兽用疫苗耐热保护剂的种类及作用机理

2011.4
21世纪是动物疫苗飞速发展的世纪，不仅研
究出了大量细菌和病毒的灭活疫苗以及弱毒疫苗，而且生产出了基因工程疫苗，为畜牧业的发展作出了巨大贡献。

我国动物疫苗的发展面临着新的挑战。

目前，动物疫苗中，活的冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，虽然其外型稳定、易溶性良好、成本低廉、保存方便，但其热稳定性和保护功能差，而且产品对冷链的要求高。

2～8℃条件下，保存期只有3～6个月，大多需要在-15℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大的困难[1]。

发达国家在20世纪80年代就已开始进行耐热保护剂的研究，而且保护剂的研究和应用属于专利资料，各国都处于保密状态。

我国在耐热保护剂方面的研究虽起步较晚，但现在取得了一定的成果，如王栋等[2]已经研制出一种耐热冻干保护剂，用此保护剂的疫苗在2～8℃条件下保存24个月后，病毒滴度无明显下降。

虽然耐热保护剂的研究取得了一定成果，但仍未全面推广应用。

随着我国畜牧业的快速发展，我国动物及动物产品进出口地贸易的不断扩大，加快新型有效的耐热保护剂的研究和应用，提高动物疫苗的质量，切实做好动物疫病防控工作，迫在眉睫。

1耐热保护剂的种类
１．１按分子量分类按分子量大小可分为低分子量和高分子量化合物以及天然混合物。

低分子量化合物，又可以分为酸性物质、中性物质和碱性物质。

酸性物质主要为谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸、乳酸等；中性物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇、DL-苏氨酸、肌醇、木糖醇等；碱性物质主要为精氨酸和组氨酸等。

高分子化合物主要为白蛋白、黏性蛋白、明胶、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、肉汁、果胶、阿拉伯胶、羟甲基纤维素、藻类等。

天然混合物如脱脂牛奶、血清等。

低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用，高分子化合
物可促进低分子化合物的保护作用。

一般制备保护剂时，多将低、高分子化合物配合使用[3-7]。

１．２按浓度与升华速度关系分类根据升华速度分为两类，一类浓度增加时升华速度降低；另一类则不存在这种现象。

将上述两种保护剂结合，则可以增加升华速度。

１．３按功能和性质分类可分为填充剂、防冻剂、抗氧化剂、酸碱调整剂、缓冲剂、羟基中和剂。

填充剂能防止有效物质随水蒸气一起升华飞散并使之成形，如甘露醇、乳糖、明胶等；防冻剂能防止和减少冷冻过程结晶水的形成，如甘油、二甲亚砜、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等；抗氧化剂能防止保存过程中的氧化反应，如维生素D 、维生素E 、蛋白质水解物、硫代硫酸钠等；酸碱调整剂能将pH 值调整到活性物质的最稳定区域，如磷酸、山梨醇、EDTA （乙二胺四醋酸二钠）、氨基酸等；其他物质如葡聚糖、脱脂乳、谷氨酸钠、硫脲、碘化钾等。

１．４其他类型吐温80、普朗尼克、布里杰、十二烷基磺酸钠及抗坏血酸等一些表面活性剂或还原剂对冷冻及干燥过程中的蛋白质有一定的保护作用[8-9]。

2耐热保护剂的作用机理
目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳定的机理之一是优先作用原理，即蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用，保护剂存在时，细胞膜蛋白优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥），在这种情况下，膜蛋白表面比其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。

但是，优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象，在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适用。

对于保护机理仍在探索阶段，目前主要有两种假说。

２．１“水替代”假说由于蛋白质分子中存在大量氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结，当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的
兽用疫苗耐热保护剂的种类及作用机理
李永洲，戴波涛，赵
刚（辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁
沈阳
110161）
中图分类号
S859
文献标识码
A
文章编号
1672-9692(2011)04-0043-02
［收稿日期］２０１１－０２－２５
饲料兽药
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羟基能替代蛋白质表面水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联结位置不能直接暴露在周围的环境中，从而稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质冻干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能的完整性。

２．２“玻璃态”假说玻璃化是指物质以非结晶态形式存在的一种固体状态，通常在玻璃化温度
下形成，即TG
（是无定形聚合物大分子链段自由运动的最低温度，没有固定的数值，往往随着测定的方法和条件而改变）。

该状态下物质黏度极大，分子运动受到限制，流动性差。

研究发现，在玻璃态下，物质兼有固体和液体的行为，黏度极高，不容易形成结晶，且分子扩散系数很低，因而具有黏性的保护剂包围在蛋白质分子周围，形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质运动受阻，阻止膜蛋白的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用[10]。

目前，这两种假说并不能完全解释所有的冷冻干燥保护过程。

大部分学者赞同“水替代”假说，因其可通过试验检测到膜蛋白和保护剂之间的氢键作用，为理论提供证据。

例如，对L-天门冬酰氨酶的研究表明，虽然四甲基葡萄糖和聚乙烯吡咯烷酮（PVP ）都不能作为水替代物与蛋白质分子形成氢键，但它们在干燥过程中仍然能有效防止蛋白失活，“水替代”假说不能解释这一现象。

同样，“玻璃态”假说也有一些不能解释的问题，如高温下海藻糖对生物制品的稳定性问题。

总之，对冻干过程的保护机理仍需深入研究[11-12]。

3影响耐热保护剂功能的因素
耐热保护剂减小了具有生物活性的制品在较
高温度和较长保存时间下，冻干物质可能产生的物理和化学变化对活疫苗存活的影响。

耐热保护剂的保护功能主要受两个方面因素的影响。

①微生物因素，微生物的种类和其本身结构差异（如病毒有无囊膜）、培养方法以及疫苗种类等方面决定了不同种类疫苗的保护剂的配方不同；②保护剂自身因素，如保护剂原料及其性质、冻干曲线等。

耐热保护剂的组方要充分考虑以上两方面因素，合理搭配，反复验证，制定出合理的冻干曲线。

保护剂选定并制成冻干样品后，要对样品物
理性状进行保存期试验，并将样品放置在不同温度下进行保存时间及效价测定、安全性检验等对比试验。

根据试验结果，不断调整配方及冻干曲线，以达到理想效果[13]。

4展望
随着生物技术的飞速发展，保护剂已经越来越多地应用于各种生物制品中，但该项技术的发展，需要采取一些有效的辅助技术手段，如蛋白质分析技术，计算机数学建模对冻干过程中物料的真实状态进行模拟解析等技术，从而使冻干技术得更趋成熟。

目前，我国对常温疫苗保护剂的研究方面尚未见到报道[14]，为此兽医工作者应该进一步研究蛋白质的保护机理，开发出具有潜能的常温疫苗保护剂，提高动物疫苗的质量，推动动物疫病防控工作的开展。

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