大肠杆菌、质粒和噬菌体
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。
由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株，有利于基因克隆，保存质粒，但该菌株的蛋白酶没有缺陷，表达的蛋白容易被降解，因此通常不作为表达菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。
该菌适合表达非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。
该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4、大肠杆菌JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5、大肠杆菌TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
噬菌体(Bacteriophage) ppt课件
性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
1 个体微小、可通过细菌滤器 2 无细胞结构专性细胞内寄生
3
分布广泛
11
1.3 噬菌体的特性
4 裂解或不裂解细菌 5 有抗原性可刺激机体产生抗体 6 能够抵抗热、低温、冰冻等
12
1.4 噬菌体结构
13
1.5 噬菌体的化学组成
核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质
蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部
并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起 寄主细胞裂解的噬菌体。
22
1.7 噬菌体侵染细菌实验
烈性噬菌体侵染细菌的过程
（1）吸附 （2）注入 （3）增殖 （4）装配 （5）裂解
23
1.7 噬菌体侵染细菌实验
24
1.7 噬菌体侵染细菌实验
噬菌体的侵染实验的结果 证 明 了 DNA 是 遗 传 物 质
14
1.5噬菌体的化学组成
噬菌体的一些结构蛋白
15
1.6 噬菌体的分类
按照基本形态可划分为三类： 蝌蚪状（T4）、微球状（ ∮x174） 和丝状（M13）。
16
根据噬菌体结构的不同可将其分为：
1
2
3
无尾部结 构的二十
面体
有尾部结 构的二十
面体
线状体
17
1.6 噬菌体的分类
迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构的二十面体，到目前为 止，研究者至少对5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数(占 96.2% )为有尾噬菌体。
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
大肠杆菌的基本知识概述
大肠杆菌的基本知识概述作者：肖安庆来源：《中学生物学》2010年第11期大肠杆菌是重要的模式生物,在高中生物学中有.多处知识涉及到,如原核生物的基本结构与分裂、T2’噬菌体侵染细菌实验、基因工程常见运载体、大肠杆菌的鉴定、微生物的酶合成调节等。
这些知识涉及点多,分布零散,缺乏系统性,下面就大肠杆菌的基本知识作简要概述。
1认识大肠杆菌的基本历程大肠杆菌是大肠埃希氏菌的俗称,属肠杆菌科埃希氏菌属,1885年埃舍利希氏首次发现。
在相当长的时间内,人们一直把它当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。
直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼禽,常引起严重腹泻和败血症。
根据不同的生物学特性,将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。
2大肠杆菌的基本结构2.1细胞壁大肠杆菌的细胞壁厚约11μm,分外膜和肽聚糖层。
外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分,占细胞壁干重80%,位于肽聚糖层的外侧,主要由磷脂、蛋白质和脂多糖组成。
脂多糖是革兰氏阴性细菌的内毒素,也是革兰氏阴性细菌细胞壁的特有成分,主要与抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关。
肽聚糖层由1—2层网状的肽聚糖组成,占细胞壁干重的10%,是细菌特有的成分,由聚糖链、短肽和肽桥三部分组成。
由,脂蛋白将外膜和肽聚糖层连接起来,从而使大肠杆菌的细胞壁形成一个整体结构。
2.2细胞膜大肠杆菌的细胞膜与其他生物细胞膜的结构相似,但上面的蛋白质含量高、种类多,具有选择透性,可控制营养物质进出细胞。
大肠杆菌的细胞膜含有丰富的酶系,是大肠杆菌的能量转化的场所,参与细胞壁的合成。
2.3细胞质大肠杆菌的细胞质含有糖原颗粒、核糖体和质粒等结构。
2.3.1核糖体大肠杆菌的核糖体包含两个亚基,即50S亚基(23S rRNA、5S rRNA、34种蛋白质)和.30S亚基[16SrRNA、21种蛋白质(S1～S21)]。
高一生物基因工程生物技术的安全性和伦理问题试题答案及解析
高一生物基因工程生物技术的安全性和伦理问题试题答案及解析1.下列哪项不能作为转基因技术中常用的基因运载工具( )A．大肠杆菌B．质粒C．植物病毒D．噬菌体【答案】A【解析】作为运载体必须具备的特点是：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。
常用的运载体有质粒,动植物病毒，λ噬菌体衍生物等，大肠杆菌不能作为运载体。
2.生物学家能够通过基因工程技术生产人的血清蛋白，根据所学知识回答下列问题。
（1）在基因工程的操作中，“分子手术刀”是。
（2）“分子缝合针”是。
（3）“分子运输车”是。
（4）操作步骤：获取目的基因；构建基因表达载体；在基因表达载体的组成中，除了目的基因外，还必须有、和等。
然后把基因表达载体导入牛的，通过发育形成的牛体细胞中都含人的，成熟的牛产的奶中含有，证明基因操作成功。
【答案】（1）限制酶（2）DNA连接酶（3）基因进入受体细胞的载体（或运载体）（4）启动子终止子标记基因受精卵血清蛋白基因人的血清蛋白【解析】基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体，其中限制酶是“分子手术刀”，DNA连接酶是“分子缝合针”，运载体是“分子运输车”。
基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
受体细胞是动物细胞时，往往采用受精卵作为受体细胞，因为其全能性最高。
将人的血清白蛋白基因导入牛的受精卵，该受精卵通过发育形成的牛体细胞中都含人的血清蛋白基因，该基因在牛体内表达，所以成熟的牛产的奶中含有人的血清蛋白。
【考点】本题考查基因工程的工具和步骤。
点评：本题意在考查考生的识记能力，属于容易题。
3.下图是基因工程中某种基本工具作用示意图，此工具是A．限制性核酸内切酶B．DNA连接酶C．质粒D．运载体【答案】A【解析】据图分析，该种限制性核酸内切酶能专一识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开，产生两个带有黏性末端的DNA片段；故选A。
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆
如何构建一个大肠杆菌高效表达的分子克隆？影响基因在大肠杆菌中表达的因素是多方面的，以下我就从载体选择、启动子、终止子、核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数、表达产物的稳定性、受体细胞代谢等方面说明构建大肠杆菌高效表达的方法。
一、表达载体表达载体应具有以下条件：1、能够独立复制。
根据载体复制的特点，可分为严谨型和松弛型。
严谨型载体伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主中拷贝数很少（1~3个）；松弛型的复制而不依赖于宿主染色体，在宿主细胞中的拷贝数可多达3000个。
2、应具有灵活得多克隆位点和方便的筛选标记，便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。
而且多克隆位点应位于启动子序列之后，以使外源基因表达。
3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA聚合酶识别。
4、应具有使启动子受抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。
阻遏子的阻遏作用可由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。
因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖。
而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。
例如可使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使所表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时可减少表达产物的降解。
5、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关基因。
同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。
诱导表达时，由于强终止子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。
因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。
6、所产生的mRNA必须有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列。
二、启动子启动子是表达载体最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。
启动子是在转录水平上影响基因表达。
转录的最大速率取决于启动子中碱基的组成，往往会因为一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。
基因工程载体--质粒
• F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形 因子是雄性决定因子， 因子是雄性决定因子 成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使 成一种叫做性须（ ） 的结果， 经性须进入F 细胞。 细胞则变为F 细胞。 F+经性须进入 -细胞。F-细胞则变为 +细胞。 F因子可以通过接合作用自我转移，也能够 因子可以通过接合作用自我转移， 因子可以通过接合作用自我转移 带动寄主染色体一道转移。 F因子的这种 带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种 整合过程是可逆的。在一定条件下， 细 整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细 胞又可重新变为F+或F-细胞。 胞又可重新变为 细胞。 • 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全 基因工程多选用非接合型质粒， 角度考虑
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子 环形质粒分子
环形染色体DNA 环形染色体DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
质粒DNA 质粒
控制质粒DNA转移的基因 控制质粒DNA转移的基因 质粒DNA
质粒主要包括几个组成部分
• • • • • 复制子（ 复制子（reilcator） ） 复制起始位点(replication origin site) 复制起始位点 多克隆位点（ 多克隆位点（Polylink）(MCS) ） 辅助序列(COS位点等 位点等) 辅助序列 位点等 选择标记(LacZ,抗性等 抗性等) 选择标记 抗性等
基 因 工 程 载体
南 京 农 业 大 学
陈 溥 言
概
述
基因工程是利用酶学方法将不同来源的 DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插 或 ，在体外切割、修饰、 入到不同目的的基因工程载体中，进行扩 入到不同目的的基因工程载体中， 增和表达，研究基因结构和功能， 增和表达，研究基因结构和功能，基因和 蛋白质关系的一种分子生物学技术。 蛋白质关系的一种分子生物学技术。
噬菌体质粒M13可以产生单链DNA
pEMBL8载体
它是通过把M13基因组中一个1 300 bp 的片段导入pUC8中而构建的。M13在形 成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链 DNA变成单链DNA，而被导入的那一段 M13 DNA则含有这种酶识别的信号序列。 尽管这段序列已经从M13噬菌体基因组 中被分离出来，但它的功能还在。所以， pEMBL8也可以转化为单链DNA。
circular DNA molecule,
covalently closed,
6 407 nucleotides
M131噬0 n菌on体o基ver因lap组pi可ng编 码 3g类en蛋es白质，包括复 制蛋白H（ous基ed因in Ⅱa f，lexⅤible和 Ⅹ）p，ro形tei态n c发ylin生de蛋r 白 （基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ）， 结构蛋白（基因 Ⅲ 、Ⅵ、 Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ）。所有结 构蛋白在形态发生之前 都插入在宿主细胞的质 膜中。
■ M13-----filamentous phage
Distal end Proximal end
Gene 7 protein Gene 9 protein Circular ssDNA Gene 8 protein
Gene 6 protein Gene 3 protein
Genome:
Single stranded
A sequence marked “ori” for DNA replication in bacteria; Ampr for ampicillin selection in bacteria; A sequence marked MCS that is a polylinker containing unique restriction sites and two phage RNA polymerase promoters (T7 and T3) in opposing directions. Two cos sequences, separated by an Xba1 site; An origin of DNA replication from SV40 (permits replication and copy number amplification in many eukaryotic cells, in the presence of SV40 T antigen protein); Neor for selection in eukaryotic cells with the neomycin antibiotic analog G418.
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
λ噬菌体的综述
生命科学学院病毒生物学λ噬菌体综述摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长(Lysogenic growth)。
其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。
本文就λ噬菌体的基因组结构、溶关键词：λ噬菌体溶原性溶菌性基因克隆引言：大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107 ，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。
基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。
λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。
感染时吸附位点为细胞壁。
属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。
以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。
用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
1、The discovery of bacteriophage lambda1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg第一个证明了 J. Lederberg和Tatum用来杂交的K-12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。
从此之后，λ噬菌体被广泛用于模式物种；1962年Esther Lederberg的同事并且还是她最好的朋友Allan Campbell首次发现了λDNA整合到细菌DN A的机制；之后由λ噬菌体改造后的载体广泛的用于基因工程。
2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、结构特点：λ为大肠杆菌温和性噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp），因分子两端各有一含12个核苷酸的黏性末端，故又可黏合成环状分子。
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作练习题噬菌体载体(练习题)一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。
2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。
3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。
它有一个复制起点，进行向复制。
λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。
5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为个，取代型为个。
8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。
9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。
11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1)(2) (3) 。
12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。
13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为kb，后者为kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。
基因载体名词解释
基因载体名词解释基因载体是指用于携带、传递和复制基因的分子或生物体。
在基因工程和生物技术领域，基因载体通常是指能够容纳外源DNA序列的DNA分子或细胞，常被用于基因克隆、基因表达、基因转移等实验和应用中。
常见的基因载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样粒子、大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等。
这些载体被广泛用于基因工程实验和技术，在研究和应用中起到了至关重要的作用。
质粒是最常用的基因载体之一，是一种小型环状DNA分子，可以自主复制和传递，对于分子克隆和基因表达都非常有用。
质粒通常具有选择性标记基因（如抗生素抗性基因），可以通过选择性培养来筛选出带有目标基因的质粒。
此外，质粒还可以携带其他附加基因元件，如启动子、终止子、启动子和信号序列等，在基因表达中发挥重要作用。
另一种常见的基因载体是噬菌体，是一种感染细菌的病毒。
噬菌体可以携带外源DNA序列，并在细菌中进行复制和表达。
噬菌体可以用于高效地产生大量目标蛋白，因此在基因表达和蛋白生产中具有广泛应用。
此外，还有噬菌体样粒子，它是由噬菌体的基因组包裹在蛋白质壳中构成的粒子，可以携带大片的外源DNA序列，并在细胞中进行复制和表达，常用于基因克隆和基因转移实验。
在真核生物中，常用的基因载体包括酵母和昆虫细胞。
酵母是一种单细胞真核生物，具有较高的基因组稳定性和蛋白表达能力，在基因工程和蛋白生产中被广泛运用。
昆虫细胞也具有较高的蛋白表达能力，被广泛用于重组蛋白的产生和应用。
总的来说，基因载体是在基因工程和生物技术领域中不可或缺的工具，能够携带外源DNA序列，并在细胞中进行复制、传递和表达。
基因载体的选择和设计对于实现特定的实验目标和应用需求至关重要。
医学微生物学名词解释
医学微生物学名词解释1 医学微生物学：主要研究与人类疾病有关的病原微生物的生物学性状、致病与免疫机制、特异性诊断及防治措施等，是基础医学的一门重要学科。
2 荚膜：是某些细菌在细胞壁外包绕的一层厚度0.2ｕｍ以上，在普通光学显微镜下即可观察到的，与四周界限分明的黏液性物质。
3 芽胞：是某些细菌在一定环境条件下，细胞质、核质逐渐脱水浓缩，在菌体内形成折光性强的圆形或椭圆形的小体。
4 质粒：是细菌核质外的环形闭合双链DNA分子，携有遗传信息，可控制细菌某些特定的遗传性状，可自我复制、自我转移及丢失。
5 鞭毛:是细菌的运动器官，是从细胞膜长出，伸到细胞壁外面的细长呈波状弯曲的丝状物。
6 中介体：是细菌部分细胞膜向胞质内凹陷折叠成囊状物，多见于革兰阳性菌，参与细菌的分裂。
7 菌毛：是某些菌体表面上的一种比鞭毛更细、更短而直硬的蛋白性丝状物。
8 L型细菌：在某些情况下，细菌细胞壁受损后，细菌不一定死亡而成为细胞壁缺陷的细菌，去除诱因后可回复为原菌。
9 内毒素：即革兰阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为脂质A，菌体死亡裂解后才能释放出来。
10 外毒素：是由多数革兰阳性菌和少数革兰阴性菌在生长代谢过程中释放至菌体外、具有毒性作用的蛋白质。
11 菌落：是单个细菌在固体培养基上生长繁殖形成肉眼可见的细菌集团。
12 培养基：是指将细菌生长繁殖所需要的各种营养物质，按照一定的比例，合理调配而成的培养基质。
13 抗生素：是某些微生物代谢过程中产生的一种能选择抑制或杀死其他生物细胞的物质。
14 纯培养：挑选一个菌落，移种到另一个培养基中，生长出来的细菌均为纯种，即纯培养。
15 热原质：是许多革兰阴性菌和少数革兰阳性菌在代谢过程中合成的一种物质，将极微量注入人或动物体内即可引起发热反应。
16 菌苔：在固体培养基上，菌落生长过分密集而形成片状，称菌苔。
17 噬菌体：是侵染细菌、放线菌或真菌等微生物的病毒，具有病毒的基本特性，可分为毒性噬菌体和温和噬菌体。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
大肠杆菌具有多种抗原构造，包括菌 体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗 原）和表面抗原（K抗原）。
大肠杆菌在生物工程中的应用
01
02
03
基因克隆和表达
大肠杆菌是基因克隆和表 达的常用宿主菌，可以通 过质粒载体将外源基因导 入大肠杆菌中进行表达。
蛋白质生产
大肠杆菌可以用于生产各 种蛋白质药物，如胰岛素、 生长激素等。
生物防治
噬菌体可以作为生物防治剂，用于防治某些细菌感染，如食品防腐和植物病害 控制等。
噬菌体的复制和感染机制
DNA复制
噬菌体进入宿主细胞后，利用宿主细胞代谢 系统进行DNA复制，产生多个子代DNA。
蛋白质合成
噬菌体DNA控制宿主细胞代谢系统合成噬菌体蛋白 质，包括头部和尾部蛋白质。
组装与释放
子代噬菌体在宿主细胞内组装完成，通过宿 主细胞裂解或出芽方式释放到外界环境中。
生物催化剂
大肠杆菌可以用于生产各 种生物催化剂，如脂肪酶、 淀粉酶等。
大肠杆菌的致病性
肠道感染
大肠杆菌是肠道感染的主要病原体之一，可引起腹泻、 呕吐等症状。
败血症
大肠杆菌可引起败血症，导致全身感染和多器官功能 衰竭。
尿道感染
大肠杆菌也是尿道感染的主要病原体之一，可引起尿 频、尿急、尿痛等症状。
02 质粒
基因敲除
利用质粒介导的同源重组技术，实 现基因敲除或定点突变。
03
02
表达载体
通过将目的基因插入到质粒上，实 现目的基因的高效表达。
基因治疗
质粒作为基因治疗载体，用于将治 疗基因导入病变细胞。
04
质粒的复制和传播机制
复制机制
质粒通过独特的复制机制， 在宿主细胞内自主复制， 并遗传给后代细胞。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌质粒性质：
5、质粒对于细菌的生长不是必须的
代表性细菌质粒（1）
F因子（fertility factor）
F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中 等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型 （例如β 半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表 达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
缺点：
★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因 编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区 原核：CDNA 真核：DNA
划线到LB平板上。
质粒概述
质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子
不具有胞外期
对寄主细胞来说是非必需的 符合这三条标准的染色体外DNA或 RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的 环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个 大写字母和数字，如pBV220，pET30 。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
郑丽舒
中国疾控中心 病毒病预防控制所
2015.04.15
主要内容
一、大肠杆菌：概述 应用 基本操作 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆
大肠杆菌
大肠杆菌
中文名称： 外文名称： 大肠杆菌 Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)
F质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成： （1）转移组或通过
转座，F因子可以整合到宿主不同位点上。 由于宿主染色体上IS方向不同，所以整合
的方向也随之不同。
代表性细菌质粒（1）
根据大肠杆菌细胞内有无F质粒及其在细胞内存 在状态可将细胞分为四种类型： ● F+ 菌株： F因子独立存在，细胞表面有性菌毛，为带有F 质粒的雄性细胞
帮助从起始AUG处开始翻译。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
★ mRNA的分子结构差异：绝大多数真核mRNA分子的3末端有 poly(A)尾巴，在5末端有一个帽结构。真核mRNA不能结合到细菌核 糖上。 ★ 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统：表达的蛋白质不能进行糖基 化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而蛋
★ 转录信号不同：真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列 细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子
SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：
细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基处， 有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌
16SrRNA3’端识别，结合原核生物核糖体，
培养，直至细菌生长到所需密度。
大肠杆菌生长曲线
将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养 ，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标， 作出的曲线称为生长曲线。 该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一 般分为延缓期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期，各时期的长 短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。
肠致病性大肠杆菌（EPEC） 肠产毒性大肠杆菌（ETEC）
肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）
肠出血性大肠杆菌（EHEC） 肠黏附性大肠杆菌（EAEC） 弥散粘附性大肠杆菌（DAEC）
大肠杆菌在分子生物学中的应用
生物工程用菌株：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞
株系一般称为“工程菌”。大肠杆菌是应用最广泛最成功的首选高效表达 体系；美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。
★ 背景清楚：全基因组测序，共有4405个ORF。遗传背景清楚，并经过一系列 突变筛选，使外源DNA在胞内不易发生重组或修饰，更适于基因操作。
★ 生物安全：生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，在自然条件下无法
生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从 实验室流出，也可避免对自然界造成危害。
质粒概述
质粒DNA的构型：
SC型 OC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） 开环DNA（ocDNA）
L
L型
线性DNA（L DNA）
OC
SC
质粒概述
常见质粒种类： 细菌质粒
真核生物DNA质粒
真核生物RNA质粒
质粒概述
细菌质粒
定义：细菌染色体以外的共价闭合环状DNA分子 ， 立于细胞核进行自主复制。 大小：1-1700 kb之间。携带有数个到数十个甚至上百个基因。 功能：一些基因可产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 能独
● F- 菌株：
无F因子，无性菌毛，但可以通过接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）。 ● Hfr菌株(高频重组菌株)：
F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛
● F′菌株： F质粒从Hfr菌染色体上脱落时，会出现一定概 率的错误，使F质粒带上宿主染色体，这种特殊 的F质粒称为F′质粒。
代表性细菌质粒（2）：
交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；
细菌质粒性质：
2、质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把 质
粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种； 严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随，一般一个寄 主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝； 松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可 以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。如果用一定的 药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。 pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
严紧型
松弛型
细菌质粒性质：
3、可以通过转化（直接吸收摄入）、转导（噬菌体载体）或接合作用(通 过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换)由一个细胞转移到另一个细胞，使 两个细胞都带有质粒；质粒转移时，可以单独转移，也可以携带着染色体
（片段）一起转移，所以可成为基因工程载体。
细菌质粒性质：
4、质粒的不亲合性 定义：在没有选择压力的情况下， 两种亲源关系密切的不同质粒，不 能在同一寄主细胞系中稳定共存。 分子基础:主要是由于复制功能之间 相互干扰造成。有相似的复制子结 构，受到同一拷贝数控制系统的干 扰，使两种质粒最终拷贝数不同， 拷贝数多的质粒在以后的分裂中更 占优势。 ColE1、pMB1; pSC101、F、RP4； p15A,衍生质粒
白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能）。
★ 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，表达的蛋白经 常是不溶的，表达蛋白量超过菌体总蛋白10%时，容易形成包涵体。 ★ 细胞周质中有种类繁多的内毒素很难除去，细菌的蛋白酶可以识别降 解真核生物的蛋白质产物。
应用实例
加拿大人Frederick Banting和Charles Best于1921年首先发现胰岛素 ，1922年开始用于临床，1923年或诺贝尔奖。1965年9月17日，中国科学 家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。 人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随着 细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛 素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌。
分类：根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒 、毒力质粒、共生质粒等类型。
重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生 存在范围：如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis等
细菌质粒性质：
1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过
界：
门： 纲： 目：
原核生物界
变形菌门(Bacteria) γ-变形菌纲(Proteobacteria) 肠杆菌目(Enterobacteriales)
科：
属： 种：
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)
埃希氏菌属(Escherichia) 大肠杆菌种(E. coli)
大肠杆菌一般特征
◆ 原核生物，G-棒状杆菌(红色) ◆ 有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜 ◆ 长度大约2um，宽0.8um ◆ DNA长度约为体长的1000倍 染色体是长约30kb的环状dsDNA ◆ 兼性厌氧，生长需求非常简单，在仅含碳水化合物 和少量氮源及无机盐的培养基上即可生长 ◆ 主要寄生于大肠内，约占肠道菌1%，正常栖居条件下不致病
大肠杆菌
水分 70% 蛋白质 15% 碳水化合物 3% RNA 6% DNA 1% 矿物离子 1% 其他成分 4%
大肠杆菌
Escherich在1885年发现E.coli，广泛存在于人和温血动物肠道中， 44.5℃发酵乳糖产酸产气。最初认为是非致病菌。20世纪中叶，认识 到一些特殊血清型E.coli对人和动物致病，引起严重腹泻和败血症。 根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类：
● 液体LB培养基：每升含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，高压 灭菌15磅30分钟。
● 固体LB培养基：基本同上，加琼脂15克/升。高压灭菌后，冷却至50℃左右 ，可根据需要加入适当的抗菌素或其它试剂，混匀后倒入平皿中。
● 半固体LB培养基：基本同上，琼脂浓度为6克/升。高压后室温保存备用。使 用前在水浴或微波炉溶化。
■ 复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂，划线到LB平板上。
菌株的保存与复苏