氯化钙法质粒转化

氯化钙法进行质粒转化

利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。

仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴

药品试剂：

0.1 M CaCl2置冰浴中

2 M glucose：

取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。

2 M Mg2+：

取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4.

SOB 液体培养基：

32 Methods in Biotechnology Vol 1

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM.

SOB 固体培养基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM.

SOC/Amp 固体培养基：

SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin.

SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。

大肠杆菌菌株：JM109

#1~#5 接合反应液

方法步骤：

1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。

2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计

3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min.

4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

5）倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。

6）沉淀加入1/3 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2,稍加震荡，混合均匀，置冰浴中10~15 min.

7）同上4），5）的操作。再重复6），4），5）的操作，以使反应更完全，增加成功率。

8）加入1/25 菌液体积冰冷的0.1 M CaCl2，稍加震荡使混合均匀。

◆Competent cells 制备完成！

9）DNA 样品（<10 μL）先装于微量离心管中，置冰浴中预冷，另取一微量离心管，标上#0,不加入任何DNA （作为negative control），亦置冰浴中预冷。

每个样品加入200 μL 菌液，震荡混合后，置冰浴中20~40 min.

10）42℃加热90 s （温度及时间均需很准确，请事先检查水浴锅的温度，不可超过42℃）。

◆Heat shock!

11）置冰浴中2 min。

12）加入800 μL SOC，混合后，于37℃震荡培养30~60 min.

13）将各管转形液上下摇动混合均匀后。#5 取20 μL 至另一离心管中，加入180μL SOC （稀释10 倍），混合均匀后，涂布于SOC/Amp plate. #0, #1~ #4 各取200 μL 涂抹在SOC/Amp plate. 剩余菌液以6,000 rpm 离心1 min,倒去上清，沉淀加入200 μL SOC，均匀打散后涂抹在另一个SOC/Amp plate 上。

14）待培养基表面的菌液完全被吸收后，倒置培养皿于37℃培养16~20 h 后，观察各个plate 上菌落的形状并计算菌落数。

实验九质粒 DNA 的转化

【原理】

转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）。

本实验采用 CaCl 2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl 2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

本实验是将人 Bcl-2 重组质粒转化 DH5 α扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。

含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5 α菌用于质粒 DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。

【试剂与器材】

1 ． LB 液体培养基 10g 胰蛋白胨、 5g 酵母提取物、 10gNaCl 加水至 1L ，高压灭菌消毒。