dna分子标记原理与技术

PCR仪
✍ PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
✍ Taq DNA聚合酶
来源：水生栖热菌 Thermus aquaticus
特性：良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能
1.3.2 PCR引物设计
❶ 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
发育时期特异性。且有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度，因此 其实际应用受到一定限制。
同工酶与等位酶
✍同工酶与等位酶
电泳可区分的同一种酶（系统）的不同变化。
同工酶(isozyme)：广义是指生物体内催化相同反应而分 子结构不同的酶。催化相同的化学反应，但其蛋白质分 子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的 一组酶 。
中经常遇到的问题及解决方法。。
1.1 遗传标记的类型及发展
✍遗传标记(genetic markers)是研究生物遗传 变异规律及其物质基础的重要手段。遗传 标记主要有4种类型: ❶ 形态标记（morphological markers） ❷ 细胞学标记（cytological markers） ❸ 生化标记（biochemical markers） ❹ 分子标记（molecular markers）
例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种 LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。
又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普 查可以推测物种的地理来源、分类等。
动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比 较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴 定亲子关系。
✍ DNA的功能
DNA的基本功能作为生物遗传信息复制的模 板和基因转录的模板，它是遗传繁殖的物质 基础。
基因组（genome）： 一个生物体的全部基 因序列。最简单的生物如SV40病毒的基因组 仅含有5100碱基对（base pair bp）， 大肠杆 菌基因组的大小为5700千碱基对（kbp），人 的基因组则由大约3.0×109个bp组成。
的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。监测指标为 A260的变化。
常用的变性方法为加热。
增色效应（hyperchromic effect）：DNA解链过程中，其A260增
加，并与解链程度有一定的关系
解链曲线：在连续加热过程中以温度对A260的关系作图。
解链温度：DNA变性从开始到完全解链是在一个相当窄的范围
❸ 生化标记（biochemical markers）
☛ 生化标记主要包括同工酶和等位酶标记, 同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式; 等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子
形式。 分析方法是从鱼类组织的蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色
法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。 与形态标记、细胞学标记相比，生化标记具两个方面的优点： 一是表现近中性，对经济性状一般没有大的不良影响； 二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。 但目前可使用的生化标记数量还相当有限，同时有组织特异性和
等位酶(allozyme)：由同一个位点的不同等位基因编码的 同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同。
同工酶与等位酶
分析的过程
材料的采集
研磨和酶的提取
酶的保存
凝胶制备
电泳
凝胶切片
酶的组织化学染色
数据分析
酶谱的记录与分析
同工酶与等位酶
☛ 酶谱照片
在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、 杂交育种和个体发育、组织分化等。
步骤：①变性 94-95℃ DNA双链解旋
②退火 55℃ 与引物结合
③复制 72℃
应用：①生物进化和古人类学研究
②法医学
预变性
(92-95C,2-5m)
变性
(92-95C,30s)
PCR 的 一 般 过 程
(25-35)
复性
(40-60C,30s)
延伸
(72C,30-60s)
总延伸
(72C,7m)
细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用同 工酶谱的比较来确定。
在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织 的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过 程。
分子标记
☞ 分子标记指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特 征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。 与上述三种标记相比较，分子标记具有许多明显的优越性， 表现为：
许多标记表现为共显性
• 能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整 的遗传信息
遗传标记
与目标性状共分离 易于识别
可遗传
❶ 形态标记（morphological markers）
☛形态标记即鱼类的外部形态特征。 形态标记简单直观、经济方便；但其数量在多
数植物中是很有限的，且多态性较差，表现易 受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁。 此外形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合 的过程，周期较长。因此,形态标记在作物遗传 育种中的作用是有限的。
1、解以Souther blot 、 PCR为基础,能用于遗传多 样性研究的分子标记技术,包括RFLP、RAPD、 AFLP、SSR、ISH、DDRT-PCR、SNP 等.
2、DNA结构与功能
3、PCR技术
4、 SSR分子标记技术 基本原理、 SSR 分子标记技 术基本操作方法； SSR分子标记技术的应用、实验
1.2.3 DNA的理化性质及应用
✍核酸的一般理化性质: 多元酸，较强的酸性; DNA为线性高分子，粘度极大，而
RNA分子远小于DNA，粘度也小得多; 由于碱基成分的紫外吸收特征，DNA和
RNA溶液均具有260nm紫外吸收峰。
✍ DNA的变性
DNA变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间
✍分子标记的种类与历史
蛋白质：同工酶(等位酶)上世纪六十年代以来 核苷酸序列和片段：tRNA（1965） 1980年以来：RFLP 1984年以来：SSR 1990年以来：RAPD 1993年以来：AFLP 1996年以来：DDRT-PCR
1.2 遗传物质——DNA
✍ DNA结构原理 ✍ DNA分子的结构与功能 ✍ DNA的理化性质及应用
生化标记
DNA分 子标记
细胞（染 色体标记）
形态学 标记
相对于其他技术， 它有何优势呢？
DNA分子标记的优势
直接以DNA的形式表现
• 在生物体的各个组织/各个发育阶段均可检测 到
数量极多
• 遍布整个基因组，可检测的基因几乎是无限的。
多态性高
表现为中性
• 环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变 基因结构，即DNA 的核苷酸序列
1、产卵量大 2、体外受精 3、体外孵化
重点研究内容:
1、解以Souther blot 、 PCR为基础,能用于 遗传多样性研究的分子标记技术,包括 RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISH、 DDRT-PCR、SNP 等. 2、DNA结构与功能 3、PCR技术 4、分子标记技术 基本原理、 分子标记技 术基本操作方法； SSR分子标记技术的应 用、实验中经常遇到的问题及解决方法。
经过30次循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
1.3.1 PCR原理
模板ＤＮＡ
PCR原理 １变性
5
3’
’
3’
5’
PCR原理 １复性
5 ’
引物１
3’
3’
引物２
5’
PCR原理 １延伸
PCR原理 ２变性
PCR原理 ２复性
PCR原理 ２延伸
PCR原理 ３变性
PCR原理 ３复性
PCR原理 ３延伸
内完成 的。这一范围内A260达到最大值的50%时的温度称为解链 温度，又称为融解温度（melting temperature，Tm）。
Tm的大小与其所含碱基中的G+C比例相关，G+C比例越高，
Tm值越高。
✍ DNA分子杂交(hybridization)
双链DNA
单链DNA
杂交
在DNA复性过程中，双链分子的再形成可以发生在序 列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分 互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间 ，这种现象称 为分子杂交。
❷ 细胞学标记（cytological markers）
☛ 细胞学标记即鱼类细胞染色体的变异。各个物种的染色 体都有特定的特征。 包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、 着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化 与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些 重要基因的染色体或染色体区域定位。但细胞学标记材 料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大； 同时某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以 用细胞学方法进行检测。 因此，到目前为止，真正应用于作物遗传育种研究 中的细胞学标记还很少。
❶ 直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个 发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在 表达与否等问题.
❷ 数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限. ❸ 多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造. ➍ 表现为中性，不影响目标性状的表达. ➎ 许多标记表现为共显性的特点，能s of Molecular Markers）
DNA分子标记技术在鱼类种质 鉴定研究中的应用
师丹丹
分子标记技术可用于：
突变分析
性别鉴定与控制
构建分子遗传 图谱和基因定位
分子标记技术
DNA分子标记 辅助选种
基因的监测、 分离和克隆
亲缘关系的分析
鱼类作为实验动物，比哺乳动物等具有更多 的优点：
聚合酶链式反应
✍聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是 一项在短时间内大量扩增 特定的ＤＮＡ片段的分子 生物学技术。
关于PCR，您能告诉我们……
PCR（聚合酶链反应）——快速取 得大量DNA片段的方法
原料：样品DNA、引物（RNA）、DNA聚 合酶、 脱氧核苷酸（dATP，dCTP，dGTP， dTTP）
1.2.1 DNA结构原理
✍ DNA双螺旋的发现 ✍ 典型双螺旋结构
1.2.2 DNA分子的结构与功能
✍ DNA的超螺旋结构
原核生物：大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状 双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。
真核生物：DNA和蛋白质组装成染色体，染色体的基 本单位是核小体。
核小体由DNA和组蛋白构成。组蛋白有H1，H2A， H2B，H3和H4。 H2A，H2B，H3和H4各两分子构成核小体 的核心，称为组蛋白八聚体。DNA双螺旋分子缠绕在八聚体 上构成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA 和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠状结构。核小 体进一步旋转折叠形成棒状染色体，将近1 m长的DNA分子 容纳于直径只有数微米的细胞核中。
体.
分子标记
✍广义的分子标记是指可遗传并可检测的特异 DNA序列或蛋白质。
狭义的分子标记仅指DNA或(RNA)标记，而 这个界定现在被广泛采纳。
✍目前，分子标记技术（这里指DNA或cDNA分 子水平上的多态性检测技术）已有:
✓RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)、 ✓RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)、 ✓AFLP (Amplified fragment length polymorphisms)、 ✓SSR (Simple sequence repeats)、 ✓GISH (Genomic in situ hybridization) 、 ✓mRNA DD (mRNA Differential Display) 、 ✓SSH (Suppression Subtraction Hybridization) 、 ✓AP-PCR (Arbitray-primer PCR)、 ✓DAF (DNA amplified fingprinting)、 ✓SPARs (Single primer amplification reactions) 、 ✓ SCARs (Sequenced characteried amplified regions)、 ✓AMO (Anchored Microsatellite Oligonucleotides) 、 ✓STS (Sequenc-tagged Site) 、 ✓ SNP (Single Nucleotide Polymorphism) .