Trizol总RNA-打印版
总RNA的提取（Trizol法提取）（PDF）
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
Trizol提取组织总RNA的方法
Trizol提取组织总RNA的方法实验原理：Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA 分离开。
水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
液氮研磨组织：实验准备：研钵、研棒、药匙清洗后高压消毒；线手套、烧杯高压消毒。
材料：1.5mlEP管，200μL EP管（RNA-Free）试剂：Trizol；氯仿；异丙醇；75％乙醇（DEPC处理水：无水乙醇=1:3）；桌面清理干净，酒精擦拭消毒。
1.取出冻存于-80℃的组织，放于液氮中。
2.在研钵中导入部分液氮，对研钵、研锤进行预冷。
取出组织，放入含有液氮的研钵中，左手戴上线手套，外面套两层PE手套，扶住研钵，右手持研锤压碎组织。
Tip：为了防止组织研碎过程中蹦出，左手在刚开始研磨过程中可以护住研钵口；可以用研棒将组织聚集到一起进行研磨，这样更容易捣碎；研磨期间不断加入液氮，防止组织中RNA因温度升高降解；3.研磨完成后，将研磨好的组织粉末收集到已经编号的含有Trizol的EP管中。
如果组织较少，可以将Trizol 的量减半（500μL）。
4.接下来进行Trizol提取RNA操作Trizol 提取RNA实验准备：离心机预冷；70％乙醇预冷值-20℃。
1.将EP管上下颠倒，充分混匀，室温放置5分钟。
2.在通风橱中操作。
加入200ul（0.2倍体积）的氯仿，盖紧盖，剧烈震荡混匀15秒，室温静置5 min。
12000g，4℃离心15min。
Tip：使用1mL的枪吸取。
3.离心后溶液分为三层，RNA存在于上清中，离心管从离心机上拿下来时要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。
吸取上清的时候一定要轻，切忌吸取太多，少量即可（400-500ul），避免碰到下层沉淀。
Trizol法提取总RNA Protocol
Trizol法提取总RNATrizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是基于氯仿-异硫氰酸胍的试剂，能够迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
通过将样品与Trizol试剂混合，可以裂解细胞并释放出RNA。
然后加入氯仿进一步抽提RNA，并通过离心分离出上清液中的RNA。
最后通过乙醇沉淀和洗涤得到纯化的RNA。
所需试剂和耗材1.Trizol试剂：用于细胞裂解和RNA的释放。
2.氯仿：用于抽提RNA。
3.无水乙醇：用于洗涤沉淀的RNA。
4.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
5.1.5ml Eppendorf管：用于RNA的存储。
6.Tips：用于吸取无RNA酶的水和Trizol试剂。
实验仪器1.台式高速离心机：用于离心分离RNA。
2.涡旋振荡器：用于混合样品和试剂。
3.移液器：用于吸取试剂和样品。
4.无菌微量离心管：用于样品和试剂的存储。
5.无菌手套：用于防止RNA酶的污染。
准备工作1.在实验前需要将实验区域和所有实验用具进行清洁和消毒，以避免RNA酶的污染。
2.使用Trizol试剂前需仔细阅读说明书，并确保按照说明书的要求进行操作。
3.为避免RNA酶的污染，需要穿戴无菌手套进行实验操作。
实验方法1.准备无菌的DEPC水，加入DEPC水至10ml，然后加入10μl的氯仿，充分混匀后放置备用。
2.在无菌的1.5ml Eppendorf管中加入100μl的Trizol试剂，加入10μl的氯仿，充分混匀后加入步骤1中制备好的DEPC水-氯仿混合液100μl，再次充分混匀后放置备用。
3.将样品加入到步骤2中制备好的溶液中，充分混匀后加入氯仿，再次充分混匀后进行高速离心，分离出上清液。
4.将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的无水乙醇，充分混匀后进行高速离心，收集沉淀的RNA。
5.用70%乙醇洗涤沉淀的RNA，去除残留的乙醇和盐类，最后将RNA沉淀干燥后重新溶解在水中或指定的缓冲液中。
注意事项1.在加入氯仿之前，不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
脑组织总RNA提取
脑组织总RNA提取（2004-3-22）(20040322rna)(GIBICOBRL LIFE TECHNOLOGIES,TRIZOL Reagent ,CAT.no.15596-026,Store at 2 to 8℃,Size:100ml )匀浆—>相分离—>RNA沉淀—>洗RNA—>重溶RNA-70℃取出脑组织，待其融化，用镊子取部分组织放入EP管（已称重去皮）中，称重292mg(300mg:3mlTrizol，每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL Reagen)将组织转入匀浆器中，加入1mlTRIzol Reagen匀浆(旋转进入，旋转退出)加入2mlTRIzol Reagent（共3ml），混匀（如组织<100mg，可用少量先匀浆，剩余TRIzol Reagen冲洗匀浆器）约每一毫升匀浆液移入一个EP管，15-30℃下孵育5分钟（以使核蛋白复合物完全分解）每管加0.2ml的氯仿,盖紧用力颠倒震晃15秒，15-30℃下孵育2-3分钟，离心{无色上层水相（为TRIzol Reagent体积的约60%,RNA）,中间相（DNA），底部红色酚-氯仿相/有机相（蛋白）}（注：应正确加量否则会不分相。
）4℃ <12000g 15分钟（注：从离心机取出时勿倾斜勿震摇）水相移入EP管（不要搅动交界面，中间相和酚-氯仿相可用来提DNA和蛋白质）加入0.5ml异丙醇混匀，15-30℃孵育10分钟，离心4℃ <12000g 10分钟（RNA沉淀）枪头去上清，加入70% （？？？75%）乙醇（DEPC水配）1ml，涡旋混匀，离心4℃ <7500g 5分钟枪头去上清（注：乙醇洗涤后白色RNA沉淀物会变松,去上清时要小心不要丢掉沉淀物）空气/真空干燥5分钟（时间太长会大大降低RNA溶解性）0.1%DEPC处理的RNAase-free的水溶解20μl/管,轻摇混匀,室温静置20分钟（????反复吹打RNAase-free水，使RNA溶解，55℃-60℃孵育10min）--70℃保存注1：所有器械，EP管，枪头均用用0.1%的DEPC水浸泡24小时,烘干,高压蒸汽消毒玻璃仪器150°C烘烤4 h,塑料仪器在0.5M NaOH中浸泡10min,彻底清洗，高压灭菌消毒超净台内两层手套操作，每次离开均将外层留在超净台内，或回来后更换手套注2：匀浆后加入氯仿前，样品置于-60到-70℃可保存一个月；RNA沉淀物（乙醇）在75%乙醇，-5到-20℃条件下可保存一年鉴定：琼脂糖电泳有明显28S、18S两条带，5S的条带可见但不明显。
Trizol法提取RNA-电子版
Trizol法提取RNA步骤
1．胰酶消化六孔板细胞（每孔相当于3.5cm皿），每孔细胞收于EP管中，PBS洗一遍（或弃旧培养基，1ml PBSA洗2遍，直接向孔中加入600ul Trizol，吹打细胞，并吸入EP 管中即可，无需胰酶消化）；
2．向细胞沉淀中加入600ul Trizol裂解细胞5min；
3．加入三氯甲烷（氯仿）120ul（V三氯甲烷：V Trizol=1:5）提取核酸；
4．振荡10s至粉红色出现时停止，室温静置2~3min后分层；
5．4℃，12000×g，离心15min，离心后，底部为细胞碎片，中间为DNA，上层为RNA产物；
6．吸取上层液相RNA提取液，置另一个EP管中（小心勿吸到沉淀，约为250~300ul）；7．每管加入异丙醇300ul（V异丙醇：V TRIZOL=1:2）（异丙醇为有机溶剂，根据相似相溶原理，RNA不溶于其中，其他杂质溶于其中）；
8．上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置10分钟；
9．4℃，12000×g，离心10分钟，弃上清；
10．用800ul 75%乙醇（用1‰DEPC处理水配制）洗沉淀，振荡器振荡15秒钟；11．4℃，12000×g，离心5分钟，弃上清（挥发乙醇2分钟）；
12．每管加入20~60ul DEPC处理水（示沉淀量而定），金属浴60℃溶解5分钟；13．4℃，12000×g，离心5分钟，吸取上清置于新的EP管中，-80℃冻存；
注意：EP管、移液器头用1‰DEPC水（不能高压灭菌）浸泡过夜，甩干后高压灭菌。
DEPC 处理水配制：999ul+1ul DEPC，高压灭菌。
Trizol法提取蚯蚓组织总RNA
高速离心机
电泳槽
实验过程：
RNA提取
1．蚯蚓先用自来水洗，称重，用灭菌的DEPC水洗涤。
2．将蚯蚓放入研钵中，加入Trizol（0.1mg蚯蚓加1mLtrizol），倒入液氨，使液氮浸没蚯蚓，用研锤研磨蚯蚓成粉末状（注意：此过程需要重复加几次液氮，再研磨）。研磨好后，室温放置，待研钵内固体变成液体后，进行下一步。
Trizol法提取蚯蚓组织总RNA(自己整理)
实验材料：
1 mL tip头：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
200μLtip头：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
10μLtip头：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
1.5 mL和200μL离心管：至少20个，需要用1%DEPC水溶液浸泡过夜。
RNA表征（琼脂糖凝胶电泳）
1.配胶：
1%琼脂糖胶配制：称取0.2g琼脂，加25 mL1×TAE或者1×TBE，电热套或微波炉加热溶解，冷却至不烫手的情况下加入10μLEB，摇匀。
2.将配好的胶倒入电泳槽，待其冷却固化后，轻轻地抽出梳子。
3.拿出一支新的塑料一次性手套，平放在试验台上，将3μLLoading buffer滴在手套上，再将6μLRNA溶液滴到loading buffer上，将此混合溶液加入到凝胶孔（也就是梳子拔出后，在凝胶上留的孔）里，DNA marker直接加到凝胶孔里（marker要放在最边上的孔里）。
7．12000转速离心15分钟。倒掉上清液。
8．向离心管中加入75%乙醇（洗涤RNA，此时RNA还是沉淀）1mL，轻轻摇动后，立刻12000转速离心。
9．倒掉上清液，将离心管盖子打开，轻轻的倒放在干净的滤纸上2min，使管内的液体流出，RNA固体留于离心管底部。
TRIZOL法提取总RNA
目录
• 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 实验优化和常见问题处理
01
实验原理
Trizol的组成和作用
Trizol是一种常用的细胞裂解液，主要由苯酚、异硫氰酸胍和苯酚等成分 组成。
苯酚的作用是使蛋白质变性并释放核酸，异硫氰酸胍的作用是抑制DNA 酶活性，防止DNA降解，同时能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ效地变性蛋白质，使RNA充分释放。
RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳
将RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察28S和18S rRNA条带的亮度及完整性， 判断RNA的质量。
生物信息学分析
将RNA测序数据与基因组数据进行比对，分析转录本的拼接情况，评估RNA的 完整性。
反转录和PCR验证
反转录
将RNA反转录成cDNA，以便进行后 续的PCR验证。
效果。
去除DNA和蛋白质
在提取RNA的过程中，需要去除DNA 和蛋白质等杂质，以避免对后续实验 的干扰。
在去除杂质的过程中，需要注意控制 好离心时间和转速，以保证去除效果。
Trizol法中，DNA和蛋白质可以通过 离心和洗涤的方法去除。在离心后， 上清液中的DNA和蛋白质可以被去除， 而RNA则留在沉淀中。
在使用Trizol法时，通常采用玻璃匀浆器或匀浆机进行匀浆破碎。
抽提RNA
抽提RNA的目的是将RNA从细 胞碎片和其他杂质中分离出来。
Trizol法是一种常用的RNA抽提 试剂，它能够有效地分离出
RNA，同时抑制DNA和蛋白质 的降解。
在抽提过程中，需要按照试剂说 明书进行操作，注意控制好细胞 碎片的浓度和体积，以保证抽提
将提取的RNA存储在无菌环境中， 避免污染。
Trizol法提取动植物细胞组织总RNA
Trizol 法提取细胞/组织样本总RNA1. 所需试剂：名称来源储存条件有效期RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent（R401）仓库4℃1年DEPC水配制间室温1周75%乙醇（DEPC水配）自备室温7天氯仿外购室温1年异丙醇外购室温1年2%琼脂糖凝胶自制室温1天Marker DL5000 仓库室温1年PBS缓冲液自备室温1年2. 所需耗材及仪器：序号名称序号名称1 冷冻离心机 4 制冰机、冰盒和冰2 通风橱 5 电泳仪及电泳槽3 RNase free枪头和EP管 6 OneDrop3. 操作步骤：3.1 细胞样本预处理1）小心倒掉细胞培养液，用移液器吸取5ml 1×PBS缓冲液小心加至培养皿中，轻轻晃动，将残留的培养液洗掉，用枪吸净PBS缓冲液，向每个培养皿中加入2 ml Trizol用枪吹打，使细胞完全悬浮和裂解。
（一般一次提取的1 mg RNA需要10盘HeLa Cell。
）2）将裂解的细胞转移至50 ml RNase Free离心管中，在超净台中分装至1.5 ml RNase Free EP管，每管分装1 ml。
3.2 动物组织样本预处理1）取动物组织样本50-100 mg于1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml Trizol，用匀浆机高速匀浆，直至无明显颗粒状物质；或将动物组织剪成碎块，迅速转移至已用液氮预冷的灭菌研钵内，将组织碎块研磨成粉末，再称取50-100 mg于1.5 ml EP管中，并加入1 ml Trizol 中，用移液器吹打至无明显颗粒状物质。
3.3 植物组织样本预处理1）取新鲜植物组织样本15-30 mg于1.5 ml EP管中，向其中加入1 ml Trizol，用匀浆机高速匀浆，直至无明显颗粒状物质；或将动物组织剪成碎块，迅速转移至已用液氮预冷的灭菌研钵内，将组织碎块研磨成粉末，再称取15-30 mg于1.5 ml EP管中，并加入1 ml Trizol中，用移液器吹打至无明显颗粒状物质。
Trizol法提取总RNA(细胞和组织)
Trizol法提取总RNA
1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol 试剂裂解；
②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；
2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；
3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；
4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；
5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清；
6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）；
7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀；
8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录；
9、进行反转录或分装保存于-80℃。
Trizol法提取组织总RNA步骤
1.研磨制样：先向研钵中加入少量液氮，等液氮挥发使研钵预冷。
再向研钵内倒入适量液氮。
从-70度冰箱取出组织，用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。
迅速研磨组织块，成粉末时加入1ml的trizol，继续研磨，可看到粉末成浆，由浓变稀，直至组织样全部溶解，用移液枪吸到无酶EP管。
2. Trizol法提取RNA
1) 室温静置3-10min，使蛋白质变性；
2) 加入1/4~1/5体积的氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min。
（核蛋白复合体彻底裂解）
3) 吸取上清至无酶的EP管中，加入等体积的酚：氯仿，颠倒震荡1min，室温静置3-5min，静置分层，然后4℃离心，12000rpm，5min，取上清。
若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次，但对于组织一般都要重复该步骤，至没有蛋白层为止，一般抽提两次。
（离心后会分为三次：上层：水相，中间层：DNA，下层：蛋白。
为了降低水相和有机相分界处DNA污染，不要吸取水相的最下层）4) 加入等体积的预冷的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，然后4℃离心12000rpm，30min，弃上清。
（此步骤主要是充分沉淀RNA，然后收集。
故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上，甚至过夜）
5) 加入100ul 70%乙醇，将沉淀吹起来，注意不要吹散，然后4℃12000rpm，5min。
6) 弃上清，空气中挥发乙醇，至壁上无液滴。
7) 加入适量DEPC水，（一般为20ul）溶解。
8) 分光光度计检测RNA浓度和OD值，将Total RNA稀释至1ug/ul，备用。
(完整版)Trizol法提取RNA实验步骤(可编辑修改word版)
Trizol 法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA 质量的高低常常影响cDNA 库，RT-PCR 和Northern Blot 等分子生物学实验的成败。
Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf 管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase 酶非常稳定，是导致RNA 降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase 完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase 的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC 配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free 的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC 使DEPC 的终浓度为0.1%。
注意：DEPC 为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC 水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC 水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30 分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250°C 烘烤3 小时以上。
Trizol法提取总RNA
Trizol法提取总RNA原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。
Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织，5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。
一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。
本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。
保存条件：2~8℃避光保存12个月。
实验前需要准备的试剂：Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水。
实验前需要准备的物品：1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）样品前处理注意点：1.选择新鲜血液，不得超过4小时。
2.选择新鲜组织，生长旺盛的组织。
3.选择新鲜的幼嫩组织。
4.选择处于生长旺盛的时期收集细胞。
RNA纯化要求：1.纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。
2.排除有机溶剂和金属离子的污染。
3.蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
4.排除DNA分子的污染。
RNA提取的注意事项：1.杜绝外源酶的污染。
（1）严格戴好口罩，手套。
（2）实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
（3）实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。
TRIZOL法提取总RNA
TRIZOL法提取总RNA（改进的一步法）Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。
1.在1.5 ml的EP管中加入1ml的Trizol。
2.称取约100 mg的材料，在液氮中研磨，转至上述EP管中。
（材料体积≤Trizol体积的10%）旋涡震荡混匀，15-30℃静置5分钟。
3.去除胞壁残渣、多糖、蛋白、脂肪：离心（4℃，1‚2000 ×g）10分钟。
取上清至一新的EP管中。
4.分相：①加0.2 ml的氯仿，用手剧烈摇晃15秒钟。
15-30℃静置2-3分钟。
②离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）15分钟。
5.沉淀，并去除多糖：①用200μl的枪取无色水相（大约原初Trizol体积的60%，约600μl ）至一新的EP管中。
切勿吸到中间层。
②加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃静置10分钟。
③离心（4℃，1‚2000 ×g，勿超过1‚2000 ×g）10分钟。
倾去上清。
6. 清洗：①用200μl的枪吸除多余上清，加1ml 冰预冷的75% 乙醇，旋涡震荡。
②离心（4℃，7500 ×g）5分钟。
7. 用真空泵吸除乙醇，37℃干燥10分钟。
切勿干燥彻底，否则极难溶解。
8. 加适量的DEPC•H2O（一般20μl），枪打数次，使沉淀溶解。
然后置于55-60℃水浴中彻底溶解10分钟。
迅速冰浴，5分钟，稍离心。
9. 置于-70℃保存。
注意事项：①在第2步静置后，或第3步取上清后，可以在-70℃保存一个月。
②在第6步旋涡震荡后，可在-4℃保存一周，或在–20℃保存一年。
③高盐溶液：0.8M柠檬酸钠+1.2M氯化钠，DEPC处理后高温灭菌。
④通常用0.1-0.15 g材料可以提取 60-100 μg 总RNA。
Trizol法提取细菌总RNA
实验三法提取细菌总一、实验原理主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使释放出来地同时，保护地完整性.加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层.存在于水样层中.收集上面地地水样层后，可以通过异丙醇沉淀来还原.无论是人、动物、植物还是细菌组织，法对少量地组织( )和细胞(×)以及大量地组织(≧ )和细胞(>)均有较好地分离效果.试剂操作上地简单性允许同时处理多个地样品.所有地操作可以在一小时内完成.抽提地总能够避免和蛋白地污染.二、主要试剂和器材溶液氯仿异丙醇乙醇水超净工作台离心管（无）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）. 采用溶液提取细菌地总. 挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液于离心管离心得菌体；、每管加入溶液，盖紧管盖，激烈振荡，室温静置℃，，离心；取上清转入(约 )新地离心管中；、每管加入地氯仿( 体积 )，盖紧盖，剧烈振荡；室温静置；℃, , 离心；小心吸取上层水相，转入另一新地离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化.）、加入倍体积地氯仿，盖紧盖，剧烈振荡；室温静置；℃，，离心；小心吸取上层水相，转入另一已编号新地离心管；、加入地异丙醇( 体积 )，轻轻颠倒混匀；室温，静置；℃，，离心，沉于管底；小心吸去上清；、加地乙醇(预冷)，并轻柔颠倒，洗涤沉淀；℃，，离心；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁；、各管用μ处理过地双蒸去离子水溶解，℃温育，分装，℃贮存(可贮存周)；（二）. 浓度地测定取µ 样品以双蒸水稀释至，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干地石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积地双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定、地光吸收值，根据公式计算地浓度.浓度(µµ) × 稀释倍数()× (µ)纯样品地比值为，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚∕氯仿抽提.该值为时，纯度为最高.（三）. 质量检测将进行琼脂糖凝胶电泳检测，目地在于检测和条带地完整性和它们地比值.一般认为，如果和条带明亮、边缘清晰，并且地亮度在条带地两倍以上，则地质量较好.() 将洗净、干燥地电泳槽和模具，水平放置在工作台上；() 准确称取琼脂糖加入× 中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档 )，待冷却至℃时，加入(终浓度为µ)，充分混匀；() 插入适当地梳子，将温热地凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为，置于室温下凝固；() 待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶；() 用微量移液器将样品µ与上样缓冲液µ混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围地分子量标准作为对照（）；() 盖上电泳槽盖，调节电压，电泳左右；() 电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存.四、注意事项. 制备地关键是要抑制细胞中地分解酶和防止所用器具及试剂中地分解酶地污染.管及头都要用处理( 浸泡过夜后，高压蒸气灭菌).用于实验地试剂，须使用水处理灭菌后地玻璃容器盛装，使用地无菌水须用地处理后再进行高温高压灭菌.最好在超净台内操作.、提取时操作带一次性手套、口罩等，小心、细致、晃动及每次移液要轻；在操作过程中避免讲话等.这样做地唯一目地就是两个，一是小心地污染降解；二是动作过度暴力破坏地完整性.、电泳液需新鲜配制.电泳槽和模具需预先进行处理.. 一般电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般地琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳地时间越短越好(这样也是为了减少外界对地降解)，跑完电泳立刻观察.、需要用染色，染色效果不好，其对双链地效果好.、器材地处理：尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理.（）用（焦碳酸二乙酯）水溶液在℃下处理小时.（）然后在℃下高压灭菌分钟以除去残留地.实验用地器具建议专门使用，不要用于其它实验.。
Trizol提取总RNA-LiCL
鼠疫菌大片段RNA提取方案（LiCL沉淀）【器材准备】（一）试验器材准备1.DEPC处理的水:(DMDC) 0.1%将1ml DEPC加入1L去离子水中，剧烈混匀，37℃过夜后，高压灭菌15-20min.2.0.5×TBE(DEPC处理的水配制):3.玻璃器皿准备玻璃器皿处理：在150℃-200℃烘烤4-6h，可去除RNA酶污染。
4.塑料器材处理：将塑料管、EP管等置于0.5M N aOH浸泡10min,再用灭菌双蒸水彻底冲洗后，高压灭菌。
（二）试剂准备1.3M醋酸钠（分子量82.03，pH5.2 ）用70ml DEPC处理的水溶解24.6g无水醋酸钠，用冰醋酸调pH5.2，用DEPC处理的水定容至100 ml，再高压灭菌。
2.75%乙醇(DEPC处理的水配制)：配制200ml。
方法：取无水乙醇150ml,加入用DEPC处理的水50 ml，即得75%乙醇（DEPC处理）3.5M LiCl（分子量42.39，5M LiCl、20 mM Tris-HCl, pH 7.4, and 10 mM EDTA）方法：取21.2g的LiCl溶于70ml DEPC处理的水，0.2423g Tris, 0.2923 g EDTA,调pH7.4，定容至100ml，高压灭菌。
4. 5×TBE（500ml）Tris （分子量121.14 ,890mM）. 54g硼酸（分子量61.83 ,890mM）. 27.5gEDTA (分子量292.25,20 mM pH 8.0) 2.92 g向烧杯中加无菌去离子水400ml溶解以上成分，调pH 8.0定容到500ml。
用时稀释10倍使用。
【实验步骤】1.细菌培养鼠疫菌122接种至4ml TMH培养基（含100μM FeSO4）中，26 °C培养至OD620nm=0.8-1.0。
培养物20倍分别稀释到2只4ml新鲜TMH培养基（含100μM FeSO4）中，26 °C培养至OD620nm=1.0，收集提取菌体总RNA。
组织总RNA提取
组织总RNA提取（TRIzol法）
1、取冻存癌组织大约50-80 mg放入研钵中，缓慢加入液氮，待组织变脆；
2、反复研磨15 min，期间加3次液氮，等到研磨充分，看不到明显的颗粒，
加入 4 ℃预冷的TRIzol（每10 mg 组织加入200 uL TRIzol）充分和组织接触，快速裂解组织；
3、继续碾磨至澄清后转移至离心管中，加入200uL氯仿充分混匀，室温静置5
min，4度12 000 g离心15 min，吸出上清。
4、离心后取上清至另一1.5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，上下轻轻摇
晃15 s，室温静置10 min；4度12 000 g 离心10 min，弃上清液；
5、加入75%乙醇(DEPC 水配制)漂洗RNA 沉淀2 次，涡旋后8 000 g离心5
min；弃尽上清(除尽乙醇)，室温干燥RNA 沉淀，每20 mg 组织加入10 uL 的DEPC 水溶解，测定RNA 浓度。
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Trizol Reagent提取总RNA操作
1> 收集器具，清洁超净台（用75%酒精擦拭），离心机4℃预冷20min。
于-70℃
冰箱取样放在冰盒。
2> 戴乳胶手套，拿纸杯捏出小嘴，倒入2/3液氮。
然后将样丢入液氮中。
3> 将25-50mg左右组织放入匀浆器内研磨，加1 ml Trizol 试剂匀浆，转入1.5ml
的eppendorf 管中。
（注意研磨时间不能长于1min，并在低温研磨。
）
4> 4℃ 12000g离心15min后,将上清液转入新的eppendorf管中。
5> 上清液*在15~30℃下温育5min后，然后加入200μl氯仿，盖紧离心管，用
手剧烈摇荡离心管15秒（约50下），15~30℃下温育10min。
6> 4℃，12000g离心15min。
混合物分层。
（配1%或1.2%或1.5%琼脂糖胶）
7> 将上层水相转移到新的eppendorf 管中，加500μl异丙醇沉淀RNA（温柔震
荡一下），15~30℃下温育10min。
（关键步骤：蛋白质在中间层，避免吸入蛋白造成污染）
8> 4℃，12000g离心10min。
（配75%乙醇）
9> 去除上清，加入至少1ml的75%乙醇洗涤，涡旋振荡样品至脱下管壁并碎开，
然后4℃，7500g 离心5min沉淀。
10> 小心弃去上清液，然后空气或真空干燥5~10min。
（注意不要干燥过分，否
则会降低RNA的溶解度）
11> 加40μl无RNA酶（RNase-free）的水，（用枪头吸几次后）于55~60℃下
温育10min,溶解RNA。
12> 分装在PCR管中，每个样品分两管装，即10μl一管和剩余一管。
10μl的
PCR管中2μl用于分光光度检测，8μl用于电泳检测。
剩余的在-70℃保存。
[注意]
1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、样品总量不能超过trizol总量的10%，超过时trizol要多加。
3、电泳是每次都换缓冲液
4、加氯仿前的匀浆液*可在-70℃保存一个月，RNA沉淀可在75%乙醇中4℃保
存一周，-20℃保存一年。
除去RNA中的基因组DNA 【备选】
1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量50 μl。
全RNA 20～50 μg
10×DNase I Buffer 5 μl
DNase I（RNase-free，5 U/μl 2 μl
RNase Inhibitor（40 U/μl）0.5 μl
DEPC H2O up to 50 μl
2. 短暂离心，37℃反应20～30分钟。
3. 加入50 μl的DEPC H2O。
4. 加入100 μl（等量）的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1），充分混匀。
5. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
6. 加入100 μl（等量）的氯仿/异戊醇（24 ：1），充分混匀。
7. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
8. 加入10 μl（1/10量）的3 M NaOAC（pH5.2）。
9. 加入250 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
10. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
11. 用适量的DEPC H2O溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA。