氯化钙法质粒转化

氯化钙法进行质粒转化
利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。

仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴
药品试剂：
0.1 M CaCl2置冰浴中
2 M glucose：
取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。

2 M Mg2+：
取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。

亦可以MgCl2完全取代MgSO4.
SOB 液体培养基：
32 Methods in Biotechnology Vol 1
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM.
SOB 固体培养基：
2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM.
SOC/Amp 固体培养基：
SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin.
SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。

大肠杆菌菌株：JM109
#1~#5 接合反应液
方法步骤：
1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。

2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。

另取1 mL SOB加于微量离心管中。

由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计
3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min.
4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

5）倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。

6）沉淀加入1/3 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震荡，混合均匀，置冰浴中10~15 min.
7）同上4），5）的操作。

再重复6），4），5）的操作，以使反应更完全，增加成功率。

8）加入1/25 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2，稍加震荡使混合均匀。

◆Competent cells 制备完成！
9）DNA 样品（<10 μL）先装于微量离心管中，置冰浴中预冷，另取一微量离心管，标上#0,不加入任何DNA （作为negative control），亦置冰浴中预冷。

每个样品加入200 μL 菌液，震荡混合后，置冰浴中20~40 min.
10）42℃加热90 s （温度及时间均需很准确，请事先检查水浴锅的温度，不可超过42℃）。

◆Heat shock!
11）置冰浴中2 min。

12）加入800 μL SOC，混合后，于37℃震荡培养30~60 min.
13）将各管转形液上下摇动混合均匀后。

#5 取20 μL 至另一离心管中，加入180μL SOC （稀释10 倍），混合均匀后，涂布于SOC/Amp plate. #0, #1~ #4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate. 剩余菌液以6,000 rpm 离心1 min,倒去上清，沉淀加入200 μL SOC，均匀打散后涂抹在另一个SOC/Amp plate 上。

14）待培养基表面的菌液完全被吸收后，倒置培养皿于37℃培养16~20 h 后，观察各个plate 上菌落的形状并计算菌落数。

实验九质粒 DNA 的转化
【原理】
转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。

转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。

将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。

将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。

本实验采用 CaCl 2 法制备感受态细胞。

其原理是细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。

转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。

含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。

【试剂与器材】
1 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。

2 ． LB 固体培养基 LB 液体培养基中加 1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

3 ． 0.1mol/L CaCl 2 高压灭菌消毒或过滤除菌。

4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成 100mg/ml 溶液，置 -20 ℃保存。

5 ．人 Bcl-2 重组质粒它是Eco R Ⅰ单酶切的 p Bluescript Ⅱ KS(-) 载体与EcoR Ⅰ单酶切的人 Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为 4 861bp ，前者是一种由pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。

因此用Eco R Ⅰ酶切则应到空载pBluescript Ⅱ KS(-) 载体 (2.96kb) 和人 Bcl-2 cDNA 片段 (1.9kb) 。

配制成 2g/1 μ l 。

6 ．大肠杆菌 DH5 α此为 DNA 扩增菌
7 ．恒温水浴箱
8 ．超净工作台
9 ．高速冷冻离心机
10 ．恒温摇床
11 ．恒温箱
12 ．消毒离心管
13 ．消毒 tips
14 ．玻璃培养皿直径 90mm
15 ．玻璃涂布器
16 ． 95% 乙醇
17 ．标记笔
【操作步骤】
1 ．细菌感受态细胞的制备
将 DH5 α菌种划线于 LB 琼脂板上，37 ℃培养过夜。

挑取单菌落接种于 5ml LB 培养基中，37 ℃振荡培养培养过夜。

次日取菌液 1ml 接种至含有 100ml LB 培养
基的烧瓶中，37 ℃剧烈振荡培养至约 2 ～ 3h ，待 A 600 值达到 0.3 ～ 0.4 时将烧瓶置于冰浴 10 ～ 15min 。

将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的 50ml 离心管中。

4 000 × g ， 4 ℃离心 10min ，弃培养基，将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽。

加预冷的已过滤除菌的 0.1mol/L CaCl 2 重悬菌体，置冰浴 30min 。

4 000 × g ， 4 ℃离心 10min ，弃培养基。

再加 4ml 预冷的 0.1mol/L CaCl 2 ，轻轻重悬菌体，置4 ℃冰箱 12 ～ 16h 。

2 ． DNA 重组子的转化大肠杆菌 DH5 α
本实验中的 DNA 重组子为人 Bcl-2 重组质粒。

在无菌条件下按每管取 200 μl 新鲜感受态 DH5 α细菌置于无菌的 5ml 塑料离心管中，共 2 管，分别加入人 Bcl-2 重组质粒 (10ng) 和消毒水 ( 作阴性对照 ) 各 5 μl ，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min 。

42 ℃，热休克 90s ，中途不要摇动离心管，每管加 800 μl 无抗生素的 LB 培养基，于37 ℃空气摇床中以 150 r/min 速度振摇 45min ，使细菌复苏。

每管取 200 μl 加至含氨苄青霉素（ Amp ）的 LB 琼脂平板上，用玻璃涂布器涂布均匀，室温放置 20min ，使液体吸收，然后37 ℃倒置培养 12 ～16h 至单菌落形成。

【注意事项】
1 ．含人Bcl-
2 重组质粒的DH5 α菌落平板倒置置于4 ℃保存，于下周进行质粒DNA 的制备。