在大肠杆菌中的质粒
质粒特征[精华]
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第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。
质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。
其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。
二．质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。
列举重要质粒
列举重要质粒
质粒是一种环形的DNA 分子，常存在于细菌、真菌等生物体中，它能够自主复制并在细胞间转移，携带一些重要的基因信息。
以下是一些重要的质粒：
1. pUC19 质粒：这是一种常用的克隆载体，携带氨苄青霉素抗性基因和lacZ 基因。
它常用于在大肠杆菌中克隆和表达基因。
2. pET 系列质粒：这是一类用于表达外源基因的质粒，常用于在大肠杆菌中高效表达蛋白质。
pET 系列质粒携带T7 启动子，可以诱导基因的高水平表达。
3. pBR322 质粒：这是一种经典的质粒，携带氨苄青霉素和氯霉素抗性基因。
它常用于基因克隆和质粒构建。
4. pGL3 质粒：这是一种用于荧光素酶报告基因检测的质粒，常用于研究基因调控和启动子活性。
5. pGEX 系列质粒：这是一类用于表达谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的质粒，常用于蛋白质的纯化和检测。
这些质粒在分子生物学、基因工程和生物技术等领域具有重要的应用价值。
当然，还有许多其他类型的质粒，它们具有不同的特性和用途，可根据具体需求选择合适的质粒。
大肠杆菌生产质粒过程
大肠杆菌生产质粒过程1.引言1.1 概述概述大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界中，尤其是在人和动物的消化系统中。
由于其较高的生长速度和容易培养的特性，大肠杆菌成为了许多生物学研究和工业生产中的重要模式生物。
质粒是一种小型的环状双链DNA分子，在细菌中经常出现并进行自复制。
质粒可以通过转化或转染等方式在细菌中进行稳定复制，从而传递和保守一些重要的基因信息。
在大肠杆菌中，质粒的产生是其中一个重要的生物过程。
本文旨在探讨大肠杆菌生产质粒的过程，从大肠杆菌的生物特性和质粒的定义与功能入手，详细分析大肠杆菌生产质粒的重要性以及影响其生产过程的关键因素。
通过对大肠杆菌生产质粒过程的研究，我们可以更好地理解质粒的作用机制，为进一步优化和应用质粒在工业生产和基因工程中提供理论指导和实践经验。
在本文的后续章节中，我们将逐步展开对大肠杆菌和质粒的相关讨论，并且重点分析大肠杆菌生产质粒的重要性和影响质粒生产过程的关键因素。
最后，我们将总结得出结论，并对未来可能的研究方向进行展望。
通过本文的研究，我们希望能够更深入地了解大肠杆菌生产质粒的机制，为质粒的开发和应用提供更多的理论和实践支持，进一步推动生物科学和生物工程的发展。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照以下顺序进行介绍大肠杆菌生产质粒的过程及其相关内容：1. 引言部分将提供对整篇文章的概述，介绍大肠杆菌生产质粒的背景和意义，以及本文的目的和结构。
2. 正文部分将包括两个主要部分：2.1 大肠杆菌的生物特性：这一部分将详细介绍大肠杆菌的特性，包括其生长环境、生理特征以及在科学研究和实际应用中的重要性。
通过对大肠杆菌的深入了解，读者将更好地理解其在质粒生产过程中的应用。
2.2 质粒的定义与功能：质粒是一种在细胞内自主复制的小型环状DNA分子，具有重要的研究和应用价值。
本部分将介绍质粒的定义、结构和功能，重点讨论其在基因工程和生物制药中的应用，以及大肠杆菌在质粒生产中所起的关键作用。
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取的原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将大肠杆菌菌落接种到液体培养基中培养，在适当的培养时间后，将菌液离心沉淀，得到含有大肠杆菌细胞的沉淀物。
细胞裂解是通过物理或化学方法破坏细胞壁，释放细胞的内容物。
2. 质粒提取：将裂解后的细胞加入适当的缓冲液中，经过离心分离得到上清液和沉淀物。
上清液中含有质粒DNA，而细胞碎片和其他细胞器等则在沉淀物中。
3. DNA纯化：使用DNA纯化试剂盒或其他纯化方法将上清液中的质粒DNA分离纯化。
这些方法通常涉及对上清液进行酚/氯仿提取、乙醇沉淀或离心柱纯化等步骤，以去除杂质和纯化质粒DNA。
4. 质粒DNA定量：使用紫外线分光光度计对纯化后的质粒DNA进行定量，以确定得到的DNA的浓度和纯度。
5. 质粒DNA的后续应用：得到纯化的质粒DNA后，可进一步进行测序、限制性酶切、聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学实验，以研究质粒DNA所携带的目的基因的功能、构建重组质粒或进行基因克隆等实验。
需要注意的是，在文中不提供标题或重复的文字。
如果需要添加标题，可以根据具体内容进行修改。
大肠杆菌质粒
大肠杆菌质粒1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌，它具有广泛的生物学和应用价值。
在研究中，大肠杆菌常被用作重要的模式生物，用于分子生物学、遗传学及基因工程等领域的研究。
在这些研究中，质粒扮演着重要的角色。
质粒是一种小型的环状DNA分子，可以以自主的方式复制和传递基因信息。
2. 质粒的结构和功能质粒主要由以下部分组成：•起始子：包含质粒复制所需的启动序列，可被宿主细胞的DNA聚合酶辨认和结合。
•多克隆位点：提供了多个酶切位点，方便插入外源DNA序列。
•选择标记：用于区分带有质粒的宿主细胞与没有质粒的细胞。
常用的选择标记包括抗生素抗性基因。
•质粒复制起点：指导质粒复制的起始点和方向。
质粒的功能包括：•外源DNA载体：质粒可以携带外源DNA序列，用于表达感兴趣的基因。
•基因传递：质粒可以经由细胞间的水平基因转移，传递其携带的基因信息。
•基因放大：由于质粒的复制和传递能力，它们可以被放大并生产大量目标DNA序列。
3. 质粒的构建方法质粒的构建方法主要包括以下几个步骤：1.选择合适的质粒骨架：根据实验需求选择合适的质粒骨架，包括质粒大小、复制源、选择标记等。
2.选择切割酶：根据质粒骨架设计引物，选择合适的切割酶进行DNA片段切割。
3.连接外源DNA序列：利用DNA连接酶将外源DNA序列连接到切割后的质粒骨架上。
4.转化至宿主细胞中：将构建好的质粒DNA转化至宿主细胞中，使其能够自主复制和传递。
4. 质粒的应用质粒具有广泛的应用价值，包括：•基因克隆：通过质粒，可以将感兴趣的基因从一种生物转移到另一种生物中，以进行基因功能研究或产生重组蛋白等目的。
•基因表达：质粒可以用作外源基因表达载体，将感兴趣的基因导入宿主细胞中，实现大量高效表达。
•基因治疗：质粒可以用于携带治疗性基因，并通过转染等方式送入患者的细胞中，以实现基因治疗的目的。
•基因敲除：通过质粒介导的基因敲除，可以针对特定基因进行靶向破坏，从而研究其功能及相关疾病。
大肠杆菌遗传物质形态
大肠杆菌遗传物质形态
一、染色体DNA
大肠杆菌的遗传物质主要是由一个大型环状的染色体DNA组成的。
这个染色体DNA包含了细菌的全部基因信息，控制着细菌的生长、繁殖和代谢等生命活动。
二、质粒DNA
除了染色体DNA外，大肠杆菌还含有一些质粒DNA。
质粒是一种独立于细菌染色体之外并能够自主复制的环状DNA分子。
它们通常携带着一些特定的基因，这些基因可以赋予细菌一些特殊的生物学特性，如对抗生素的抗性、代谢特殊底物的能力等。
三、RNA
除了DNA外，大肠杆菌的遗传物质还包括RNA。
RNA是细菌基因表达过程中的重要分子，它们参与了蛋白质的合成和转录后加工等过程。
在大肠杆菌中，RNA主要存在于核糖体中，负责翻译过程，将DNA中的遗传信息转化为蛋白质。
总之，大肠杆菌的遗传物质由染色体DNA、质粒DNA和RNA组成，这些分子共同控制着细菌的生命活动和生物学特性。
大肠杆菌质粒提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。
(1)琼脂糖凝胶电泳装置由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。
对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。
使用最普遍的装置是Walter Schaffner发明的水平板凝胶。
水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。
在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。
凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。
凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。
（2）琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。
从大肠杆菌中获得高浓度质粒DNA的方法
再加入另外柱子基质上洗脱 ， 根据所需要浓度 ， 决定 洗脱柱子的个数 。为了提高 回收效率 ， 每个柱子可
以重复 洗一 次 ， 提质 粒 可 进 行 分 子生 物 学 的后 续 所
实验。
的引物进行 Ｐ Ｒ扩增 及琼脂糖 电泳、 胶成像 观 Ｃ 凝
察 ， 一 步 确 定 培 养 质 粒 的正 确 性 。 （ 步 最 好 不 进 此
１ ３ 方法 ．
１ 材 料 和 方 法
１ ｉ 材 料 ．
（） １ 菌液的制备
① 取 一 ０ 保 存 的 含 有 质 粒 的 大 肠 杆 菌 ， 含 ７℃ 在 有卡 那 霉 素 的 Ｌ Ｂ培 养 基 平 板 上 画 线 ， 养 １～２ 培
大肠 杆 菌菌 株与 质粒 ： 株 为 Ｄ ５ 重 组质 粒 菌 Ｈ ａ， ｐＣ Ｂ Ｎ Ｘ— Ｆ含 有 插 入 的 目的片段 Ｂ １ ０ ｂ ） 此 质 Ｆ（ ７ ０ ｐ ，
１ ０ｍｍｏ／Ｌ ］ ＥＤＴ ； Ａ
的要求 。在 基 因 枪 的转 化 体 系 中 ， Ｎ 的用 量 对 ＤＡ
Ｇ Ｓ基 因瞬 时 表 达有 很 大影 响 ［３ ， 转 化 成 功 的 Ｕ １］是 － 重 要 因素 ， 避免 微 弹结成 团块 状 的同时 ， 在 应尽 可 能 增 加 Ｄ Ａ用 量 来 提 高 转 化 效 率 ｊ Ｎ 。质 粒 提 取 试
质 粒 Ｄ Ａ提 取 技术 是 分 子 生物 学 研 究方 法 的 Ｎ
技术 基础 ， 随着分 子生 物技术 的不断发 展 ， 这项技 术 应 用也越 来 越广泛 。不 同生 物技 术公 司 的质粒 提取
粒具有卡那霉素抗性。
主要试 剂包括 ：
卡 那 霉 素购 自鼎 国生 物 技术 公 司 ， 限制 内切 酶
(整理)质粒特性
第四章基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。
①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。
它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。
质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。
其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。
二．质粒DNA编码的表型质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。
质粒类型
在基因克隆中采用的质粒载体的选抗菌素抗性等多种。但绝大多灵敏的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号。基因克隆实验中常用的几种抗菌素的作用方式及其抗性机理列于表4-4。
四．不同类型的质粒载体
（1）高拷贝数的质粒载体
适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。因此，若在处于对数生长晚期的含有ColE1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后，每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到1000～3000个之多。如果加入高浓度的尿核苷，质粒DNA又可进一步扩增2～3倍。
到占细胞总DNA的50%。
（4）插入失活型的质粒载体
选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位点，因此都属于插入失活型的质粒载体。
（5）正选择的质粒载体
正选择质粒载体（direct selection vectors）：这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。
（6）表达型的质粒载体
使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。 一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是一种用于从大肠杆菌中提取质粒的方法。
碱裂解法是其中一种常用的方法，该方法利用碱性条件下DNA的不稳定性，将细胞壁溶解，并使质粒DNA从细胞中释放出来。
本文将介绍碱裂解法的步骤、原理以及优缺点。
碱裂解法的步骤如下：1.大肠杆菌培养：首先从保存在琼脂板上的大肠杆菌菌落中挑取一株菌，接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养过夜，直到菌液呈现较浓的悬浮液。
2.收取大肠杆菌：将培养液离心，除去上清。
用冷凉的纯水冲洗沉淀两次，将菌沉淀重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0。
3.制备碱性溶液：在50 mM Tris-HCl缓冲液中加入0.2 M NaOH 和1% SDS，混匀制成碱性溶液。
4.碱性裂解：将菌悬液与等体积的碱性溶液混匀，使菌细胞在碱性条件下裂解。
孵育数分钟至十几分钟，直至溶液变为粘稠状。
5.酸性中和：加入等体积的3 M醋酸，酸性中和碱性溶液。
此步骤中，质粒DNA会从溶液中析出沉淀。
6.离心：用高速离心将沉淀离心下来，除去上清。
7.溶解：用适量的纯水将沉淀溶解，可以通过轻轻摇动溶液使其充分溶解。
8.纯化：通过离心或其他纯化方法，如柱层析、琼脂糖凝胶电泳等技术，纯化目标质粒DNA。
碱裂解法的原理是利用碱性条件下DNA的不稳定性。
当细胞处于高pH环境中时，碱性条件会破坏大肠杆菌的外膜，使细胞壁失去完整性。
此时，细胞内的DNA易于释放出来，包括质粒DNA。
然后，通过酸性中和反应将质粒DNA沉淀下来。
最后，通过纯化步骤，可以得到高纯度的质粒DNA。
碱裂解法的优点是简单易行，不需要较昂贵的设备和试剂，并且可以在相对短的时间内提取到目标质粒DNA。
此外，这个方法适用于大多数质粒类型和质粒大小。
碱裂解法适用于小规模提取或初步提取，用于大规模提取时效率较低，不推荐使用。
然而，碱裂解法也存在一些缺点。
首先，该方法提取到的DNA含有RNA、蛋白质和其他污染物。
实验五 质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定
4、向管中加入0.4ml LB液体培养 基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养 45分钟,使细菌恢复正常生长状态,并表 达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂 布于含Amp的筛选平板上,正面向上放 置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
２互补法
现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个
大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷 酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏 码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。 当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳 糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲 哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色 菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入 失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过 颜色不同而区分重组子和非重组子。
三、材料
E. coli DH5α（或JM105）菌株（已制备
感受态），转化用的质粒(pUC18)，无菌 1.5mL的eppendorf管 四、仪器 恒温摇床，恒温水浴锅， 电热恒温培养 箱，超净工作台， 微量移液枪
五、试剂
LB固体和液体培养基； Amp
五、操作步骤 1、从-70℃冰箱中取50 μL感受态细胞 悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上； 也可用新鲜配制的感受态细胞在4 ℃冰箱 中隔夜以后使用。 2、 加入0.5 μl质粒DNA溶液,轻轻摇 匀,冰上放置30分钟。 3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴 5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷 的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互 补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
pCas质粒在大肠杆菌中的影响及其移除方法
pCas质粒在大肠杆菌中的影响及其移除方法一、什么是pCas质粒pCas质粒是一种用于实现CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的基因编辑的工具质粒。
它包含以下几个主要元件：•Cas9蛋白编码基因：用于在大肠杆菌中表达Cas9蛋白，这是一种能够识别和切割特定DNA序列的核酸酶。
•sgRNA表达载体：用于在大肠杆菌中表达sgRNA，这是一种能够与Cas9蛋白结合并指导其切割目标DNA序列的单链RNA分子。
•温敏型复制子：用于控制pCas质粒在大肠杆菌中的复制，使其在低温下可以正常复制，而在高温下无法复制而丢失。
•阿拉伯糖诱导的λ-Red系统：用于促进同源重组，在目标DNA序列被Cas9蛋白切割后，将外源DNA片段与切割端连接起来，从而实现基因的插入或替换。
二、pCas质粒在大肠杆菌中的影响pCas质粒虽然是一种有效的基因编辑工具，但是如果一直在大肠杆菌中存在，那么可能会导致以下几个问题：•pCas质粒的复制和表达会消耗大肠杆菌的能量和资源，影响其生长和代谢。
•pCas质粒上的Cas9蛋白和sgRNA可能会对大肠杆菌的基因组造成不必要的切割和重组，引起基因突变或损伤。
•pCas质粒上的温敏型复制子和阿拉伯糖诱导的λ-Red系统可能会失效或不稳定，导致pCas质粒无法在高温下丢失或无法有效地介导同源重组。
因此，如果pCas质粒一直在大肠杆菌中，建议您尽快将其移除，以避免对大肠杆菌造成不良影响。
三、pCas质粒的移除方法您可以通过以下方法来移除pCas质粒：•将含有pCas质粒的大肠杆菌在37°C下培养，利用pCas质粒上的温敏型复制子的特性，使其在高温下无法复制而丢失。
•将含有pCas质粒的大肠杆菌转化另一种带有抗性标记的质粒，利用双重抗性筛选的方法，筛选出只含有新质粒而不含有pCas质粒的细胞。
•将含有pCas质粒的大肠杆菌用电穿孔或其他方法导入一个靶向pCAS复制子的sgRNA，利用CRISPR-Cas9系统切割并破坏pCAS复制子，使其无法复制而丢失。
质粒导入大肠杆菌的方法
质粒导入大肠杆菌的方法
质粒导入大肠杆菌是一种常见的基因转移方法，可用于表达外源蛋白、构建遗传工程菌株等。
以下是质粒导入大肠杆菌的方法：
1. 选择合适的质粒：选择适合自己实验需要的质粒，通常选择含有适当启动子、选择标记和插入位点的质粒。
2. 制备大肠杆菌：制备大肠杆菌并使其处于快速生长期。
建议使用能够耐受抗生素的大肠杆菌菌株，如DH5α。
3. 质粒导入：将质粒导入大肠杆菌中，常用的方法有热激法、电转法、微注射法等。
其中，热激法是最简单的方法，只需将质粒与大肠杆菌一起加热，使其发生热冲击，从而使质粒进入大肠杆菌细胞内。
4. 筛选转化菌株：将导入质粒的大肠杆菌菌液均匀涂布在含有适当抗生素的固体培养基上，培养过程中，只有带有质粒的菌株才能生长。
5. 鉴定转化质粒：将筛选出的转化菌株进行PCR检测、酶切鉴定等，以确认质粒已经成功导入并稳定保存在大肠杆菌中。
总之，质粒导入大肠杆菌是一种简单易行的基因转移方法，能够有效实现外源基因的表达和遗传工程菌株的构建。
- 1 -。
从大肠杆菌中提取质粒DNA
生药0911 黄晶
• • • • •
实验流程 实验原理 实验前准备 实验步骤 补充事项
实验流程
• 大肠杆菌置于LB培养基培 养使质粒DNA扩增 • 收集和裂解细菌 • 分离和纯化质粒DNA
实验原理
质粒独立于染色体外，且 游离于细胞质内或整合在细 菌染色体中。 SDS是一种阴离子表面活 性剂能使细菌细胞裂解，又 能使一些蛋白质变性，释放 出质粒DNA和染色体DNA。
谢谢
实验前准备
• 实验材料：含有质粒 DNA的大肠杆菌DH５α • 实验仪器：塑料离心管 架；10,100,1000µＬ移 液枪；1.5mＬEP离心管； 低温高速离心机一台； 无菌工作台；高压锅； 玻璃仪器及滴管等。
实验前准备
试剂准备： LB培养基； pH为8.0的GET缓冲溶液； 0.2mol/L的NaOH(含 1%SDS）； pH为4.8的乙酸钾溶液； 异丙醇溶液及75%乙醇溶液； pH为8.0TE缓冲液
实验步骤
• GET缓冲溶液中的EDTA 可除去细胞壁上的钙离子， 使溶菌酶更易与细胞壁接 触。 • 加入200µL新配制的 0.，使之混匀，冰浴 5min。 • SDS可使细胞膜裂解蛋白 质变性。
实验步骤
• 加入150µL冰冷的pH为4.8乙 酸钾溶液，加盖后颠倒数次 混匀，冰浴3~5 min。 • 乙酸钾沉淀SDS和SDS 与蛋 白质的混合物，冰浴是为了 沉淀完全。 • 加入等体积的异丙醇混匀， 室温置5min,12000r/min离心 5min,弃去上清液。
实验原理
在碱性溶液中，双链 DNA氢键断裂，DNA双螺 旋结构破坏而变性，由于 质粒DNA分子量相对较 小，且呈环状超螺旋结构， 在高碱性pH条件下两条 互补链不会充分分离，当 加入中和缓冲液乙酸钾时 变性质粒DNA又恢复到原 来的构型；
重组质粒在大肠杆菌中的表达
重组质粒在大肠杆菌中的表达1. 仪器耗材紫外分光光度计（配石英比色杯）、振荡摇床、超净台、细菌培养皿、20ml试管、250ml 三角烧瓶、移液枪、枪头。
2. 试剂及配制（1）LB培养基（100ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，定容至100ml，高压灭菌，4℃保存备用。
（2）LB平板（100ml，Kan+，50μg/ml）：胰化蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5 g，定容至100ml，高压灭菌，水浴调温至50-60℃，加入10mg/ml kan 500μl，旋转混匀，铺制平板（90mm直径的平皿约5个），4℃保存备用。
（3）10mg/ml kanamycin：称量0.5g kan，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
（4）1M IPTG：称量11.915g IPTG，用蒸馏水溶解、定容至50ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装于高压灭菌的1.5 ml离心管中，每管1 ml，-20℃保存备用。
3. 实验步骤（1）构建好的表达质粒转化表达菌株BL-21后，均匀涂布LB培养基平板（Kan+，50μg/ml），过夜培养（约12h）。
（2）挑取2-4个生长良好的单菌落，用20ml试管分别接种于3ml LB液体培养基（Kan+，50μg/ml）中，37℃、250rpm振荡过夜培养。
（3）把以上培养物接种新鲜的LB培养基（Kan+，50μg/ml），二者的体积比为1:100，并且总体积不能超过培养用三角瓶容积的1/5。
（4）37℃、250rpm振荡培养至对数生长中期（OD600约0.4～0.8），此细菌密度必须在1.5到3小时内达到。
（5）取出2ml培养物作为诱导前对照，在剩余培养物中加入IPTG，使终浓度为1mM（最佳用量需摸索），继续培养。
（6）诱导3小时后，取样1ml留存，之后每一小时取样1ml留存，直至8h诱导结束。
质粒在大肠杆菌对噬菌体抗性中的作用
质粒在大肠杆菌对噬菌体抗性中的作用
胡彦民
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】1992(032)006
【摘要】质粒是存在于染色体外的遗传物质。
多年来对大肠杆菌的 F 质粒,col 质粒和 R 质粒的遗传结构、行为和分子性状等已作了深入研究。
在革兰氏阴性菌中存在的质粒常常会改变细胞壁外膜的组成和特性,从而影响到细菌在自然界中的存活。
质粒的这种作用也有重要的实践意义。
本文主要探讨质粒在大肠杆菌对噬菌体抗性中的作用。
发现质粒的存在使细菌对某些噬菌体的感染产生抗性。
其中有些抗性的产生是因为噬菌体不再吸附到大肠杆菌细胞的表面,有些则是其他原因所致。
【总页数】3页(P456-458)
【作者】胡彦民
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.110.3
【相关文献】
1.大肠杆菌VT噬菌体受体基因重组质粒的构建 [J], 严亚贤;陆承平
2.通过大肠杆菌thyA染色体-质粒平衡致死系统构建无抗性基因表达载体 [J], 黄维;曹诚;李平;钟辉;马清钧
3.仔猪大肠杆菌病流行株抗性质粒的研究 [J], 李学伍;杨艳艳
4.大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位 [J], 梁润琴;范昕建
5.大肠杆菌耐药质粒头孢哌酮抗性基因的研究 [J], 梁润琴;范昕建;冯萍;雷秉均;舒煦
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以质粒pbr332举例说明
以质粒pbr332举例说明
大肠杆菌质粒pBR322是以ColE1天然质粒为母体构建的一个典型且重要的人工质粒。
pBR322质粒的特点：
1.具有较小的相对分子量的松弛型质粒；
2.环状双链DNA分子，可嵌入10kb以下的外源片段；
3.具有两种抗药基因（标记基因）——四环素抗性（Tet）和氨苄青霉素抗性基因（Amp）；
4.共含有24中限制性内切酶的识别位点，其中有8种限制酶（Econ V、Noe I、Bash I、Sph I、Sal I、Eag I、Nru I、BspM I、Bsm I）的识别位点位于四环素抗性基因内，3种限制酶（Sca I、Pvu I、Pst I）的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内；将外源DNA片段插入这些位点之一，则会导致相应抗性基因的失活，因此我们可以运用插入失活的方法来检测含有外源DNA的重组子。
5.具有较高的拷贝数，加入氯霉素扩增后，每个细胞可累积1000-3000个拷贝。
由于pBR322质粒的后续重组子筛选比较麻烦，且含有迁移蛋白的作用位点（bom），因此，为了便于直接筛选并提高安全性，Messing
和Vieria在pBR322质粒的基础上构建了pUC18/19质粒。
pUC18/19保留了pBR322的复制起点（缺失控制拷贝数的rop基因），同时也保留了氨苄青霉素的抗性基因，但其序列有改变，不再含有限制性内
切酶识别位点。
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符合基因工程的安全要求。
（1）R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
5-11
5-12
（2）Col质粒：
带有控制大肠杆菌素（colicin）合 成的基因。 大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因， 也可以成为接合型质粒。
5-13
质粒的复制类型
1. 严紧型质粒（stringent plasmid）
拷贝数少，只有1—3份拷贝。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
5-19
外源基因BamH I Amp中存活
但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活
但在Amp中死亡
?
5-20
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、 pUC11、pUC18、pUC19
5-25
（1）元件来源 ① 复制起点: pBR322的 ori ② Ampr 基因: pBR322的Ampr基因 ③ lacZ的启动子: 来自于大肠杆菌 ④ lacZ’基因: 大肠杆菌LacZ的-肽链 序列， 是LacZ 的氨基端片断。
5-6
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
5-7
（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L
SC
5-8
2. 质粒的类型
（1）元件来源
① 复制起点 ori：pMB1系列（来源于 ColE1）的高拷贝型复制起点 ② Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因 ③ Tetr基因： pSC101的Tet r 基因。
5-16
（2）长度 4363bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点 24个克隆位点。
5-23
② 改造EcoR I 位点 pBR325： 使EcoRI 也成为插入失活型位点。
在pBR322位点上接入一段来自噬菌 体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉 素抗性基因cmlr）。
cmlr上也带一个EcoRI位点。
5-24
2. pUC系列 University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改 造而成。属正选择载体。
3. 载体的种类
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
5-1
4. 基因工程载体的必备条件
（1）复制子，在宿主细胞内能独立复制； （2）有选择性标记，有一个或多个鉴于检测的遗传
标记； （3）有一段多克隆位点。位于非必需区内的DNA序
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型DNA polymerase III ）。
2. 松弛型质粒（relaxed plasmid）
拷贝数多，有10—60份拷贝。
（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型 DNA polymerase I ）。
5-14
5.1.2 构建质粒克隆载体的基本策略
（1）去掉非必需的DNA区，保留质粒必需区， 降低分子量；
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）；
3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
5-17
4363bp
5-18
（5）pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
5-3
大肠杆菌的质粒
5-4
5.1.1 质粒的一般生物学特性
（1）分子小： 1—200 kb
（2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性（非必须）。 （3）环形状： 双链环状DNA。
（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。 5-5
（4）质粒的空间构型： ① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒: 能自我转移 非接合型质粒:不能自我转移
5-9
1. 接合型质粒：
又叫自我转移型质粒。 除了带有自我复制所必需的遗传信息外 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
如：F质粒（性质粒、或F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
④ 安全
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。 不能通过接合转移。
5-21
（6）pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
5-22
（7）pBR322的改进 ① 删除mob识别位点 （如质粒pBR327、pAT153等）。 pAT153： 从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
列内含有多个单一的酶切位点；外源DNA插入其 中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。具有较高的遗传稳定性； （5）容易从宿主细胞中分离纯化。
5-2
5.1 质粒载体
质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的双链 闭合环状DNA分子。一般为1-200kb。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
（2）减少质粒本身内切酶位点的数目；
（3）加入易检出的筛选标记；
（4）关于质粒安全性的改造，不发生重组和转 移，不能离体扩增；
（5）改造或增加表达基因的调控序列；如启动 子、增强子等。
5-15
5.1.3 质粒克隆载体的构建
1. pBR322： F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。