微生物的生理生化反应

微生物生理生化反应

微生物生理生化反应实验原理通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。

某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。

V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。

微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。

有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。

某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。

实验材料和方法：材料：培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基；菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）；试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素；仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。

实验方法：1.V-P反应取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。

置于37℃恒温箱中培养48小时。

取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。

微生物的生理生化反应

实验六微生物的生理生化反应一、实验目的掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。

二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。

具体个原理如下：1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。

3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。

酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。

若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。

4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。

①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。

本次不做该试验。

②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。

③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。

由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。

④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。

微生物的生理生化试验

二、蛋白质代谢试验
1、吲哚（indole）试验（又称靛基验目的：通过不同细菌对氨基酸之羧基的分解能力来鉴别细菌。原理：细菌产生的脱羧酶可脱掉氨基酸之羧基，生成胺和CO2 ，使培养基PH升高，指示剂显色。常用氨基酸有三种： a、赖氨酸：经过赖氨酸脱羧酶作用生成尸胺和CO2 。 b、鸟氨酸：经过鸟氨酸脱羧酶作用生成腐胺和CO2 。 c、精氨酸：经过精氨酸脱羧酶作用生成精胺和CO2 。
二、蛋白质代谢试验
7、尿素酶试验
三、碳源和氮源利用试验
1、柠檬酸盐利用试验目的：用于肠杆菌科细菌的鉴定。原理：细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，能在除柠檬酸盐外不含其他碳源的培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性。
一、糖类代谢试验
1、单糖分解反应：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖
一、糖类代谢试验
2、氧化-发酵试验（OF试验）细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有氧参加的称为氧化型，有氧无氧都可以分解葡萄糖的称为发酵型，不分解葡萄糖的称为产碱型。方法：穿刺两只斜面琼脂，一只滴加无菌液体石蜡，高度不少于1cm，35℃培养48小时。结果：两只均为黄色为发酵型，均不变为产碱型或不分解塘型，不加石蜡的变黄而加石蜡未变黄为氧化型。
微生物的生理生化试验
微生物的生理生化试验

不同的细菌分解利用糖类、脂肪类和蛋白质类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不同，通过检测微生物的不同代谢产物和代谢过程中不同的酶系统，达到鉴定细菌的目的。

包括糖类代谢试验、蛋白质代谢试验、碳源和氮源利用试验、呼吸酶类试验以及其他酶类试验。
三、碳源和氮源利用试验

微生物生理生化反应范文

微生物生理生化反应实验原理通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。

某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。

V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。

微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。

有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。

某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。

实验材料和方法：材料：培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基；菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）；试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素；仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。

实验方法：1.V-P反应取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。

置于37℃恒温箱中培养48小时。

取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。

微生物生理生化鉴定

2021/10/10
3
糖发酵试验
大肠杆菌：产酸产气
大肠杆菌分解糖类产生多种有机酸，使培养液呈酸性；产生的甲酸在酸性条件下可进一步裂解生成H2和CO2
发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂由紫色(pH6.8)变为黄色(pH5.2)；气体的产生可由倒置的德汗氏小管中有无气泡来证明。
2021/10/10
4
乳糖发酵试验
2021/10/10
19
结果观察
糖发酵试验：产酸：指示剂使培养基由紫色（pH6.8）
转变为黄色（pH5.2）；产气：倒置的德汉氏小管内有气泡产生。
吲哚试验：在培养液中加入乙醚约1 ml，充分振荡，
使吲哚溶于乙醚中。静置片刻，待乙醚层浮于液面后形成明显的乙醚层，再沿管壁加入吲哚试剂8-10滴。如有吲哚存在，则乙醚层呈现玫瑰红色，为阳性反应。
2021/10/10
15
操作步骤
编号：用记号笔在各试管上分别标明培养基名称和所接种的菌名。
接种：取盛有葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基试管各3支，分别按编号1支接种大肠杆菌，另1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。再将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接种于2支蛋白胨水培养基、2支葡萄糖蛋白胨水培养基和2支柠檬酸盐斜面培养基中。
10
伏-普试验原理
产气杆菌： V.P.试验阳性大肠杆验
大肠杆菌：– 产气杆菌：+
阳性阴性
2021/10/10
12
IMViC 试验
柠檬酸盐试验：用来检测细菌利用柠檬酸的能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使 pH升高，当用溴麝香草酚蓝作为指示剂时，培养基颜色发生变化。溴麝香草酚蓝变色范围为，pH6.0-7.6呈绿色，pH＞7.6时呈蓝色。

细菌生理生化实验

细菌生理生化试验—小木虫微生物生理生化反应就是指用化学反应来测定微生物得代谢产物,生理生化反应常用来鉴别一些在形态与其它方面不易区分得微生物。

因此微生物生理生化反应就是微生物分类鉴定中得重要依据之一,微生物鉴定中常用得生理生化反应如下所示:(一)糖、醇发酵试验原理:不同微生物分解利用糖类得能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。

可用指示剂及发酵管检验、有些细菌分解某些糖(醇、苷)产酸(符号:＋)、产气(符号:○),培养基由紫(蓝)变黄(指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄得结果),并有气泡;有些产酸,仅培养基变黄;有些不分解糖类(符号:－),培养基仍为紫(蓝)色、培养基配制:一般细菌常用休与李夫森二氏培养基:蛋白胨:2g,Ｋ2ＨPO4 :0.2ｇ,NaCl:5g,糖(醇、糖苷):1％,水洗琼脂:5～６g,蒸馏水:1０0０mL,PＨ:6、８～７.0,溴百里酚蓝:1％水溶液３mL(先用少量得9５％乙醇溶解后,再加水配成1％水溶液)。

先调PH后再加指示剂。

芽孢杆菌培养基配制:(NH４)2ＨＰO4:１g ,ＭｇＳO4:０.2g ,KCl:0。

２ｇ,酵母膏:０.２g ,糖(醇、糖苷):1％水洗琼脂:5～6g ,蒸馏水:100０mL ,溴甲酚紫:0、４％乙醇液2mL,ＰH:６、8~7。

0。

先调PH后再加指示剂。

将以上培养基分装试管,培养基高度约为４～5cｍ,115℃灭菌20min、测定得糖(醇、糖苷)类可以包括:葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖(１、5%)、半乳糖(１.５％)、D—山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。

注意:以上亦可用液体培养基。

接种与观察结果:用18～２4h得幼龄菌种,用穿刺针接种于培养基中,适温培养1d,３d,5d后观察,颜色变黄为阳性,不变为阴性;有气泡产生为产气。

结果记录:产酸:+,产气:○,不产酸长气:- 。

(二)淀粉水解试验原理:某些细菌可以产生分解淀粉得酶,把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。

细菌的生理生化实验

温（37度15~30min）——观察结果
紫色无气泡，❖既不1产、酸列也不表产气记用录- 表实示；验结果
R实验阳性，用 + 表示；
❖ 2、思考题：第4小题颜色（正面、反面、边沿、中心）
步骤：配制蛋白胨水培养基——接种——培养（约24h) ——加入指示剂甲基红1~2滴——观察结果
表面状况：湿润、粘稠或干燥，隆起或扁平，厚或薄，是否粉末状
❖ 步骤：配制蛋白胨水培养基——接种——培养（约24h) —— 加入指示剂甲基红1~2滴——观察结果
❖ 结果： ❖ 红色——M.R实验阳性，用 + 表示； ❖ 不变色——M.R实验阴性，用 - 表示；
V.P实验
V.P实验
❖ 步骤：配制蛋白胨水培养基——接种——培养（约
24h) ——5~10d 40%KOH, 5~10d 5%a-奈酚和少量肌醇，取出塞子，用力震荡，保温（37 度15~30min）——观察结果
缺少甲酸氢解酶——产酸不产气
有水解圈—淀粉水解实验阳性，用 + 表示；
❖ V.P实验和M.R实验：大肠杆菌、产气杆菌由于不同的微生物可能具有不同的酶，代谢途径和代谢产物可能也有不同，生理生化反应是微生物分类鉴定的重要指标之一。
表面状况：湿润、粘稠或干燥，隆起或扁平，厚或薄，是否粉末状
把微生物细胞在一定的条件下培养，通过观察生理现象和检查代谢产物，可以了解微生物的代谢过程和代谢的特点
四大类细胞型微生物菌落的鉴定
❖初步鉴定
v确证：显微镜观察
微生物菌落特征的记录和描述
❖菌落形态：形状，边缘情况 ❖大小： ❖表面状况：湿润、粘稠或干燥，隆起或扁平，厚或
薄，是否粉末状 ❖质地：致密或疏松 ❖蔓延程度： ❖与培养基结合程度 ❖颜色（正面、反面、边沿、中心） ❖气味

微生物鉴定的生理生化反应汇总

微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。

用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。

利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。

生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。

一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。

检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。

(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。

所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。

将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。

若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。

(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。

不分解糖则无变化。

(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。

即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。

表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。

实验九微生物的生理生化反应

思考题
1. 假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？（P120，2 ） 2. 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨的酶活性的指示剂，而不用丙酮酸? P123，2（2）
糖发酵试验
• • • • •
IMViC反应：吲哚实验：甲基红实验 V.P.实验柠檬酸盐实验
• H2S实验
吲哚试验: 检查吲哚的产生有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中
的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
甲基红试验：检查微生物利用葡萄糖产酸的情况细菌代谢糖产生的有机酸会使培养基变酸，可通过加入的甲基红指示剂（PH6.3 橘黄色-PH4.2 红色）。尽管所用的肠道菌都能发酵葡萄糖产生有机酸，大肠杆菌和产气杆菌在培养早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性PH4.0，而产气杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇，丙酮酸等。
结果观察
实验名称糖发葡萄糖发酵实酵验乳糖发酵吲哚实验 IMVi 甲基红实 C反验应 V.P实验柠檬酸盐实验 H2S实验培养基葡萄糖发酵培养基乳糖发酵培养基蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基葡萄糖蛋白胨水培养基柠檬酸盐培养基 H2S培养基菌种大肠、产气大肠、产气大肠、产气大肠、产气大肠、产气大肠、产气大肠、变形产生红色玫瑰吲哚丙酮酸分解为小分子酸，使得培养基颜色变红丙酮酸不分解，氧化后与 α-萘酚形成红色可以利用柠檬酸盐，pH升高，颜色变蓝产生PbS黑色沉淀现象颜色变化、有气泡积聚
• 硫化氢试验：检测硫化氢的产生
有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸等产生硫化氢，

实验6-微生物的生理生化反应

实验六微生物的生理生化反应1、实验目的探究菌株在碳源同化、氮源利用、乙醇发酵和抗生素效价分析等方面不同的生长特性，观察并简要分析不同微生物的生理生化特征及其形成机理。

2、实验过程简述2.1 培养基与试剂准备2.1.1碳源同化培养基准备碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、松三糖、可溶性淀粉、α-甲基葡萄糖苷的YNB 培养基，放入一根杜氏管。

2.1.2氮源同化培养基准备氮源为硫酸铵，尿素，蛋白胨，硝酸钾，无氮源YNB 的固体、液体培养基。

2.1.3 乙醇发酵用种子培养基：YPD 培养基2.1.4乙醇发酵用发酵培养基葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，尿素，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙。

2.1.5抗生素效价测定用培养基：LB 培养基2.1.6青霉素：用pH 6.0 磷酸缓冲液配制，浓度为100 mg/ml，0.22μm 孔径过滤灭菌。

2.2 微生物的碳源同化和发酵1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。

2、取200 μl 菌悬液，分别转接于含杜氏管的小试管中，静置培养48 h。

3、每24 h 观察记录生长和产气情况。

4、根据实验结果判断不同菌株对不同碳源的同化或发酵。

2.3 微生物的氮源利用1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。

2、取200μl 菌悬液，分别转接于上述培养基小试管中，30℃或37℃静置培养48 h。

3、各取20μl 菌悬液，分别划线于不同氮源的固体平板上，待菌液被吸收后，培养皿倒置，静置培养48 h。

4、每24 h 观察记录生长情况，48 h 测定液体培养物的OD 600。

5、根据实验结果判断不同菌株对不同氮源的利用能力或偏好性。

2.4 酵母菌的乙醇发酵1、种子液培养：将酿酒酵母从菌种斜面上接一接种环至YPD 种子培养基中，30℃，200rpm，培养18 h。

2、乙醇发酵：按照10%（v/v）的比例将培养好的种子液接入100 ml 发酵培养基中，用无菌塑料布将封口密封，30℃，静置培养，每24 h 手摇1 次，发酵3-4 d。