大肠杆菌质粒提取
提取大肠杆菌的质粒
感受态细胞
分子生物学最基本的实验操作
提取大肠杆菌和凝胶电泳
碱裂解法提取质粒
质粒是分子生物学中载体
扩增培养细菌便于提取，为客观化，养细胞来获得质粒二倍体增加
培养后收集裂解，裂解物质有很多物质，分离质粒和纯化质粒
质粒提取的方法
2-3ml少量提取方法碱裂解法
两个环，染色体独立复制能从亲代传到子代
质粒DNA是圆环状
目的基因越多，复性有不好影响
需要大量，让宿主细胞扩增
EP2232考量目的基因的作用，个体，看生物学功能发现
可以弥补目的细胞缺陷
沉默基因片段可以质粒
质粒提取与介质有关
控制PH是细胞破裂，染色体基因变性，质粒基因微变性，空间结构稳定，变性小开链缠绕在一起，蛋白质会沉淀，质粒在水相离心抽提纯化
原理核心物质
Ph8左右培养，变性需要12
Sds裂解细胞，染色体核酸变性，环境是碱
抑制杂菌，空气中的菌，培养中其它生长出来的菌
裂解用的试剂SDS和NAOH溶液
提取试剂溶液1，2，3
先配原始浓度，用时工作浓度，使用时变成终浓度
苯酚氯仿异戊醇分层，用苯酚氯仿比重大，易沉，相配现用
充分混匀
TE Buffer专门储存DNA
裂解时加RNA酶，不加，检测有条带，使制剂更纯
溶液123作用尽可能全地写到讨论区
溶液一震荡混匀二是轻柔颠倒混匀3颠倒混匀
涡旋混匀器。
提取质粒实验报告
提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。
本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。
- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。
- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。
- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。
- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。
- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。
- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。
- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。
- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。
- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。
- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。
- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。
- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。
- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。
- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。
- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。
实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。
通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。
此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。
通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。
从大肠杆菌中提取质粒DNA
生药0911 黄晶
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实验流程 实验原理 实验前准备 实验步骤 补充事项
实验流程
• 大肠杆菌置于LB培养基培 养使质粒DNA扩增 • 收集和裂解细菌 • 分离和纯化质粒DNA
实验原理
质粒独立于染色体外，且 游离于细胞质内或整合在细 菌染色体中。 SDS是一种阴离子表面活 性剂能使细菌细胞裂解，又 能使一些蛋白质变性，释放 出质粒DNA和染色体DNA。
谢谢
实验前准备
• 实验材料：含有质粒 DNA的大肠杆菌DH５α • 实验仪器：塑料离心管 架；10,100,1000µＬ移 液枪；1.5mＬEP离心管； 低温高速离心机一台； 无菌工作台；高压锅； 玻璃仪器及滴管等。
实验前准备
试剂准备： LB培养基； pH为8.0的GET缓冲溶液； 0.2mol/L的NaOH(含 1%SDS）； pH为4.8的乙酸钾溶液； 异丙醇溶液及75%乙醇溶液； pH为8.0TE缓冲液
实验步骤
• GET缓冲溶液中的EDTA 可除去细胞壁上的钙离子， 使溶菌酶更易与细胞壁接 触。 • 加入200µL新配制的 0.，使之混匀，冰浴 5min。 • SDS可使细胞膜裂解蛋白 质变性。
实验步骤
• 加入150µL冰冷的pH为4.8乙 酸钾溶液，加盖后颠倒数次 混匀，冰浴3~5 min。 • 乙酸钾沉淀SDS和SDS 与蛋 白质的混合物，冰浴是为了 沉淀完全。 • 加入等体积的异丙醇混匀， 室温置5min,12000r/min离心 5min,弃去上清液。
实验原理
在碱性溶液中，双链 DNA氢键断裂，DNA双螺 旋结构破坏而变性，由于 质粒DNA分子量相对较 小，且呈环状超螺旋结构， 在高碱性pH条件下两条 互补链不会充分分离，当 加入中和缓冲液乙酸钾时 变性质粒DNA又恢复到原 来的构型；
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是分子生物学实验中常用的技术之一，它能够从大肠杆菌中提取到质粒DNA，为后续的克隆、测序、转染等实验提供材料基础。
下面将介绍一种常用的大肠杆菌质粒提取方法——碱裂解法。
碱裂解法是一种常用的大肠杆菌质粒提取方法，它能够高效地将细菌细胞壁溶解，并释放出其中的质粒DNA。
下面将详细介绍碱裂解法的步骤。
1.准备实验所需试剂和设备。
包括缓冲液（Tris-EDTA缓冲液）、碱裂解液（含有SDS和NaOH）、中和液（含有醋酸）、平衡液（含有大量的乙酸和等体积的酸化乙醇）等。
此外，还需要离心机、恒温槽、加热器等设备。
2.培养大肠杆菌。
首先，在LB寒天平板上点取克隆菌落，放到含有LB培养基的离心管中，经过过夜培养，培养到适合的生长状态。
3.收获大肠杆菌菌落。
用吸管将培养液吸入离心管中，然后进行高速离心，使大肠杆菌菌落沉淀在离心管底部。
4.溶菌。
将上述步骤中得到的菌落沉淀用缓冲液洗涤，去掉多余培养基；然后加入碱裂解液，充分混匀，孵育在恒温槽中。
5.中和。
将中和液加入上述混匀的细菌液中，充分混匀，使pH值迅速下降，将碱性液体中的DNA中和。
6.离心。
将上述混合液进行高速离心，使细胞碎片和DNA沉淀到离心管底部。
7.除去上清。
将上述沉淀中的上清液去掉，注意不要损伤沉淀。
8.沉淀洗涤。
用平衡液洗涤沉淀，去除杂质和残留的碱性液体。
9.沉淀溶解。
用适量的TE溶解沉淀，使DNA溶解在缓冲液中，用于后续实验。
以上就是碱裂解法的基本步骤。
此外，需要注意的是，大肠杆菌质粒提取过程中需要严格控制实验条件，如温度、时间和离心力度等，以保证提取的质粒DNA质量和纯度。
实验中还需要避免DNA的酶降解，应尽量避免长时间的酶处理等。
总结起来，碱裂解法是一种简单有效的大肠杆菌质粒提取方法，它能够高效地提取到质粒DNA，为后续的实验提供了重要的基础材料。
不过在实验操作过程中需要严格控制条件，以保证提取到的质粒DNA 质量和纯度，从而保证后续实验的可靠性。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化质粒DNA是细菌细胞中的一种环状DNA，通常大小约为1-200 kb。
质粒DNA在遗传工程研究中起着重要的作用，可以用于插入DNA片段的克隆、质粒表达载体的构建等。
大肠杆菌(Escherichia coli)是常用的质粒DNA提取宿主。
质粒DNA提取的目的是将质粒DNA从大肠杆菌细胞中高效纯化出来。
在实际操作中，优化提取条件可以大大提高质粒DNA的纯度和得率。
以下是一些常见的质粒DNA提取条件的优化策略。
1.细菌培养条件的优化在进行质粒DNA提取之前，首先需要培养大肠杆菌细菌。
细菌培养条件的优化可以提高质粒DNA的产量。
一些常见的优化策略包括：选择适当的培养基，调整培养基的pH值，控制培养温度和培养时间，添加适量的抗生素以阻断非质粒DNA的复制等。
2.质粒DNA提取试剂盒的选择质粒DNA提取试剂盒是一种更为简便和高效的质粒DNA提取方法。
在选择试剂盒时，可以考虑以下因素：纯化步骤的简易程度、纯化时间、纯化效果、质粒DNA得率等。
需根据具体实验要求选择合适的试剂盒。
3.细胞破碎条件的优化细胞破碎是质粒DNA提取的关键步骤之一。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎和化学破碎。
机械破碎方法如超声波破碎、高压破碎等；化学破碎方法如利用酶降解细胞壁等。
优化细胞破碎条件可以提高质粒DNA的纯度和产量。
4.酶处理的优化在质粒DNA提取过程中，可以利用不同的酶处理方法去除蛋白质、RNA等杂质。
常见的酶处理方法包括蛋白酶处理和RNase处理。
优化酶处理的时间和浓度可以有效提高质粒DNA的纯度。
5.DNA沉淀条件的优化DNA沉淀是质粒DNA提取过程中的最后一步，也是重要的纯化步骤。
常见的DNA沉淀方法包括利用盐酸乙醇或异丙醇沉淀DNA等。
优化DNA沉淀条件可以提高DNA的得率和纯度。
质粒DNA提取条件的优化可以从培养条件、试剂盒选择、细胞破碎、酶处理以及DNA 沉淀等方面进行考虑。
通过优化提取条件，可以获得高质量的质粒DNA，满足实验需求。
大肠杆菌质粒DNA的提取
③ 向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液，震荡 混匀，以10000r/min离心2min,将上清转至新 的离心管中（用酚与氯仿的混合液除去蛋白， 其效果比单独使用酚或氯仿更好)
④ 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀。室温 放置2min后，离心5min倒去上清乙醇溶液，把 离心管倒置在吸水纸上吸去液体。
⑤ 加入0.5mL 70%乙醇溶液，震荡并离心，倒去 上清，干燥，溶于实验用品均需高温处理，以灭活残余的 DNA酶 • 所有试剂均需用高压灭菌双蒸水配制
• 酚抽提后小心吸取上清液
• 0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） • 70%乙醇溶液/无水乙醇
实验过程
1、培养细菌扩增质粒： 将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养 基中，37℃过夜培养
2、收集菌体及裂解细菌:
① 取液体培养菌液1.5mL置于EP管中， 10000r/min 离心1min, 去上清。 ② 加入150uL G.E.T 缓冲液，充分混匀，室温放 置10min （溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须 在使用时重新配置，使用EDTA是为了除去细胞 壁上的钙离子，使溶菌酶更易与细胞壁接触）
大肠杆菌质粒DNA的提取
实验目的
• 学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法
• 掌握质粒DNA制备的方法和原理
实验原理
质粒DNA的提取分为三个步骤：培养细菌使 质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质 粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十 二万基硫酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经 溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细 菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离 心时易被沉淀出来，而质粒DNA 则留在上清 液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可 得到质粒DNA.
③ 加入新配置的0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） 加盖，倒置2-3次，使之混匀。冰浴5min（SDS 能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性）
细胞生物学实验碱性SDS法提取大肠杆菌源质粒
溶液Ⅱ： 0.2MNaOH， 1%SDS
溶液Ⅲ： 3M乙酸钠 PH 4.8
试剂
4、1：1 Tris饱和酚/氯仿
5、溶解质粒用TE：
10mmol/L Tris-HCI PH 8.0
1mmol/L EDTA
PH 8.0
6、溶解质粒用TER：
每ml TE 中含1mg RNase。
用品
摇床、恒温箱、普通离心机、高速冷冻 离心机、1.5ml离心管、电泳仪等。
断开）
DNA的琼脂糖凝胶电泳分离的原理及装置
琼脂糖（agarose）是从海藻中提取出来的一 种线状高聚物，在溶液中形成一定孔径的凝胶。 具有分子筛作用。可依据分子大小及分子构型 不同分离物质。
琼脂糖凝胶电泳装置：Walter Schaffner发明
的水平板凝胶电泳装置。
电泳步骤
1.配缓冲液：Tris－乙酸缓冲液、Tris－乙酸盐缓冲液、 Tris-硼酸盐缓冲液、Tris－磷酸盐缓冲液
三、裂菌及提取质粒DNA
1、100l预冷的溶液Ⅰ重悬菌液，激烈振荡(涡旋）， 使细胞完全分散，室温放置5min；
2、加入200l新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒几次混匀， 置于冰上（此时溶液PH应为12.6）不超过5min ，使细 胞破裂，蛋白和染色体DNA变性；
3、加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ，颠倒温和混匀，置 于冰上5min(此时溶液PH应为7.0左右,可使质粒DNA选 择复性；高浓度的盐使蛋白及染色体DNA沉淀)；
Tris-硼酸盐缓冲液 Tris-EDTA缓冲液 巴比妥缓冲液 缓冲液 缓冲液离子强度：0.02-0.05。
琼脂糖凝胶的制备
１.配琼脂糖溶液。用电泳缓冲液配制。 2.封胶板，插梳子。
3.倒胶。熔化液倒入胶模中，放置1530min令其凝固。
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
以下是利用大肠杆菌生产胰岛素的工艺流程：
1. 提取目的基因：从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。
2. 提取质粒：使用细胞工程，培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。
3. 基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。
4. 将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2，这使细胞会吸收外源基因。
此时将重组的质粒也放入培养液中，大
肠杆菌便会将重组质粒吸收。
5. 胰岛素的产生：在再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。
通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。
以上步骤仅供参考，如果想要了解更多关于大肠杆菌制备胰岛素的工艺流程，建议咨询专业人士获取帮助。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法 -回复
大肠杆菌质粒提取碱裂解法-回复大肠杆菌质粒提取是一种常用的实验技术，可以用于分离和纯化重组DNA 质粒。
碱裂解法是其中一种常用的技术，本文将详细介绍大肠杆菌质粒提取碱裂解法的步骤和相关注意事项。
一、材料准备1. 大肠杆菌含质粒的培养物：可以选择含有目标质粒的大肠杆菌菌株。
例如，适用于蓝/白哺乳素筛选的菌株如DH5α。
2. 质粒纯化试剂盒：选择适合自己实验的质粒纯化试剂盒，可以根据需要选择小或大规模的提取试剂盒。
3. 离心管和离心机：用于离心大肠杆菌培养物和纯化DNA溶液。
4. 碱裂解缓冲液：可以通过自制或直接购买管制的缓冲液，如1 MTris-HCl (pH 8.0)、0.5 M EDTA (pH 8.0) 和10 SDS。
二、菌群扩增和收获菌株1. 从培养物中收取大肠杆菌：从10 mL 大肠杆菌培养物中取出适量菌液，可通过离心和倾倒上清液的方式收集菌块。
2. 重悬菌液：用无菌的PBS缓冲液洗涤菌块，再用10 mL 新鲜PBS缓冲液将菌块重悬。
3. 破碎细胞：将重悬的菌液转移至一个离心管中，对菌液进行破碎。
可以通过加入Lysozyme (100 mg/mL)、RNase A (10 mg/mL) 和TritonX-100 (1)来实现。
然后进行轻轻的颠倒以混合试剂。
4. 加入碱裂解缓冲液：向破碎的细胞中加入适量的碱裂解缓冲液。
一般来说，每个培养物使用5 mL缓冲液进行处理。
5. 匀浆与悬浮：用高速离心机对混合液进行离心，以沉淀细胞碎片。
然后将上清液转移到另一个离心管中，进行均匀悬浮。
三、纯化DNA1. 加入异丙醇：向菌液中加入等体积的异丙醇。
使用移液器将试剂静态混合。
2. DNA沉淀：将混合液高速离心，将沉淀的DNA从上清中分离出来。
沉淀的细胞碎片在离心管底部形成一个白色团块，而上清液大部分为透明的液体。
3. 洗涤：使用95 乙醇洗涤DNA沉淀物。
将95 乙醇分别加入到离心管中，并将其高速离心10分钟。
碱裂解法抽提大肠杆菌质粒
移液器及吸头 漩涡混合器
03
实验步骤
菌体培养
菌体培养是碱裂解法抽提大肠杆菌质 粒的第一步，需要将大肠杆菌接种在 适量的培养基中，在适宜的温度下进 行培养，使菌体生长至对数生长期。
培养过程中，需要控制温度、pH和培 养时间，以确保菌体生长良好且无杂 菌污染。
菌体收集
当菌体生长至对数生长期后，需要将 菌体收集起来，以便进行后续的实验 步骤。
碱裂解法抽提大肠杆 菌质粒
目 录
• 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果与分析 • 结论与讨论
01
实验原理
碱裂解法介绍
碱裂解法是一种常用的质粒抽提 方法，通过改变细胞壁和细胞膜 的性质，使质粒DNA从染色体
DNA中分离出来。
在高pH值条件下，细胞膜和染 色体DNA的双螺旋结构被破坏，
聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于较小片段的质粒，可采用聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行检测，该方法分辨 率更高。
质粒结构与功能分析
01
质粒电泳图谱分析
通过比较标准质粒和提取质粒的 电泳图谱，分析提取质粒的分子 量大小及可能缺失的片段。
02
限制性内切酶分析
03
基因测序验证
利用限制性内切酶对质粒进行酶 切，通过电泳检测酶切产物，判 断质粒的结构。
形成不可逆的变性，而质粒 DNA则保持稳定。
通过离心分离，染色体DNA和 细胞膜等大分子物质被沉淀，而
质粒DNA则留在上清液中。
大肠杆菌质粒介绍
01
大肠杆菌质粒是一种小型环状DNA分子，可以自主 复制和遗传。
02
质粒携带特定的基因，赋予宿主细胞某些表型特征， 如抗生素抗性或代谢特性。
03
大肠杆菌质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆 和表达目的基因。
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取的原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将大肠杆菌菌落接种到液体培养基中培养，在适当的培养时间后，将菌液离心沉淀，得到含有大肠杆菌细胞的沉淀物。
细胞裂解是通过物理或化学方法破坏细胞壁，释放细胞的内容物。
2. 质粒提取：将裂解后的细胞加入适当的缓冲液中，经过离心分离得到上清液和沉淀物。
上清液中含有质粒DNA，而细胞碎片和其他细胞器等则在沉淀物中。
3. DNA纯化：使用DNA纯化试剂盒或其他纯化方法将上清液中的质粒DNA分离纯化。
这些方法通常涉及对上清液进行酚/氯仿提取、乙醇沉淀或离心柱纯化等步骤，以去除杂质和纯化质粒DNA。
4. 质粒DNA定量：使用紫外线分光光度计对纯化后的质粒DNA进行定量，以确定得到的DNA的浓度和纯度。
5. 质粒DNA的后续应用：得到纯化的质粒DNA后，可进一步进行测序、限制性酶切、聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学实验，以研究质粒DNA所携带的目的基因的功能、构建重组质粒或进行基因克隆等实验。
需要注意的是，在文中不提供标题或重复的文字。
如果需要添加标题，可以根据具体内容进行修改。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法
大肠杆菌质粒提取的碱裂解法是一种常用的方法，用于从大肠杆菌细胞中提取质粒以进行后续分析。
以下是碱裂解法的步骤：
1. 大肠杆菌培养：从大肠杆菌培养物中收集菌落或含有质粒的培养物。
可以使用无菌技术收集样品。
2. 细胞沉淀：将菌液转移到离心管中，并进行离心以沉淀细胞。
通常在4°C下以3000 xg离心10至15分钟。
3. 细胞溶解：将离心后的细胞沉淀洗涤一次，然后用含有葡萄糖、葡萄糖酸钠和牛血清蛋白的缓冲液（如Tris-HCl缓冲液）进行重悬。
加入石碱（如NaOH）和SDS（十二烷基硫酸钠）混合液，使细胞裂解释放出质粒。
4. 中和和离心：加入中和液（如醋酸）以中和碱性溶液，然后离心离心，以去除细胞壁碎片和细胞碎片。
5. 提取质粒：将上清液转移到新的离心管中，并加入等体积的苯酚（酚/氯仿，pH 8.0）混合液。
轻轻混合并离心以分离有机相和水相。
6. 提取DNA：将有机相转移到新的离心管中，加入冷异丙醇或冷乙醇沉淀DNA。
离心后，去除上清液，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
7. 干燥和重溶：将DNA沉淀干燥，并用适当的缓冲液（如Tris-EDTA缓冲液）重溶。
这些步骤仅提供了基本的大肠杆菌质粒提取的碱裂解法流程，具体的实验条件和试剂浓度可以根据实验需求和具体的实验室方法进行调整。
同时，在进行实验前，请确保遵守实验室安全操作和相关伦理规定。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化大肠杆菌是一种广泛存在于自然界中的细菌，也是常见的实验室模式生物。
其质粒DNA的大量提取对于基因工程、遗传学研究以及基因表达调控等领域具有重要意义。
大肠杆菌中质粒DNA的提取受到许多因素的影响，包括细菌的生长状态、菌株的特性、抽提条件等。
对大肠杆菌中质粒DNA提取条件的优化具有重要的理论和实际意义。
本文旨在探讨大肠杆菌中质粒DNA提取条件的优化方法，希望能够为相关研究提供参考。
一、大肠杆菌中质粒DNA的提取原理大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞壁由肽聚糖层、脂多糖层和蛋白聚糖层三部分组成。
在细胞内，大肠杆菌通常含有多个质粒，这些质粒是细胞外染色体的环状DNA分子，携带了许多细菌的遗传信息。
提取大肠杆菌中的质粒DNA涉及到细胞破裂、蛋白质和RNA的去除、DNA的溶解和纯化等步骤。
常用的大肠杆菌质粒DNA提取方法包括碱裂解法、酚氯仿法、快速裂解法等。
在提取过程中，通常首先需要将大肠杆菌细胞破裂，使得细胞内的DNA得以释放。
通过酚酸、酚氯仿等有机物质与蛋白质、RNA等分子发生分配作用，将DNA分离出来。
经过乙醇沉淀等方法，得到较为纯净的质粒DNA。
不同的提取方法具有各自的优缺点，选择合适的提取方法主要取决于所需的DNA量、DNA质量和实际操作的便捷性。
1. 细菌的生长状态大肠杆菌的生长状态对其质粒DNA的提取有着重要的影响。
在细菌的对数生长期，细胞内的质粒数量较多，质粒DNA的提取效率一般较高。
而在静止生长期或者死亡期，细胞内的质粒数量较少，提取效率则会降低。
2. 菌株的特性不同的大肠杆菌菌株所含的质粒数量和大小有所不同，这会影响到提取条件的选择。
一些菌株可能含有多个大型质粒，需要更为严格的提取条件，而另一些菌株可能只含有少量小型质粒，在提取过程中则要更加谨慎。
3. 抽提条件的优化不同的质粒DNA提取方法和条件对提取效率和质量都会有影响。
在提取过程中，包括细胞破裂的方法、蛋白酶、RNase的使用量和作用时间、DNA溶解和纯化的方法等都会对提取效果产生影响。
大肠杆菌质粒的快速提取
・实验与技术・大肠杆菌质粒的快速提取3朱 帆1,刘忠纯2,李 健3(1.武汉大学生命科学学院,湖北武汉430072;2.武汉大学人民医院,湖北武汉430072;3.武汉大学口腔医学院,湖北武汉430072)摘 要 质粒的提取是生物学中的常规技术之一,但常规法提取质粒十分复杂,繁琐并且费时。
国外公司的试剂盒大大简化了此过程。
但价格使国内大多数实验室难以承受。
我们利用自制的玻璃粉提取质粒,大大简化了提取过程,同时相对于进口试剂盒而言,实验成本也大大降低。
关键词 质粒;玻璃粉;DNA纯化中图分类号 Q781;Q782 文献标识码 B 文章编号 1005-7021(2004)03-0059-01 常规提取质粒的方法有碱解法[1]、煮沸法[2]等方法。
最近,Promega公司、Pharmacia公司等公司相继推出了DNA纯化试剂盒用于质粒的提取[3]。
碱解法通常存在着方法繁琐,并且费时;煮沸法虽然方法简单,但也存在着其提取物不能直接进行酶切等缺点;而国外的公司的试剂盒虽然克服了传统方法的缺点,大大简化了提取过程,但其价格却是国内大多数实验室难以承受的,不能普遍使用。
本实验则利用自制的玻璃粉提取质粒,使整个提取过程缩短到1h以内,简化了提取过程,提高了工作效率,降低了实验成本,并且提取得到的质粒可直接用于包括酶切、DNA序列测定等在内的各种分子生物学操作。
1 材料与方法1.1 材料GTX TM Micro Plasmid Prep K it购自Amer2 sham Pharmacia公司,RNase A购自Promega公司。
大肠杆菌DH5α,PBS质粒由华美购得,限制性内切酶也由华美购得,其它试剂均为国产分析纯试剂,购自华美。
测序由大连宝生物公司完成。
1.2 方法1.2.1 碱解法提取质粒 5mL菌液离心,得到的菌体用碱解法提取质粒[1]。
1.2.2 DNA试剂盒提取质粒 5mL菌液离心,得到的菌体按试剂盒说明书提取质粒。
大肠杆菌质粒提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是一种用于从大肠杆菌中提取质粒的方法。
碱裂解法是其中一种常用的方法，该方法利用碱性条件下DNA的不稳定性，将细胞壁溶解，并使质粒DNA从细胞中释放出来。
本文将介绍碱裂解法的步骤、原理以及优缺点。
碱裂解法的步骤如下：1.大肠杆菌培养：首先从保存在琼脂板上的大肠杆菌菌落中挑取一株菌，接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养过夜，直到菌液呈现较浓的悬浮液。
2.收取大肠杆菌：将培养液离心，除去上清。
用冷凉的纯水冲洗沉淀两次，将菌沉淀重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0。
3.制备碱性溶液：在50 mM Tris-HCl缓冲液中加入0.2 M NaOH 和1% SDS，混匀制成碱性溶液。
4.碱性裂解：将菌悬液与等体积的碱性溶液混匀，使菌细胞在碱性条件下裂解。
孵育数分钟至十几分钟，直至溶液变为粘稠状。
5.酸性中和：加入等体积的3 M醋酸，酸性中和碱性溶液。
此步骤中，质粒DNA会从溶液中析出沉淀。
6.离心：用高速离心将沉淀离心下来，除去上清。
7.溶解：用适量的纯水将沉淀溶解，可以通过轻轻摇动溶液使其充分溶解。
8.纯化：通过离心或其他纯化方法，如柱层析、琼脂糖凝胶电泳等技术，纯化目标质粒DNA。
碱裂解法的原理是利用碱性条件下DNA的不稳定性。
当细胞处于高pH环境中时，碱性条件会破坏大肠杆菌的外膜，使细胞壁失去完整性。
此时，细胞内的DNA易于释放出来，包括质粒DNA。
然后，通过酸性中和反应将质粒DNA沉淀下来。
最后，通过纯化步骤，可以得到高纯度的质粒DNA。
碱裂解法的优点是简单易行，不需要较昂贵的设备和试剂，并且可以在相对短的时间内提取到目标质粒DNA。
此外，这个方法适用于大多数质粒类型和质粒大小。
碱裂解法适用于小规模提取或初步提取，用于大规模提取时效率较低，不推荐使用。
然而，碱裂解法也存在一些缺点。
首先，该方法提取到的DNA含有RNA、蛋白质和其他污染物。
大肠杆菌质粒提取
质粒小提试剂盒（离心柱型）使用前在漂洗液PW中加无水乙醇1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
（使用当天处理过的柱子）2.取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸除上清3.向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。
4.向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。
此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。
5.向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。
12000rpm、离心10min。
（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。
（此时可做胶，以备检测用）6.取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。
12000rpm、离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
7.向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
8.重复操作步骤7。
9.将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。
10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μlddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。
注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清碱裂解法少量提取质粒1.保存菌种2.收集菌体到EP管.离心8000rpm，1min,尽可能去上清，重复2-3次3.沉淀悬于100ul solution Ⅰ,涡旋4.加200ul solution Ⅱ（现用现配，0.4 M NaOH:2% SDS =1:1），轻轻摇匀5.加150ul solution Ⅲ，轻轻摇匀6.加600ul 氯仿，轻轻摇匀7.离心，11000rpm ,1min8.取上清于新EP管，加800ul 预冷无水乙醇（-20℃），混匀9.离心，11000rpm ,1min10.弃上清，沉淀中加入300ul 70% 乙醇洗11.烘干12.加30ul RNase 水，轻弹促溶13.37℃,30min14.-20℃保存。
质粒提取过程中的常见问题
1、质粒提取不成功的原因（1）裂解时间太长。
加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
（2）吸附时间不够（3）溶解时间不够（4）大肠杆菌老化。
建议涂布平板培养后。
重新挑选新菌落进行液体培养。
（5）质粒拷贝数低。
由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
（6）菌体中无质粒。
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如。
柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
碱裂解不充分。
使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。
对低拷贝数质粒。
提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质料质量。
（7）溶液使用不当。
溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
（8）吸附柱过载。
不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。
若用富集培养基，例如TB或者×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
（9）质粒未全部溶解。
洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
（10）乙醇残留。
漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
（11）洗脱液加入位置不正确。
洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
（12）洗脱液不合适。
DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10 mM Tris•Cl，pH8.5）或水。
洗脱效率取决于pH值。
最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。
当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能性导致洗脱量低。
洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
（13）洗脱体积太小。
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质粒小提试剂盒
（离心柱型）
使用前在漂洗液PW中加无水乙醇
1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、
离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
（使用当天处理过的柱子）
2.取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸
除上清
3.向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋
彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。
4.向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室
温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。
此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。
5.向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此
时出现白色絮状沉淀。
12000rpm、离心10min。
（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。
（此时可做胶，以备检测用）
6.取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。
12000rpm、离心1min，倒掉
收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
7.向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、
离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
8.重复操作步骤7。
9.将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗
液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。
10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl
ddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。
注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清
碱裂解法少量提取质粒
1.保存菌种
2.收集菌体到EP管.离心8000rpm，1min,尽可能去上清，重复2-3次
3.沉淀悬于100ul solution Ⅰ,涡旋
4.加200ul solution Ⅱ（现用现配，0.4 M NaOH:2% SDS =1:1），轻轻摇匀
5.加150ul solution Ⅲ，轻轻摇匀
6.加600ul 氯仿，轻轻摇匀
7.离心，11000rpm ,1min
8.取上清于新EP管，加800ul 预冷无水乙醇（-20℃），混匀
9.离心，11000rpm ,1min
10.弃上清，沉淀中加入300ul 70% 乙醇洗
11.烘干
12.加30ul RNase 水，轻弹促溶
13.37℃,30min
14.-20℃保存。