大肠杆菌质粒提取

质粒小提试剂盒

（离心柱型）

使用前在漂洗液PW中加无水乙醇

1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、

离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）

2.取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸

除上清

3.向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋

彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。

4.向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室

温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。

5.向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此

时出现白色絮状沉淀。12000rpm、离心10min。（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。（此时可做胶，以备检测用）

6.取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。12000rpm、离心1min，倒掉

收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

7.向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、

离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗

液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl

ddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。

注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清

碱裂解法少量提取质粒

1.保存菌种

2.收集菌体到EP管.离心8000rpm，1min,尽可能去上清，重复2-3次

3.沉淀悬于100ul solution Ⅰ,涡旋

4.加200ul solution Ⅱ（现用现配，0.4 M NaOH:2% SDS =1:1），轻轻摇匀

5.加150ul solution Ⅲ，轻轻摇匀

6.加600ul 氯仿，轻轻摇匀

7.离心，11000rpm ,1min

8.取上清于新EP管，加800ul 预冷无水乙醇（-20℃），混匀

9.离心，11000rpm ,1min

10.弃上清，沉淀中加入300ul 70% 乙醇洗

11.烘干

12.加30ul RNase 水，轻弹促溶

13.37℃,30min

14.-20℃保存