大肠杆菌质粒DNA的提取_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物
实验十三质粒DNA的提取与鉴定_百替生物实验十三质粒DNA的提取与鉴定一实验目的1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。
2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。
3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。
二实验原理质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。
然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。
离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。
通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA 的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。
（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。
一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。
（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
三药品器材一器材1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）2.台式离心机与高压灭菌锅3.超净工作台、摇床和各式加样枪二试剂1.溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖10mmol/L EDTA，20mmol/L20mMTris-HCl pH8.0100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
DNA提取常用试剂及操作方法_百替生物
DNA提取常用试剂及操作方法一、真核细胞DNA的制备与定量制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。
在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。
一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。
这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。
根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。
一、试剂准备1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0)。
2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl。
3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。
4．20% SDS5．2mg/ml蛋白酶K6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理1．新鲜或冰冻组织处理：⑴取组织块0.3-0.5cm3, 剪碎，加TE 0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。
⑵将匀浆液转移到1.5ml离心管中。
⑶加20% SDS 25 ml，蛋白酶K (2mg/ml) 25 ml，混匀。
⑷ 60°C水浴1-3hr。
2．培养细胞处理：⑴将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。
⑵离心4000g×5min，去除上清液。
⑶加10倍体积的裂解缓冲液。
⑷ 50-55°C水浴1-2hr。
（二）DNA提取1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 8学时一、实验目的使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤细胞培养接种培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）
实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）第一篇：实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）大肠杆菌总DNA的提取实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1.掌握DNA提取的原理和方法；2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法实验材料：1.实验菌株：大肠杆菌2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：溶菌酶（50mg/ml）5M NaCl氯仿：异戊醇（24：1 v/v）无水乙醇0.8%琼脂糖TAE电泳缓冲液仪器：离心机，电泳仪实验步骤：1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清； 2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C 水浴30min。
5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中；7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min； 8)弃上清，离心管在空气中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
第二篇：实验四植物DNA的提取[定稿]实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。
采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。
二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。
实验一大肠杆菌DNA的提取
实验一大肠杆菌DNA的提取
大肠杆菌总DNA的提取
实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。
实验目的：1. 掌握DNA提取的原理和方法；
2. 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法
实验材料：
1.实验菌株：大肠杆菌
2.试剂：TE溶液：Tris?HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，
20% SDS：
溶菌酶（50mg/ml）
5M NaCl
氯仿：异戊醇（24：1 v/v）
无水乙醇
0.8%琼脂糖
TAE电泳缓冲液
仪器：离心机，电泳仪
实验步骤：
1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清；
2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；
3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min；
4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。
5)加入110ul 5 M 高氯酸钠使其终浓度为1 M，充分混匀；
6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，
吸取上清于一新离心管中；
7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min；
8)弃上清，离心管在空气中自然晾干；
9)加入30-40ul TE溶解DNA；
10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。
质粒DNA提取(碱变性法)_百替生物
第 1 次课 6 学时注：本页为每次课教案首页实验四、质粒DNA提取（碱变性法）一质粒1 质粒（plasmid）：是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
2 质粒与宿主细胞的关系（1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。
（2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。
（3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿。
（4）质粒赋于宿主各种有利的表型，使宿主获得生存优势。
3 质粒提取实验在生物化学与分子生物学中具有非同寻常的意义。
是基因工程中常用的载体之一。
转基因的时候不会转移直接的外源基因，需要把外源基因连接到载体上进行转化。
载体的存在就像一个运输工具一样，把目的基因转到受体生物中。
任何的目的基因的克隆，外源基因的转入，载体的构建都绝对的离不开质粒的提取过程。
4 常用的载体质粒：是通过DNA重组技术构建而成的。
pUC18, pUC19,T-EASY等。
二提取三碱变性碱变性法主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。
染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。
由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。
四、实验步骤与方法1 接含PUC18质粒的单菌落于3ml Amp+LB液体培养基中LB液体培养基：分别称取10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、5g NaCL于1L 烧瓶中，950mlddH2O，5MNaOH调pH到7.0，补充至ddH2O1L，高压灭菌。
实验大肠杆菌基因组DNA的提取
实验大肠杆菌基因组DNA的提取
大肠杆菌基因组DNA的提取
1．吸1ml大肠杆菌DH5α至1.5 ml离心管中，10000rpm离心30秒；
2．吸干上清液，菌体充分悬浮于0.5 ml裂解液（10 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, pH8.0）;
3．加12.5 μl 10 mg/ml proteinase K, 混匀，37℃水浴1小时；4．加250 μl 6 M NaCl, 剧烈振荡30秒；
5．冰浴10 min后9500rpm离心10min;
6．转移500 μl上清至1.5 ml离心管中，加1 ml无水乙醇，颠倒混匀直至看清沉淀；
7．10000rpm离心5min, 吸干上清，沉淀溶于300μl水中；8．加15μl 2 mg/ml RNaseA, 混匀，37℃水浴1小时；9．加150μl 饱和酚及150μl氯仿，振荡10秒后10000rpm 离心1 min；
10．上清转移到1.5 ml离心管中，加2.5倍体积无水乙醇,混匀；11．10000rpm离心2min, 吸干上清，沉淀用0.5 ml 70%乙醇洗涤一次，吸干乙醇，室温晾干(~10 min)；
12．沉淀溶于300μl水中，取10μl电泳观察，其余置-20℃冻存备用。
一种大肠杆菌质粒dna的提取方法
一种大肠杆菌质粒dna的提取方法
1. 大肠杆菌菌株
2. TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA），pH 8.0
3. 酒精
4. CTAB（阳离子表面活性剂）
5. 水浴
6. 异丙醇
7. 丙酮
8. 离心管和离心机
步骤:
1. 用TE缓冲液预培养大肠杆菌菌株，使其处于对数生长期，收集细胞，洗涤一次以去除培养基。
2. 向菌体中加入2 mL CTAB缓冲液（10% CTAB, 0.7 M NaCl, 10 mM EDTA，50 mM Tris-HCl,pH 8.0），在水浴中加热65℃，混匀加热15分钟。
3. 加入等体积的酒精，混匀，放置室温某段时间，待上层液相变混浊时轻轻倒掉液相，接着加入70%酒精，小心混匀定格，离心收集菌体沉淀。
4. 加入1 mL TE缓冲液重悬细胞沉淀，加5 μL RNaseA（10 mg/mL）,放置30分钟于37℃反应，加入平等体积的异丙醇和丙酮混匀，使DNA沉淀表面干燥。
5. 用1 ml TE 缓冲液重悬DNA 沉淀，15-20 mins室温扰动，加入100 μL 10% Triton X-100混匀，放置30秒，离心集沉淀，上清即为DNA提取液。
注意事项：
1. 实验过程中需严格操作，以免使其他物质杂质污染DNA。
2. 在离心过程中需控制离心时间和离心速度，以保证DNA 沉淀的是在于上清。
3. 试剂配制后需保存冷藏，使用时应加热至室温后恢复使用。
质粒DNA提取_百替生物
一、材料为了方便起见，我们注明了本室所用培养基、试剂及在附录6.6仪器的型号和来源，供读者参考。
(一)仪器(见附录6．6)(二)器皿(见附录6．6)(三)菌种大肠杆菌K-12HBl0l(pBR322)(四)培养基1.LB液体培养基：(0．5％)1.5克精解蛋白胨(上海禽蛋二厂，生化试剂或日本po1ypepton，下同)。
(1％)3克，酵母浸出粉(上海酵母厂，生化试剂或Oxoid英国或difCo美国，下同)。
(0.5%)1．5克，氯化钠(上海南汇彭镇营房化工厂，分子量58．44，分析纯，下同)。
(1％)3克葡萄糖(上海化学试剂采购供应站，分子量198．17，分析纯，下同)。
按上述配方用重蒸水(以ddH20表示，下同)溶解至300毫升。
用10mol/LNa0H调pH至7．2－7．4。
分装于150毫升三角烧瓶中，每瓶30毫升。
然后置高压蒸汽锅以10342l.4帕(15磅／时2)，灭菌20分钟。
2．M9液体培养基A液：NaHPO4.2H2O(上海化学试剂二厂，分子量178．05，分析纯)12克KH2PO4(上海化学试剂二厂，分子量136．08，分析纯6克NH4Cl(上海无机化工研究所，分子量53．49，分析纯2克NaCl1克蛋白胨10克重蒸水定容至1800毫升按上述配方配制A液1800毫升，分装于500毫升三角烧瓶中，每瓶180毫升。
B液：MgSO4.7H20(上海金山尖塔化工厂，分子量303．30，分析纯，下同)0.26克葡萄糖8克重蒸水定容至200毫升按上述配方配制B液，分装于100毫升/250毫升三角瓶，共2只。
将A液与B液置高压蒸汽消毒锅中，以55158.08帕(8磅／时2)，灭菌30分钟。
接种前，在无菌室内用灭菌移液管吸20毫升B液加入180毫升/500毫升三角瓶的A液中，即成200毫升的M9液体培养基。
3.抗菌素：氨苄青霉素（Amp）临用时无菌水配制在灭菌有盖试管中，母液浓度为100毫克/毫升。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化引言质粒DNA提取是分子生物学实验中常见的基础工作之一，它是研究、分析和操作质粒DNA的必备步骤。
大肠杆菌是常用的实验宿主，其中质粒DNA的提取是进行重组蛋白表达、质粒构建和基因编辑等工作的前提。
传统的质粒DNA提取技术存在着许多问题，包括提取效率低、纯度不高、操作繁琐等。
本文旨在优化大肠杆菌中质粒DNA大量提取的条件，以提高提取效率和提取质量，为进一步的分子生物学研究工作提供可靠的技术支持。
一、大肠杆菌中质粒DNA提取的传统方法大肠杆菌中质粒DNA的提取通常采用碱裂解法或者快速裂解法。
碱裂解法是最常见的提取方法之一，其步骤包括细菌细胞裂解、蛋白质沉淀和质粒DNA沉淀等。
而快速裂解法则是通过加入碱性裂解溶液直接使细菌细胞裂解，然后用酸性溶液进行中和和沉淀。
这两种方法都有各自的优缺点，如碱裂解法提取的质粒DNA纯度较高，但操作繁琐；而快速裂解法操作简便，但质粒DNA纯度较低。
如何在提高提取效率的同时保证提取质量，是需要解决的关键问题之一。
二、条件优化1. 细菌培养条件大肠杆菌在培养基中生长繁茂是进行质粒DNA提取的基础。
细菌的培养条件对提取效率有着重要的影响。
常见的培养条件包括温度、培养时间、培养基等。
温度：温度是影响大肠杆菌生长和代谢的重要因素之一。
较高的温度能够促进细菌的生长速度，常用的培养温度为37摄氏度。
不同的大肠杆菌品系对温度的适应性有所不同，因此在进行质粒DNA提取之前，根据所选用的大肠杆菌品系的生长特性来调整培养温度，以提高细菌的生长速度。
培养时间：培养时间是细菌数量增长的关键因素。
通常情况下，培养时间越长，细菌数量越多，提取的质粒DNA量也就越大。
过长的培养时间可能会导致细菌的寿命变短，细菌死亡增多，从而影响提取的质粒DNA的纯度和质量。
在进行质粒DNA提取之前，需要根据所选择的大肠杆菌品系的繁殖速度以及提取的质粒DNA需求进行合理的培养时间设计。
大肠杆菌质粒DNA的提取
溶液III中和
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管 温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰 上放置5min。 12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为 中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白 质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。 溶液III成分：3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸 溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度 的盐，使得沉淀更完全。2 M的醋酸中和NaOH。
溶液II裂解
4.加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速 温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千 万不要振荡)，冰浴5 min，使细胞膜裂解（溶 液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 溶液II成分：0.2 N NaOH / 1% SDS 新配置NaOH，保证NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳的溶解细胞的 试剂，整个过程动作轻柔，防止提取的DNA链 断开。
抽提
6.上清液移入干净eppendorf管中，加入等 体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀, 12000rmp离心10min。（450μl的苯酚/氯仿/ 异戊醇。） 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)作用：氯仿使蛋白 质变性并有助于液相与有机相分离。酚 pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，可使 DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程 中的泡沫
大肠杆菌质粒DNA的提取
主讲人：谢小丽
碱裂解法流程图
对数期菌体 上清液
沉淀
溶液I充 分重悬
抽提ห้องสมุดไป่ตู้
干燥溶 解
溶液II 裂解
酒精沉淀
质粒DNA溶 液
溶液III 中和
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告质粒DNA的提取实验报告引言DNA（脱氧核糖核酸）是生物体中重要的遗传物质，对于研究生物学和遗传学等领域具有重要意义。
质粒DNA是环状的DNA分子，存在于细菌等原核生物中，广泛应用于基因工程、遗传转化等实验研究中。
本实验旨在通过提取质粒DNA，探究提取方法的可行性和效果。
材料与方法1. 实验材料：- 大肠杆菌培养物- 离心管- 磷酸盐缓冲液- 溶菌酶- 蛋白酶K- 高盐溶液- 乙酸酚/氯仿- 吸附管- 乙醇- 离心机- 紫外可见分光光度计2. 实验步骤：a. 收集大肠杆菌培养物，离心分离菌体。
b. 加入磷酸盐缓冲液，使菌体悬浮液pH值维持在8.0左右。
c. 加入溶菌酶，使细菌细胞壁溶解。
d. 加入蛋白酶K，降解蛋白质。
e. 加入高盐溶液，使蛋白质沉淀。
f. 收集上清液，转移到新的离心管中。
g. 加入乙酸酚/氯仿，使DNA与蛋白质分离。
h. 离心分离水相和有机相。
i. 收集上清液，转移到新的离心管中。
j. 加入乙醇，使DNA沉淀。
k. 离心分离DNA沉淀。
l. 去除上清液，用乙醇洗涤DNA沉淀。
m. 用磷酸盐缓冲液重悬DNA沉淀。
n. 使用紫外可见分光光度计测量DNA浓度。
结果与讨论通过以上提取方法，成功提取到质粒DNA。
在紫外可见分光光度计上测得DNA 的吸光度值为1.8，表明提取到的DNA质量较高。
实验结果表明，该提取方法可行且效果良好。
结论本实验通过提取质粒DNA的方法，成功提取到高质量的DNA样本。
质粒DNA 的提取是基因工程和遗传转化等实验研究的重要步骤，提取到的DNA样本可用于后续实验分析和研究。
本实验结果证明了所采用的提取方法的可行性和有效性，为后续实验提供了基础。
致谢感谢实验中使用的实验材料和设备，以及指导老师的指导和帮助。
参考文献[1] Smith, C. L., & Cantor, C. R. (1987). Purification, specific fragmentation, and separation of large DNA molecules. Methods in enzymology, 155, 449-467.[2] Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual (No. Ed. 2). Cold spring harbor laboratory press.。
大肠杆菌质粒提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
大肠杆菌基因组DNA的提取方式
大肠杆菌基因组DNA的提取方式一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl 溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。
(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。
质粒dna的提取实验报告
质粒dna的提取实验报告实验目的：通过质粒DNA的提取实验，掌握质粒DNA的提取方法，了解质粒DNA提取的原理和步骤，并评估提取质量和纯度。
实验材料：- 大肠杆菌菌落- 磷酸盐缓冲液- 10% SDS溶液- 去离子水- 超纯酒精（乙醇或异丙醇）- 氯仿- 石英研钵- 离心管和离心机- 显微镜和比色皿- 分子生物实验器材- DNA评估工具（如凝胶电泳仪）实验步骤：1. 随机挑选一颗大肠杆菌菌落，接种至含有磷酸盐缓冲液的离心管中，用显微镜观察菌落的情况，确保菌落无杂质。
2. 加入500 μL含有磷酸盐缓冲液的离心管中，用微量移液管捞取菌落，将其完全悬浮在磷酸盐缓冲液中。
3. 加入10 μL 10% SDS溶液，翻转离心管轻轻摇匀。
4. 加入200 μL NaOH和150 μL氯仿，离心1分钟。
此时，质粒DNA会被氯仿等重物分离到有机相中，而大部分细胞膜和核酸会留在水相中。
5. 转移上清液至新的离心管中，避光加入等量的超纯酒精，轻轻摇匀。
DNA会在酒精中沉淀。
6. 离心10分钟，取出上清液。
7. 加入70%乙醇或异丙醇定居洗涤一次，离心2分钟，取出上清液。
8. 反复使用去离子水洗涤，使残留的乙醇或异丙醇彻底除去。
9. 用去离子水稀释DNA，摇匀。
10. 用凝胶电泳仪评估提取的质粒DNA的质量和纯度。
实验结果：通过凝胶电泳仪评估质粒DNA的质量和纯度，得到如下结果：- DNA带有明显的质粒带，且带的位置与预期一致。
- DNA带的强度较均匀，并且没有明显的附带杂带。
- 带的强度与浓度成正比，说明提取的质粒DNA具有较高的质量。
讨论和结论：通过本实验，成功提取到了质粒DNA，并评估了其质量和纯度。
本实验中所使用的提取方法简单快速，并且获得了满意的结果。
然而，有时由于实验步骤的疏忽或操作技巧不当，可能会导致质粒DNA提取的效果不佳，如DNA带弱、杂带多等。
因此，未来可以进一步优化实验步骤和控制实验条件，提高质粒DNA提取的效率和质量。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化摘要：质粒是细胞质外一种环状的DNA分子，广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
本研究旨在优化大肠杆菌中质粒DNA的大量提取条件。
实验使用大肠杆菌TOP10质粒pUC19为研究对象，通过对试验设计、培养条件、细胞制备、DNA提取和纯化等方面进行了一系列优化，最终成功提取到了高质量且大量的pUC19质粒DNA。
提取纯化的DNA经酶切和凝胶电泳验证，其质量和纯度较高，并且已经可以用于PCR扩增、酶切和测序等进一步分析。
本研究优化的提取条件可以为后续的分子生物学和基因工程实验提供参考。
Abstract:Keywords: Escherichia coli; plasmid DNA; large-scale extraction; optimization引言：大肠杆菌是常用的实验室常见菌株，其在分子生物学和基因工程领域中经常使用。
其中，大肠杆菌中的质粒DNA是一种重要的工具，可以用于各种操作，如转化、表达、酶切和测序等，因此其提取过程的优化对于此类实验至关重要。
本研究目的是优化大肠杆菌中质粒DNA的大量提取条件，以提高提取DNA的质量和产量。
材料和方法：实验材料：1. 大肠杆菌TOP10菌株（Invitrogen，C4040-10）2. pUC19质粒DNA（NEB，N3041S）3. LB培养基（Sangon Biotech，A000865）4. 10% SDS（Sigma，71736）5. 蛋白酶K（Sigma，P2308）7. 同时含有pUC19质粒DNA和BamHI酶切pUC19质粒DNA的大小片段的质粒DNA分子量标准（Tiangen Biotech，DP207）实验方法：1. 试验设计本实验分为四组试验，每组试验在LB培养基中培养的时间、菌株数量、酶切条件等方面有所区别。
2. 培养条件大肠杆菌TOP10菌株预浸泡在LB培养基中至OD600达到0.5-0.6，然后以100 mL培养基中8000×g，4°C离心。
大肠杆菌质粒DNA的提取(碱法)报告
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。
溶液III : 3M KOAc， 5M CH3COOH；
作用:酸性下质粒DNA非特异性复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀
三、实验仪器、材料与试剂
平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚
二实验原理?使蛋白质或脂类等菌体成分变性?基因组dna产生缺刻变成线状并解离成单链变性?由于质粒dna较小仍为环状变性区虽大但不分离利用强碱或加热及表面活性剂sds裂解菌体中和或恢复至室温?变性的质粒dna按原互补配对结构复性?基因组dna随机复性与蛋白质等菌体成分结合在一起离心分离?质粒dna存在于上清中回收?苯酚氯仿异戊醇抽提乙醇沉淀纯化二实验原理碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的
2. 严紧型质粒
严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷 贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。
质粒的应用
大多数基因工程使用松弛型质粒。
严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的 基因。
质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增 或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程 中具有极广泛的应用价值。
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型， 是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒类型：
按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒
1. 松弛型质粒
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依 赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制， 质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体 复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达20003000拷贝。
实验七 重组载体转化大肠杆菌_百替生物
实验七重组载体转化大肠杆菌实验目的]][实验目的将质粒DNA转化到大肠杆菌中。
[实验原理实验原理]]蓝白筛选常用在重组子和非重组子的初步筛选中，它是通过载体和宿主菌之间基因内互补来实现。
许多载体（如pUC,pBS等）都是带有包括乳糖操纵子的调控序列和编码β-半乳糖苷酶前146个氨基酸的基因序列。
并在编码区中构建了多克隆位点，它不破坏读框，可使几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影响功能。
若有外源基因插入多克隆位点则破坏编码读框产生没活性的α肽段。
宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生其余肽段。
两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶基因。
β-半乳糖苷酶基因在IPTG的诱导下产生肽段与宿主菌其余肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶。
此酶能使显色底物X-gal分解成蓝色化合物，从而使菌落发蓝。
若有外源片段插入载体的多克隆位点，则使β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，形成白色菌落。
利用此方法仅通过目测就轻而一举地筛选出重组菌落。
实验试剂]][实验试剂LB液体培养基（配1L），分装成10瓶，每瓶100mLLB固体培养基（配1L），（50ml分装一瓶，高压灭菌）氨苄抗生素10mg/ml（过滤除菌）IPTG200mg/ml（在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。
）X-Gal（溶解200mg的X－gal于10ml的二甲基甲酰胺（DMF），用铝箔包裹装液管，贮存于-20℃。
），实验耗材]]Eppendorf管，大小枪头，培养皿，涂布棒[实验耗材实验器材]][实验器材摇床，离心机、水浴锅，微量移液器，实验步骤]][实验步骤（1）冻存于－80℃的感受态细胞置冰上溶化，将连接产物加入溶化后的感受态细胞中，冰浴40min，（2）42℃热激90s，不要摇动试管，立即移至冰上放置2min。
（3）加入400µl LB液体培养基，37℃100rpm恢复培养1h后，将细菌铺布于含ampicilin（终浓度100mg/L）/IPTG(4uL)/X-Gal(40uL)的LB固体培养基上，在37℃培养过夜。
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一、大肠杆菌质粒DNA的提取
质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：
1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管
8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中
煮沸法
1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。
质粒DNA的大量提取和纯化
在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
（一）、碱法
1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。
2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。
3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。
4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。
5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。
6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。
7、4℃下5000g离心15分钟。
8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。
9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。
11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。
12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。
13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。
[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。
2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。
3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。
二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。
凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。
（3）琼脂糖凝胶的染色
电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。
三、大肠秆菌感受态细胞的制备
感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜
2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3
3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。
4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液
5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min
6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液
7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。
四、质粒DNA高频转化大肠杆菌
制备好感受态细胞后，接下来就是质粒DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。
但要注意的是感受态细胞最好是新制备的，因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低；此外DNA的浓度也要注意，不能太高。
1、取新制备的一管感受态细胞。
2、取0．03ml感受态细胞转和4ng质粒DNA混匀，置冰浴30min
3、将Ep管置于42℃水浴中热冲击2分钟，立即置于冰上1分钟。
4、在Ep管中加70u1 LB培养基混匀，37℃培养30min
5、涂在含适当浓度抗生素的LB平板上。
6、37℃培养过夜，长出的菌斑既为阳性克隆。
五、线形质粒DNA 5'-粘性末端去磷酸
经限制性内切酶酶切的质粒DNA 5'端均带有磷酸集团，如用此载体直接转化大肠杆菌，其自身环化几率非常高，影响连接、转化效率。
因此一般酶切的质粒DNA要经脱磷，使用碱性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集团。
方法如下：
1、质粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min
2、补充CIAP 再37℃水浴30min
3、加入50mM EDTA至终浓度5mM 75℃加热10min 失活CIAP
4、冷却至室温，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩。
5、抽干溶液，加适量TE溶解。
六、聚合酶链式反应（PCR）技术
PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。
其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。
所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是ssDNA片段。
待扩增DNA 模版加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。
此时，两引物的3'端相对，5'向背。
在合适的条件下，由Taq DNA聚合酶催化引物引导的DNA合成，既引物的延伸。
上述过程是由温度控制。
这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。
PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
理论上扩增产物量成指数上升，既n个循环后，产量为2n拷贝。
典型的PCR操作过程如下：1、反应体系：
（反应溶液可置于毛细管或薄壁离心管中扩增）
2、操作过程：（所用仪器为AMP1605热循环PCR扩增仪
预变性：94℃90秒
循环过程：94℃1秒48℃1秒72℃40秒 40个循环
延伸：72℃5分钟
3、检测：琼脂糖电泳检测。