 是酶学与工程学相互渗透结合、发展而
形成的新的技术学科。从应用的目的出
发研究酶，应用酶的特异催化功能通过
工程化将相应的原料转化成有用物质的 技术。
酶、细胞的固定化方法
载体结合法
交联法
包埋法
物 理吸 附 法
离 子 结 合 法
共 价 结 合 法
网 格 型
微 囊 型
热处理 （细胞）
1）载体结合法
• 将酶结合于不溶性载体上
• 物理吸附法：无机载体、天然高分子载体、 大孔型合成树脂、陶瓷、含疏水基载体。
优点：易操作，可选用不同电荷与形状载体， 固定化与纯化过程同时进行，酶失活后载体 可再生。
• 缺点：最适吸附酶量无规律可循，不同 载体或酶的吸附条件不同，吸附量与酶 活力不一定呈平行关系，酶与载体结合 力不强、易脱落，致酶活力下降并污染 产物。
• 离子结合法：通过离子键结合于具有离子 交换基的水不溶性载体上。多糖类离子交 换剂、合成高分子离子交换树脂。
第五章酶工程制药
• 翻译过程分为4个阶段。 • 1 氨基酸活化生成氨酰—tRNA • 2 肽链合成的起始 • 3 肽链的延伸 • 4 肽链合成的终止 • （生物制药技术263-265）
• 提高药用酶产量的措施
• 在酶的发酵生产过程中，为了提高酶产 量，除了选育优良的产酶细胞，保证发 酵工艺条件升根据需要和变化情况及时 加以调节控制以外，还可以采取某些行 之有效的措施，诸如：添加诱导物、控 制阻遏物浓度、添加表面活性剂或其他 产酶促进剂等。
• (3)化学合成法
• 化学合成法是60午代中期出现的新技术。 1965年，我国人工合成胰岛素的成功， 开辟了蛋白质化学合成的新纪元。
• 酶生物合成及其调节理论 ；
• 到目前为止，已知的近3000种酶都是蛋 白质，此外还发现核酸类酶ribosome是具 有生物催化活性的RNA。所以酶的生物 合成主要是RNA和蛋白质的合成过程。
• 2．酶的催化效率高
• 酶的催化效率比一般的非酶催化剂高得 多．有的可高达几百亿倍。例如，双氧 水(H2O2)可以在铁离子或过氧化氢酶的 催化作用下分解成为氧和水。在一定条 件下．1mol铁离子可分解10-3mol H2O2在 相同条件下，1mol过氧化氢酶却可催化 105molH2O2，使其分解。过氧化氢酶的 催化效率是铁离子的1010倍
• 1969年，日本的学者首次在工业生产规 模应用固定化氨基酰化酶从D，L—氨基 酸连续生产L—氨基酸．实现了酶应用史 上的一大变革。此后，固定化技术迅速
• 发展促使酶工程作为一个独立的学科从 发酵工程中脱颖而出。
• 在1971午召开的第一次国际酶工程学术 会议上．确定固定化酶的 统一英文名称 为Immobilized Enzyme
• pH值之所以影响酶的催化作用，主要是 由于在不同的pH条件下，酶分子和底物 分子的解离状态不同，从而影响酶促反 应的进行。
酶工程在制药领域的应用
酶工程在制药领域的应用
酶工程是一种利用生物酶的特异性和高效性进行化学反应的技术。
在制药领域，酶工程已经成为一种重要的技术手段。
以下是酶工程在制药领域的应用的几个方面：
一、酶制剂
酶制剂是指将酶固定在载体上，形成一种稳定的酶催化系统。
酶制剂可以在制药过程中用于催化反应，提高反应速率和选择性。
例如，葡萄糖氧化酶制剂可以用于制备葡萄糖酸钙，而α-淀粉酶制剂可以用于制备麦芽糖。
二、酶催化合成
酶催化合成是指利用酶催化反应，合成药物分子。
酶催化合成可以提高反应速率和选择性，减少副反应和废弃物的产生。
例如，通过酶催化合成可以合成头孢菌素类抗生素和阿司匹林等药物。
三、酶催化反应的控制
酶催化反应的控制是指通过调节反应条件，控制酶催化反应的速率和选择性。
例如，通过调节温度、pH值、底物浓度等反应条件，可以控制酶催化反应的速率
和选择性，从而得到高纯度的药物。
四、酶在药物代谢中的作用
酶在药物代谢中起着重要的作用。
药物在体内被代谢成代谢产物，其中大部分是通过酶催化反应完成的。
例如，肝脏中的细胞色素P450酶可以代谢许多药物，包括抗癌药物、抗生素和镇痛药等。
总之，酶工程在制药领域的应用非常广泛，可以提高药物的生产效率和质量，减少废弃物的产生，同时也可以为新药的研发提供技术支持。
酶工程制药
3
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
3
3．作用条件温和（酶易失活）
酶是蛋白质，对环境条件极为敏感，凡能使蛋白 质变性的物理或化学的因素都能使酶丧失活性； 酶也常因温度、PH等的轻微改变或抑制剂的存在 使其活性发生变化。酶作用一般要求比较温和的 条件，如常温、常压、接近中性的PH值等。
4．酶活力的可调节性：
酶促反应受多种因素的调控，以适应机体不断变 化的内外环境和生命活动的需要。
26 26
青霉素
1932年由Fleming首次发现 占据全世界19% 的抗生素市场 作用机理是抑制细菌细胞壁的形成 具有广谱抗菌作用 低毒 杀菌作用强 是一种酸性物质，性质不稳定 大量长期普遍使用使致病菌对青霉素具有耐药性
27 27
6-APA
6-APA由青霉素酰化酶水解除去侧链后而成， 是生产半合抗青霉素类抗生素氨苄钠和阿莫 西林的重要中间体。
14 14
4、多酶复合体（multienzyme complex）： 多酶复合体又命多酶体系，是由几种功能相关的
酶嵌合形成的复合体。它有利于一系列反应的连 续进行，以提高酶的催化效率，同时便于机体对 酶的调控。相对分子量都很高，一般都在几百万 以上。
15 15
酶工程的概念
酶工程（Enzyme Engineering） 是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术 科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特 异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用 物质的技术。
23 23
许多化合物的结构都是对映性的，好像人的左右 手一样，这被称作手性。
药物中也存在这种特性，在有些药物成份里只有 一部分有治疗作用，而另一部分没有药效甚至有 毒副作用。这些药是消旋体，它的左旋与右旋共 生在同一分子结构中。人们认识到将消旋体药物 拆分的重要性。
第7章酶工程制药
第7章酶工程制药
⒉固定化酶的性质 ⑴酶活力的变化 ⑵酶稳定性的变化
①操作稳定性 ②贮藏稳定性 ③热稳定性 ④对蛋白酶的稳定性
第7章酶工程制药
⑶酶学特性的变化 ①底物专一性 ②最适pH ③最适温度 ④米氏常数 ⑤最大反应速度
第7章酶工程制药
五、固定化细胞的形状与性质 ⒈固定化细胞的形状 ⒉固定化细胞的性质
第7章酶工程制药
α-环糊精的分子结构
第7章酶工程制药
第7章酶工程制药
⒌固定化酶制备技术 ⑴吸附法制备固定化酶技术 ⑵包埋法制备固定化酶技术 ①界面沉降法 ②界面聚合法 ⑶交联法制备固定化酶技术 ⑷共价结合法制备固定化酶技术
第7章酶工程制药
二、固定化细胞的制备
⒈固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位 置的方法称为细胞固定化技术。 被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。
第7章酶工程制药
⒊添充床反应器 固定化酶添充于床层内。反应器 内的流体的流动形态为平推流形。 底物以恒定流速通过反应床。
第7章酶工程制药
⒋流化床反应器 底物以足够大的流速向上通过固定化 酶床层，使固体颗粒处于流化状态， 达到混合的目的。
⒌循环反应器 部分反应液流出和新加入底物流入液 混合，在进入反应床进行循环。
第七章 酶工程制药
第7章酶工程制药
第一节 概 述
一、酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化 功能的一类蛋白质。其特点： ①催化效率高 ②专一性强 ③反应条件温和 ④催化活性受到调节和控制
第7章酶工程制药
二、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗 透结合发展而形成一门新的技 术学科。它是从应用的目的出 发研究酶、应用酶的特异性催 化功能，并通过工程化将相应 原料转化成有用物质的技术。
⒉固定化酶的性质 ⑴酶活力的变化 ⑵酶稳定性的变化
①操作稳定性 ②贮藏稳定性 ③热稳定性 ④对蛋白酶的稳定性
第7章酶工程制药
⑶酶学特性的变化 ①底物专一性 ②最适pH ③最适温度 ④米氏常数 ⑤最大反应速度
第7章酶工程制药
五、固定化细胞的形状与性质 ⒈固定化细胞的形状 ⒉固定化细胞的性质
第7章酶工程制药
α-环糊精的分子结构
第7章酶工程制药
第7章酶工程制药
⒌固定化酶制备技术 ⑴吸附法制备固定化酶技术 ⑵包埋法制备固定化酶技术 ①界面沉降法 ②界面聚合法 ⑶交联法制备固定化酶技术 ⑷共价结合法制备固定化酶技术
第7章酶工程制药
二、固定化细胞的制备
⒈固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位 置的方法称为细胞固定化技术。 被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。
第7章酶工程制药
⒊添充床反应器 固定化酶添充于床层内。反应器 内的流体的流动形态为平推流形。 底物以恒定流速通过反应床。
第7章酶工程制药
⒋流化床反应器 底物以足够大的流速向上通过固定化 酶床层，使固体颗粒处于流化状态， 达到混合的目的。
⒌循环反应器 部分反应液流出和新加入底物流入液 混合，在进入反应床进行循环。
第七章 酶工程制药
第7章酶工程制药
第一节 概 述
一、酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化 功能的一类蛋白质。其特点： ①催化效率高 ②专一性强 ③反应条件温和 ④催化活性受到调节和控制
第7章酶工程制药
二、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗 透结合发展而形成一门新的技 术学科。它是从应用的目的出 发研究酶、应用酶的特异性催 化功能，并通过工程化将相应 原料转化成有用物质的技术。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
其具有一定的工业应用价值；
②贮藏稳定性； ③对蛋白酶的稳定性。 ④热稳定性
（3）酶学特性的变化
底物专一性、 最适pH、 最适温度、 米氏常数 最大反应速度等，均可能发生变化。
五、固定化细胞的形状和性质
1、固定化细胞的形状
具有珠状、块状、片状或纤维状等。
工业上应用较多的是包埋法制备的固定化细胞。
2、固定化细胞的性质 一般是利用其胞内酶，底物和产物必需是小分子。
结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。 2、酶和细胞的固定化方法
载体结合法、包埋法及交联法
酶和细胞的固定化方法
载体结合法 交联法 包埋法
网格型
微囊型
热处理 （细胞）
物理吸附法 离子结合法 共价结合法
固定化
E E
E
E E 吸附法
E
E E
E E E
E E E E E E E
E
共价结合法
交联法
固定化酶的优点：
①可多次使用，酶的稳定性提高。 ②酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高；
③反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；
④酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少； ⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。
一、固定化酶的制备
1、固定化所采用的酶：
经提取分离后得到的有一定纯度的酶，
六、固定化酶活力的测定方法
可用在单位时间内，单位体积中的底物减少量或
产物增加量来表示。 在酶促反应中，如底物具有光吸收、旋光、电位 差或荧光等性质的变化，可以进行直接测定。 分批测定法和连续测定法。
第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器
一、反应器的类型和特点 间歇式搅拌反应器（BSTR） 连续流动搅拌反应器（CSTR） 填充床反应器（packed bed reactor, PBR） 流化床反应器（fulidized bed reactor, FBR） 连续流动搅拌罐-超滤膜反应器（CSTR/UF） 其它
酶工程制药
提纲
第一节 概述 第二节 酶的来源和生产 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第五节 酶工程在医药工业中的应用
第一节 概述
一、酶的特性 酶：有催化能力的蛋白质
酶促反应（酶催化反应）
酶催化反应的特点：
一般特点：①能加快反应速度；②降低反应活化 能；③不改变反应的平衡点；④反应前后数量和 性质不变 独特特点：①催化效率高；②专一性强；③反应 条件温和；④酶的催化活性受到调节和控制。
青霉素G
转化液
过滤
滤液
抽提
6-APA
二、固定化酶法生产L-氨基酸
营养、药物、增味剂等；
技术路线
DL-氨基酸
乙酰化
N-乙酰-DL-氨基酸 氨基酰化酶 消旋 水解 N-乙酰-D-氨基酸 L-氨基酸
氨基酰化酶：离子交换法，DEAE-葡聚糖载体， 填充床反应器
三、有机相的酶反应
1、有机相酶反应的特点
增加疏水性底物或产物的溶解度； 热力学平衡向合成方向移动，如酯合成； 抑制有水参与的反应，如酸酐的水解； 酶不溶于有机介质，易于回收再利用；
高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的
方法。
（4）选择性热变性法
专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理
使细胞膜蛋白变性但不使酶变形而使酶固定于细
胞内的方法。
4、酶和细胞的固定化载体
固定化载体必须符合一定的条件：
①固定化过程不引起酶变性； ②对酸碱有一定的耐受性； ③有一定的机械强度; ④有一定的亲水性及良好的稳定性； ⑤有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； ⑥共价结合时具有可活化基团； ⑦有耐受酶和微生物细胞的能力； ⑧廉价易得。
三、有机相的酶反应
2、有机相酶反应的溶剂体系
水-水溶性有机溶剂均相体系； 水-水不溶性溶剂两相体系； 反相胶束体系； 单相有机溶剂体系；
三、有机相的酶反应
3、有机相酶的酶工程
酶的固定化：载体吸附法和凝胶包埋法； 酶的化学修饰和表面活性剂包埋；
4、应用
脂肪酶催化的不对称合成反应，制备医药中间体； 脂肪酶催化的合成和酯交换反应，制备抗生素和香料。
机械强度。
微囊化法——将酶或细胞固定于不同构型的膜的外壳内
的技术。有界面沉降法和界面聚合法两种。
（3）交联法制备固定化酶技术
交联酶法：主要是通过多功能试剂使酶分子间形成 网络结构而固定化 酶-辅助蛋白交联法：是指向酶溶液中加入辅助蛋白的 交联过程，酶活回收率和机械强度较交联酶法高。 吸附交联法：吸附与交联相结合的方法 载体交联法：利用多功能试剂分子的一些化学基团与载 体偶联而另一些化学基团与酶分子偶联的方法。
（4）共价结合法制备固定化酶技术
共价结合法：通过酶分子的非活性基团与载体表面
的活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接
法。
二、固定化细胞的制备
1、固定化细胞
固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系，它的应用比固定化酶
更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶
绿体及微粒体等细胞器的固定化。
2、固定化细胞的特点
改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。
3、目前常用的产酶微生物：
大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、青霉菌、
木霉菌、根霉菌、链霉菌等。
第三节 酶和细胞的固定化
酶反应几乎都在水溶液中进行，自然简便 缺点是游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且 会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量； 另外溶液酶很不稳定，容易变性和失活。
填充床反应器
二、反应器的选择依据
1、根据固定化酶的形状来选择
2、根据底物的物理性质来选择 3、根据酶反应动力学特性来选择 4、根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择
5、根据操作要求及反应器费用来选择
第五节 酶工程在医药工业中的应用一、固定化细胞来自生产6-氨基青霉烷酸 技术路线
培养 明胶包埋-戊二醛交联 E.coli 斜面 细胞 固定化细胞（颗粒状） 填充床式反应器
（2）交联法
原理：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物
的细胞与细胞之间交联的固定化方法。
常用的交联剂有戊二醛等。
缺点：反应条件强烈，固定化酶的酶活较低； 优点：酶的稳定性提高。
交联方式
最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分 子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联： —CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CHN CH (CH2)3 N CH (CH2)3
二、酶工程简介
⑤有机相中酶反应的研究； ⑥酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究； ⑦抗体酶、核酸酶的研究； ⑧模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研 究。
第二节 酶的来源和生产
一、酶的来源：主要是动植物和微生物
利用微生物生产酶的优点是： ①微生物种类繁多，动植物体内存在的酶，几乎都 可从微生物中得到； ②微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过 控制培养条件来提高酶的产量； ③微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段， 能培育出新的高产菌株。
③共价结合法：
原理：酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、 巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固 定在载体上。
在共价结合法中必须首先使载体活化，即使载体获得能与 酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团；
共价结合法的优缺点
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落。 缺点：反应条件剧烈，往往不能得到比活性高的固 定化酶，甚至酶的专一性等性质也会发生变化。
CH
N
CH
N
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-
交联法
常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶 （蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；
常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如
牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。
（3）包埋法
网格型、微囊型
网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等 合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然
四、基因工程酶的构建
酶基因的克隆和表达； 酶基因的遗传修饰：定点突变； 酶的遗传设计；
复习题
1、按酶所催化的反应类型将酶分成哪6大类？ 2、酶催化反应的特点是什么？ 3、酶和细胞的固定化方法有那些？ 4、什么是模拟酶？什么是分子印迹？ 5、有机相酶反应的特点是什么？
二、酶的生产菌
1、对菌种的要求：
（1）产酶量、酶的性质、最好是胞外酶； （2）不是致病菌； （3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
2、生产菌的来源：
菌种保藏机构和有关研究部门，
从自然界中分离筛选——菌样采集、菌种分离初
筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。
于各种类型的反应器。
（2）纤维状固定化酶
适用于填充床反应器，已有多种酶膜制备出来。
（3）管状固定化酶
已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管。
2、固定化酶的性质
（1）酶活力的变化
一般酶活力下降，可在固定化反应体系中加入 抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。
（2）酶稳定性的变化
①操作稳定性，半衰期在1个月以上，可以认为
吸附载体:主要有物理吸附和离子吸附两种。 包埋载体:目前工业用的包埋载体主要有卡拉胶、海藻胶等。
共价结合载体:
纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。 交联法是通过双或多功能试剂进行固定化，因此不需要固定化 载体。也可用与吸附法和包埋法相同的载体进行交联。
5、固定化酶的制备技术
三、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择 考虑安全性、稳定性、固定化的成本
2、载体选择 性能好、价格便宜
②贮藏稳定性； ③对蛋白酶的稳定性。 ④热稳定性
（3）酶学特性的变化
底物专一性、 最适pH、 最适温度、 米氏常数 最大反应速度等，均可能发生变化。
五、固定化细胞的形状和性质
1、固定化细胞的形状
具有珠状、块状、片状或纤维状等。
工业上应用较多的是包埋法制备的固定化细胞。
2、固定化细胞的性质 一般是利用其胞内酶，底物和产物必需是小分子。
结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。 2、酶和细胞的固定化方法
载体结合法、包埋法及交联法
酶和细胞的固定化方法
载体结合法 交联法 包埋法
网格型
微囊型
热处理 （细胞）
物理吸附法 离子结合法 共价结合法
固定化
E E
E
E E 吸附法
E
E E
E E E
E E E E E E E
E
共价结合法
交联法
固定化酶的优点：
①可多次使用，酶的稳定性提高。 ②酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高；
③反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；
④酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少； ⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。
一、固定化酶的制备
1、固定化所采用的酶：
经提取分离后得到的有一定纯度的酶，
六、固定化酶活力的测定方法
可用在单位时间内，单位体积中的底物减少量或
产物增加量来表示。 在酶促反应中，如底物具有光吸收、旋光、电位 差或荧光等性质的变化，可以进行直接测定。 分批测定法和连续测定法。
第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器
一、反应器的类型和特点 间歇式搅拌反应器（BSTR） 连续流动搅拌反应器（CSTR） 填充床反应器（packed bed reactor, PBR） 流化床反应器（fulidized bed reactor, FBR） 连续流动搅拌罐-超滤膜反应器（CSTR/UF） 其它
酶工程制药
提纲
第一节 概述 第二节 酶的来源和生产 第三节 酶和细胞的固定化 第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器 第五节 酶工程在医药工业中的应用
第一节 概述
一、酶的特性 酶：有催化能力的蛋白质
酶促反应（酶催化反应）
酶催化反应的特点：
一般特点：①能加快反应速度；②降低反应活化 能；③不改变反应的平衡点；④反应前后数量和 性质不变 独特特点：①催化效率高；②专一性强；③反应 条件温和；④酶的催化活性受到调节和控制。
青霉素G
转化液
过滤
滤液
抽提
6-APA
二、固定化酶法生产L-氨基酸
营养、药物、增味剂等；
技术路线
DL-氨基酸
乙酰化
N-乙酰-DL-氨基酸 氨基酰化酶 消旋 水解 N-乙酰-D-氨基酸 L-氨基酸
氨基酰化酶：离子交换法，DEAE-葡聚糖载体， 填充床反应器
三、有机相的酶反应
1、有机相酶反应的特点
增加疏水性底物或产物的溶解度； 热力学平衡向合成方向移动，如酯合成； 抑制有水参与的反应，如酸酐的水解； 酶不溶于有机介质，易于回收再利用；
高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的
方法。
（4）选择性热变性法
专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理
使细胞膜蛋白变性但不使酶变形而使酶固定于细
胞内的方法。
4、酶和细胞的固定化载体
固定化载体必须符合一定的条件：
①固定化过程不引起酶变性； ②对酸碱有一定的耐受性； ③有一定的机械强度; ④有一定的亲水性及良好的稳定性； ⑤有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； ⑥共价结合时具有可活化基团； ⑦有耐受酶和微生物细胞的能力； ⑧廉价易得。
三、有机相的酶反应
2、有机相酶反应的溶剂体系
水-水溶性有机溶剂均相体系； 水-水不溶性溶剂两相体系； 反相胶束体系； 单相有机溶剂体系；
三、有机相的酶反应
3、有机相酶的酶工程
酶的固定化：载体吸附法和凝胶包埋法； 酶的化学修饰和表面活性剂包埋；
4、应用
脂肪酶催化的不对称合成反应，制备医药中间体； 脂肪酶催化的合成和酯交换反应，制备抗生素和香料。
机械强度。
微囊化法——将酶或细胞固定于不同构型的膜的外壳内
的技术。有界面沉降法和界面聚合法两种。
（3）交联法制备固定化酶技术
交联酶法：主要是通过多功能试剂使酶分子间形成 网络结构而固定化 酶-辅助蛋白交联法：是指向酶溶液中加入辅助蛋白的 交联过程，酶活回收率和机械强度较交联酶法高。 吸附交联法：吸附与交联相结合的方法 载体交联法：利用多功能试剂分子的一些化学基团与载 体偶联而另一些化学基团与酶分子偶联的方法。
（4）共价结合法制备固定化酶技术
共价结合法：通过酶分子的非活性基团与载体表面
的活泼基团之间发生化学反应而形成共价键的连接
法。
二、固定化细胞的制备
1、固定化细胞
固定化细胞主要利用细胞内酶及酶系，它的应用比固定化酶
更普遍。如今该技术已扩展至动植物细胞，甚至线粒体、叶
绿体及微粒体等细胞器的固定化。
2、固定化细胞的特点
改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。
3、目前常用的产酶微生物：
大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、青霉菌、
木霉菌、根霉菌、链霉菌等。
第三节 酶和细胞的固定化
酶反应几乎都在水溶液中进行，自然简便 缺点是游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且 会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量； 另外溶液酶很不稳定，容易变性和失活。
填充床反应器
二、反应器的选择依据
1、根据固定化酶的形状来选择
2、根据底物的物理性质来选择 3、根据酶反应动力学特性来选择 4、根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择
5、根据操作要求及反应器费用来选择
第五节 酶工程在医药工业中的应用一、固定化细胞来自生产6-氨基青霉烷酸 技术路线
培养 明胶包埋-戊二醛交联 E.coli 斜面 细胞 固定化细胞（颗粒状） 填充床式反应器
（2）交联法
原理：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物
的细胞与细胞之间交联的固定化方法。
常用的交联剂有戊二醛等。
缺点：反应条件强烈，固定化酶的酶活较低； 优点：酶的稳定性提高。
交联方式
最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分 子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联： —CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CHN CH (CH2)3 N CH (CH2)3
二、酶工程简介
⑤有机相中酶反应的研究； ⑥酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究； ⑦抗体酶、核酸酶的研究； ⑧模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研 究。
第二节 酶的来源和生产
一、酶的来源：主要是动植物和微生物
利用微生物生产酶的优点是： ①微生物种类繁多，动植物体内存在的酶，几乎都 可从微生物中得到； ②微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过 控制培养条件来提高酶的产量； ③微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段， 能培育出新的高产菌株。
③共价结合法：
原理：酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、 巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固 定在载体上。
在共价结合法中必须首先使载体活化，即使载体获得能与 酶分子的某一特定基团发生特异反应的活泼基团；
共价结合法的优缺点
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落。 缺点：反应条件剧烈，往往不能得到比活性高的固 定化酶，甚至酶的专一性等性质也会发生变化。
CH
N
CH
N
—CH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-
交联法
常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶 （蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；
常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如
牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。
（3）包埋法
网格型、微囊型
网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等 合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然
四、基因工程酶的构建
酶基因的克隆和表达； 酶基因的遗传修饰：定点突变； 酶的遗传设计；
复习题
1、按酶所催化的反应类型将酶分成哪6大类？ 2、酶催化反应的特点是什么？ 3、酶和细胞的固定化方法有那些？ 4、什么是模拟酶？什么是分子印迹？ 5、有机相酶反应的特点是什么？
二、酶的生产菌
1、对菌种的要求：
（1）产酶量、酶的性质、最好是胞外酶； （2）不是致病菌； （3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体； （4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。
2、生产菌的来源：
菌种保藏机构和有关研究部门，
从自然界中分离筛选——菌样采集、菌种分离初
筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。
于各种类型的反应器。
（2）纤维状固定化酶
适用于填充床反应器，已有多种酶膜制备出来。
（3）管状固定化酶
已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管。
2、固定化酶的性质
（1）酶活力的变化
一般酶活力下降，可在固定化反应体系中加入 抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。
（2）酶稳定性的变化
①操作稳定性，半衰期在1个月以上，可以认为
吸附载体:主要有物理吸附和离子吸附两种。 包埋载体:目前工业用的包埋载体主要有卡拉胶、海藻胶等。
共价结合载体:
纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃等。 交联法是通过双或多功能试剂进行固定化，因此不需要固定化 载体。也可用与吸附法和包埋法相同的载体进行交联。
5、固定化酶的制备技术
三、固定化方法与载体的选择依据
1、固定化方法的选择 考虑安全性、稳定性、固定化的成本
2、载体选择 性能好、价格便宜