7灭活剂、保护剂与免疫佐剂 10基本技术
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04第四章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂(兽医生物制品学)
(四)温度
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂
第四章兽医生物制品的灭活剂、佐剂及保护剂【知识目标】·熟悉兽医生物制品生产中常用的灭活剂、佐剂及保护剂；·理解灭活剂、佐剂及保护剂在兽医生物制品生产中的作用；·掌握·灭活剂、佐刺、保护剂的概念；·影响灭活剂作用的因素；·影响保护剂效能的因素。
·了解·佐剂的基本要求及类型；·保护剂的组成、效能。
【能力目标】·能进行白油佐剂的乳化。
第一节灭活与灭活剂为了提高兽医生物制品的安全性、防止散毒，许多疫苗通常通过灭活制成无毒力和无感染性的制品，灭活乃是兽医生物制品中的一项基本技术。
一、灭活及灭活剂的概念灭活(inanimation)，是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力及致病性，但尽可能不影响其免疫原性，用以制备灭活疫苗。
广义的灭活尚包含灭能(inactivation)，即使一些活性物质(微生物及其代谢产物、激素、酶、血清因子和抗体等)丧失活力的过程。
各种灭活疫苗、诊断抗原等的制造过程均属于灭活；血清经56℃加热30min处理，使补体丧失活性、破坏某些抑制因子的过程，以及破伤风毒素经甲醛处理后即失去致病性成为类毒素的过程均为灭能。
用来灭活的药物称为灭活剂，又称化学灭活剂。
化学灭活是制备灭活苗最重要的手段。
二、灭活的类型按其灭活作用的性质可将灭活分为物理灭活和化学灭活两类，尤以化学灭活法效果确实、方法简便而最为常用。
但不同的微生物、活性物物质采取灭活方法、灭活剂也不尽相同，因此，选择合适的灭活剂和灭活方法对研制灭活兽医生物制品十分重要。
(一)物理灭活一般常用热灭活、超声波灭活、紫外线灭活和γ射线灭活等方法杀死微生物或消除其毒性。
热灭活最早由Smith等研制猪霍乱灭活菌苗时提出，后来发现热灭括容易发生菌体蛋白质变性。
过去用加热灭活方法者较多。
该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成菌体蛋白质变性，凶而免疫原性受到明显影响。
4 第三章 灭活剂、保护剂与免疫佐剂
是甲醛的醛基作用于微生物蛋白质的氨基产生 羟甲基胺，作用于羧基形成亚甲基二醇单酯， 作用于羟基生成羟基甲酚，作用于巯基形成亚 甲基二醇。 上述反应生成的羟甲基等代替敏感的氢原 子，破坏生命的基本结构，导致微生物死亡。 甲醛还可与微生物核糖体中的氨基结合， 使两个亚单位间形成交联链，亦可抑制微生物 的蛋白质合成。 近年发现，对病毒和细菌等的核酸的烷化 作用比对蛋白质的作用更有利杀灭微生物。
2.化学灭活方法：
用于灭活微生物的化学试剂或药物称为 灭活剂（inactivator）。 化学灭活剂的种类很多，作用的机 理也不同，而且灭活的效果受多种因素 影响。
（一） 甲醛溶液
甲醛是最古典的灭活剂，至今仍是生物制品研究与制 造中最主要的灭活剂。我国农业部发布的《兽医生物 制品制造及检验规程》（2000）中的26种灭活疫苗， 均以甲醛作为灭活剂。
（六）酸碱度（pH）
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性 时灭活速度快，但抗原性易受破坏。 灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛 溶液浓度高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。 对细菌的灭活作用，pH有较大影响。pH改变 时，细菌的电荷也发生改变，在碱性溶液中，细菌 带阴电荷较多，阳离子表面活性剂的杀菌作用较大。 在酸性溶液中，则阴离子的杀菌作用较强。同时， pH值也影响灭活剂的电离度。未电离的分子一般较 易通过细菌细胞膜，灭活效果较好。
60Co照射(rad拉德 )
应用时应根据被照射物的容量大小选择照射物 与钴源的距离和剂量。 用60L大玻瓶装6L的血清或血液，吸收60Co量 200万rad/h能完全杀死芽孢杆菌， 150万rad/hr可使非芽孢菌完全灭活。 含鸡新城疫病毒的鸡胚尿囊液，吸收60Co剂量 达50万rad/h，病毒可完全被灭活。 猪瘟病毒强毒吸收量达到300万rad/h完全失去 致病力。 被60Co照射处理的血清用于细胞培养，与未照 射的血清比较，病毒培养效果一致；被照射处 理的裂解全血，不影响牛出败菌及禽霍乱菌的 生长，制出的菌苗免疫效力良好。
05生物制品的佐剂保护剂灭活剂
B细胞的作用 某些佐剂可以直接作用于B细胞，如细菌脂多糖，以B细胞为主要靶细
胞，使之多克隆增殖，并诱导B细胞对T细胞的敏感性，从而增强对TD抗 原的免疫应答，提高抗体水平。
非特异性免疫增强作用 佐剂效应，除加强抗原引起免疫应答能力以外，还能对各种感染和
肿瘤具有非特异性免疫增强作用，主要是加强NK细胞和K细胞的活性。 这种非特异性的免疫作用，至少有一部分是通过诱导干扰素生成而造成 的。香菇多糖、葡聚糖、云芝多糖、果聚糖等多糖在体内都能诱生干扰 素。
广义的讲，凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均 可称为佐剂。
对佐剂的基本要求
因为几乎所有畜禽及其产品都是直接或间 接人类食品，所以佐剂作为一些生物制品的 成分，必须考虑其安全性和副作用，既要考 虑对动物的安全性，也必须考虑对人的安全 性。
世界卫生组织及一些专家认为：生物制品的佐剂， 在考虑其免疫增强效应的同时，必须具有以下条件
存
化十八烷基三甲铵。
型
胺及其类似物：癸胺、癸胍及其他。
核酸及类似物：DNA、RNA、低核苷酸、多聚核苷
酸、环磷酸腺苷等。
药物：左旋咪唑及蜂胶等
佐剂的作用机理
各种佐剂的作用机理不尽相同，但概括起来有如下方面
1．对抗原的作用
(1) 增加抗原分子的表面积 某些佐剂颗粒表面可以吸附许多抗原，使抗原表面积明显
增加，特别是可溶性抗原或半抗原，经胶体颗粒吸附后，抗 原性增强，抗体滴度明显提高。
(2) 延长抗原在体内的存留时间 抗原与某些佐剂混合后形成凝胶状，延长抗原在体内的
贮存时间，使其徐徐释放，因而提高抗原物质的免疫原性。
2．对机体的作用
对单核巨噬细胞的作用 佐剂能引起细胞浸润，出现巨噬细胞、淋巴细胞及浆细胞聚集，促进
项目四 灭活剂、保护剂与免疫佐剂
三、影响灭活作用的因素
⒈灭活剂特异性：石炭酸对真菌和病毒效果差，甲醛 最常用。 ⒉微生物的种类和特性：一般含氮量越高，甲醛等灭 活剂的消耗量就越大，灭活脱毒速度越慢。 ⒊灭活剂浓度（一定要合适） ⒋灭活温度（具体不同病原体和或毒素，其灭活时间 和温度不一致）。 ⒌灭活时间：随灭活剂浓度及温度升高，灭活时间则 缩短。 ⒍PH：微酸时灭活速度慢，抗原性保持较好。 ⒎有机物的存在：被灭活的病毒或细菌液中，如果含 有血清或其它有机物质，会影响灭活剂的灭活能力。
当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制
成的乳剂为油包水型乳剂（水／油或W／O），是生物 制品采用的主要剂型。
白油佐剂
一种好的乳剂苗，应该是W／O或O／W型，粘度较低， 颗粒大小均匀，稳定性良好，呈乳白色。
（四） 蜂胶佐剂 （五）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生物佐剂
三、新型免疫佐剂
1、细胞因子类 2、免疫刺激复合物
二、常用灭活剂的应用
⒈甲醛溶液：最常用 2.苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制。 3.结晶紫：蛋白质变性。（溶于有机溶剂）用于诊断抗原 的制备：鸡白痢抗原 4.β-丙内酯 狂犬病灭活苗制备所用 5 烷化剂 乙酰基乙烯亚胺 二乙烯亚胺 缩水甘油醛 6 硫柳汞 用于生物制品的防腐和消毒。 7 缩水甘油醛 注意：灭活剂对人有害，有时对皮肤黏膜有强烈刺激性。
④干扰素类生物活性物质的保存：加葡聚糖。
二、冻干保护剂的组成
⒈低分子物质（营养液）：
营养液：脱脂乳、蛋白胨、氨基酸、和糖类 等 ⒉赋形剂(高分子物质）骨架
赋形剂：蔗糖、山梨醇、乳糖、PVP、葡聚 糖等 ⒊抗氧化剂 抗氧化剂：Vit.C、Vit.E和硫代硫酸钠等
灭活剂和佐剂.
甲醛 醛基
灭活浓度：需氧细菌0.1％～0.2％，厌氧细菌 0.4％～0.5％，病毒0.05％～0.4％。 灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底 灭活目的。 必要时可在灭活后加入焦亚硫酸钠，以
中断其反应。
2. 烷化剂（Alkylating agent）
N-乙酰乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水
氧化酶等酶系统的活性，从而导致微生物死亡。
• 通常：生物制品的常用量为0.3%-0.5%, 另外，芽
孢、真菌和病毒对苯酚的耐受性很强。
4. 结晶紫
• 是甲基紫、龙胆紫的纯品。 • 灭活机制：是结晶紫阳离子与微生物蛋白 质带阴性电荷的羧基形成弱电离的化合物， 从而干扰微生物正常代谢和氧化还原作用， 主要干扰细胞壁肽聚糖的合成，导致革兰
结构位点发生改变，从而丧失生命力、感染性、
毒性或活性。
• 效能常受灭火剂种类、剂量和作用温度、pH、时
间等因素的影响，使用时必须筛选最佳的灭活条
件。
• 方法简单、效果确实、最为常用。
（三）灭活剂
用于灭活微生物的化学试剂或药物 1911 年， Lowenstein DH 用甲醛处理破伤风毒素 而制成类毒素 1924年，Puntoni以苯酚或甲醛处理制成犬瘟灭活 苗 1934年，Morion Dorset等用结晶紫灭活猪瘟病毒 制成猪瘟结晶紫疫苗。
重要作用
什么是 “佐剂”呢？
一、佐剂概念与作用特点
1. 佐剂（新概念）：凡是可以增强抗原特异性免疫 应答的物质均称为佐剂。
佐剂（旧概念）：当一种物质先于抗原或与抗原
混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变
或增强机体对该抗原的特异性免疫应答 ,发挥其辅
佐作用的物质。 也称免疫佐剂、抗原佐剂。
第三章 灭活剂 保护剂 与免疫佐剂
、病毒、
真菌以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌对各类灭活剂的敏
感性并不完全相同；细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的 抵抗力不同；生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度 也有一定差别。此外，细菌的浓度也会影响灭活的效果。
灭活剂浓度：以甲醛为例，甲醛浓度越高，灭活脱毒越
快，但抗原损失量亦较大。有时可以将甲醛溶液分数次加 入，加量由小至大，PH值由低到高，温度由室温开始， 逐步提高到允许的最高温度，这样对于保护抗原的免疫原 性有一定好处。
灭活温度：通常情况下，灭活作用随温度上升而加速。
但如果温度超过40℃或更高，对微生物的抗原性将有不利 影响。
灭活时间：灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切相关。
赋形剂：主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧
化，保护活性物质不受加热的影响，使冻干制品形成多孔 性、疏松的海绵状结构，从而使溶解度增加，如蔗糖、山 梨醇、乳糖、PVP(聚乙烯吡咯啶酮）葡萄糖等。常为高 分子物质。
抗氧化剂：可抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性
物质在冻干后储存期间的稳定性，如维生素C、维生素E 和硫代硫酸钠等。
2、非渗透剂，如聚乙烯吡咯啶酮和蛋白质等，能防止细 胞等生物活性物质由外向内渗透溶质。
非渗透性保护剂按相对分子质量大小可分为：
高分子物质和低分子物质
按化学性质，可分为：
复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
一、冻干保护剂的组成与作用
营养液：可使因冻干而受损伤的细胞修复，对水分子其
缓解作用，并能使冻干生物制品仍含有一定量的水分；还 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度，如脱脂乳、蛋白胨、氨基酸和糖类等，常为 低分子有机物。
一般随着灭活剂浓度及作用温度升高，灭火时间则缩短。 在生物制品生产中，应以保证制品安全和效力，采用低灭 活剂剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。
真菌以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌对各类灭活剂的敏
感性并不完全相同；细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的 抵抗力不同；生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度 也有一定差别。此外，细菌的浓度也会影响灭活的效果。
灭活剂浓度：以甲醛为例，甲醛浓度越高，灭活脱毒越
快，但抗原损失量亦较大。有时可以将甲醛溶液分数次加 入，加量由小至大，PH值由低到高，温度由室温开始， 逐步提高到允许的最高温度，这样对于保护抗原的免疫原 性有一定好处。
灭活温度：通常情况下，灭活作用随温度上升而加速。
但如果温度超过40℃或更高，对微生物的抗原性将有不利 影响。
灭活时间：灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切相关。
赋形剂：主要起骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧
化，保护活性物质不受加热的影响，使冻干制品形成多孔 性、疏松的海绵状结构，从而使溶解度增加，如蔗糖、山 梨醇、乳糖、PVP(聚乙烯吡咯啶酮）葡萄糖等。常为高 分子物质。
抗氧化剂：可抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性
物质在冻干后储存期间的稳定性，如维生素C、维生素E 和硫代硫酸钠等。
2、非渗透剂，如聚乙烯吡咯啶酮和蛋白质等，能防止细 胞等生物活性物质由外向内渗透溶质。
非渗透性保护剂按相对分子质量大小可分为：
高分子物质和低分子物质
按化学性质，可分为：
复合物、糖类、盐类、醇类、酸类和聚合物
一、冻干保护剂的组成与作用
营养液：可使因冻干而受损伤的细胞修复，对水分子其
缓解作用，并能使冻干生物制品仍含有一定量的水分；还 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状， 增加溶解度，如脱脂乳、蛋白胨、氨基酸和糖类等，常为 低分子有机物。
一般随着灭活剂浓度及作用温度升高，灭火时间则缩短。 在生物制品生产中，应以保证制品安全和效力，采用低灭 活剂剂量、低作用温度和短时间处理为最佳。
兽用疫苗保护剂和佐剂
兽用疫苗保护剂和佐剂随着人类对动物健康和养殖业的关注日益增加，兽用疫苗成为提高动物免疫力和预防疾病传播的重要手段。
兽用疫苗并非一种简单的药物，它由疫苗保护剂和佐剂两部分组成。
疫苗保护剂含有致病菌或致病菌的一些组分，用于引起动物的免疫反应；而佐剂则是辅助疫苗保护剂，增强疫苗的稳定性、免疫效果以及延长免疫时间，使疫苗在动物体内发挥最大的保护作用。
兽用疫苗保护剂是兽用疫苗的关键组成部分，它由病原体或病原体的一些成分组成，通过自然免疫或人工免疫的方式引起动物的免疫反应。
疫苗保护剂的选择要根据不同的疫病特点和动物免疫途径来确定。
对于细菌性疫病，如猪鼻支原体、禽霍乱和鸡伤寒，常规的疫苗保护剂一般由灭活疫苗、减毒疫苗或次单位疫苗制成。
对于病毒性疫病，如禽流感和猪瘟，常用的疫苗保护剂则有灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗以及DNA疫苗等。
随着疫苗的广泛使用，人们发现疫苗的免疫效果与疫苗保护剂的稳定性和免疫性能密切相关。
佐剂作为疫苗保护剂的辅助剂，能够增强疫苗的免疫原性、稳定性和免疫效果，提高动物的免疫力和抗体产生。
佐剂的选择要根据疫苗保护剂的特点和动物免疫途径来确定。
常见的佐剂有油佐剂、水佐剂、微球佐剂、多糖佐剂以及胆固醇佐剂等。
油佐剂是最常用的佐剂之一，由白针剂、水针剂和油水乳剂等组成。
油佐剂具有较好的免疫增强效果，能延长疫苗在机体内的留存时间，增加抗体的产生量，提高动物的免疫效果。
油佐剂的缺点是使用时需要摇晃均匀，否则易引起注射部位的红肿和坏死。
由于油佐剂的黏稠度较高，注射时需要技术要求较高。
水佐剂是由氧化铝悬浮液和胶体硅悬浮液等组成，可以增强疫苗的免疫原性和稳定性。
水佐剂对动物的刺激较小，不易引起注射部位的红肿和坏死。
水佐剂能够形成颗粒状混悬液，通过免疫细胞的吞噬作用提高免疫效果，适用于禽用和兽用疫苗的施用。
微球佐剂是由聚乳酸和聚乙二醇等微球体封装的疫苗保护剂，具有稳定性好、溶解度高、生物相容性好等特点。
微球佐剂可以根据疫苗保护剂的特点和免疫途径的不同，调整微球的药物释放速率和抗原释放量，以达到最佳的免疫效果。
灭活剂和佐剂
作用特点：
① 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产 生特异性免疫应答。 ② 用最少的抗原和最少的接种次数，产生
足够的免疫应答。
二、 研究历史
1、起始阶段
1916年Moignar最早用羊毛脂与石蜡油制成伤
寒沙门氏菌乳剂苗；继后Prevet用羊毛脂加琼脂为
佐剂制出炭疽菌苗。
1925年，Gaston Ramon证明了明矾的佐剂作
二、常用灭活剂的灭活机理与应用
1、甲醛
是最古典、使用最广泛的灭活剂
《兽医生物制品制造及检验规程》（2000） 中的26种灭活疫苗，均以甲醛作为灭火剂。
甲醛的水溶液——福尔马林 (含甲醛36~40%) • 灭活机理：还原作用
氨基 羧基 羟基 巯基 甲基胺 亚甲基二醇单酯 羟基甲酚 亚甲基二醇
甲醛 醛基
（3）缩水甘油醛（GDA）
•大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优 于甲醛。 •本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/ml。 •0～4℃ 保存3个月后含量渐下降，约半年失 效；20℃只能保存10 d。
3. 苯酚
• 又称石碳酸。有腐蚀性，而且有毒！易溶于水及
有机溶剂。
• 灭活机制：使微生物蛋白质变性和抑制如脱氨酶、
①抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联
合使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异
性的结合、保护、运输并递呈给效应细胞。
② 抗原寻的（antigen targeting） 指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率。 包括吸引巨噬细胞到达组织部位、活化吞噬细胞、 促进抗原与细胞受体的结合等。
灭活浓度：需氧细菌0.1％～0.2％，厌氧细菌 0.4％～0.5％，病毒0.05％～0.4％。 灭活原则：低浓度、短时间而又能达到彻底 灭活目的。 必要时可在灭活后加入焦亚硫酸钠，以
灭活剂保护剂和免疫剂ppt课件
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
冻干保护剂作用机制
① 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤；
② 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力；
③ 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。
2、二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI） •市购商品为0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1个月; •终浓度0.02%, 加入2％硫代硫酸钠中断灭活。
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
①抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合使用，有
助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的结合、保护、运输并递 呈给效应细胞。
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
激性如：甲醛、β-丙酰内酯
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
甲醛溶液：
•《规程》（2000）中的26种灭活疫苗
• 灭活机理：
甲醛 醛基
氨基 羧基 羟基 巯基
甲基胺 亚甲基二醇单酯 羟基甲酚 亚甲基二醇
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
灭火剂、保护剂与免疫佐剂共93页PPT
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 5的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
灭火剂、保护剂与免疫佐剂
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 5的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
灭火剂、保护剂与免疫佐剂
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
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灭火剂、保护剂与免疫佐剂
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
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醇类
酸类 聚合物
山梨醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇等
柠檬酸、酒石酸、氨基酸等 葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等
疫苗冻干保护剂组成
1. 营养液： • 可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；
• 可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，
增加溶解度 2. 赋形剂： • 防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响 • 使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度 3. 抗氧化剂： • 抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存
注意事项：
① 氢氧化铝吸附力较强，所以要用软化水或去离子水洗涤。 ② 氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会失去胶态。故要
掌握好化合时的pH值。
③ 贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，严密封盖，贮放期不超过3个月。 ④ 铝胶室温保存，以免破坏胶态。
油乳佐剂
是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。 该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗原在注射部位保 持稳定，为抗原在淋巴系统中转运提供载体，增加单核细胞的 形成和积聚。 油水乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用的好坏和乳剂 成分的质量等有关。 一种好的乳剂疫苗应是油包水（W/O）或水包油（O/W）型，粘 度低，颗粒均匀，稳定性良好，呈乳白色。
“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体 中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体 称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。
乳化剂
1. 天然乳化剂：阿拉伯胶、海藻酸钠、蛋黄以及炼乳 2. 人工合成乳化剂 • 离子型 阴离子类乳化剂：十二烷基磺酸钠和硬脂酸铝
免疫实验动物用的佐剂配制:
(1)弗氏佐剂：矿物油75%~85％，乳化剂15％~25%，混合后经 除菌过滤而成为FIA；如向其中加入0.5mg／m1死结核杆菌即 为FCA。使用时，将含抗原的水相，与上述任一佐剂等量混合， 用力振摇即可成为均匀的乳剂。
(2) 白油佐剂：9份油和1份司本-80混合Байду номын сангаас加2％吐温-80和1％
佐剂免疫作用机理
①抗原递呈（antigen presentation） ②抗原寻的（antigen targeting）
③免疫调节（immune modulation）
①抗原递呈： 指抗原分子递呈给T细胞的方法。佐剂与疫苗联合 使用，有助于抗原性物质在胞内被加工，被MHC分子特异性的 结合、保护、运输并递呈给效应细胞。
作用特点：
① 明显增强抗原性微弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答。
② 用最少的抗原和最少的接种次数，产生足够的免疫应答。
免疫佐剂作用方式：
① 改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细胞以吞噬抗原； ② 改变抗原的构型，使抗原物质降解，并加强其免疫原性； ③ 延长抗原在组织内的贮存时间，使抗原缓慢降解和缓释， 并发挥免疫系统的细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T 细胞与B细胞）。
油乳剂检验
（1）粘度测定：流出法、Saybolt粘度计法。
吸管内口直径为1.2mm，室温下吸满lml乳剂，垂直放出0.4ml所 需时间作为粘度单位。
以 2-6 S为合格，不得多于10-15 S。 （2）乳剂稳定性测定： ① 加速老化法：疫苗于37℃贮存10-30d不破乳。
② 离心加速分层法：3000rpm离心15min不分层，相当于保存1 年以上不破乳。
3、缩水甘油醛（glycidaldchyde，GDA）
•大肠杆菌、噬菌体、新城疫病毒灭活效果优于甲醛。 •本品易挥发，水溶液含量为15～31mg/mL。
•0～4℃ 3个月含量渐下降，约半年失效；20℃只能保存10d。
4、-丙酰内酯（－propiolactone）又名羟基丙酸--内酯 •无色有刺激气味的液体，水溶液应密封于玻璃瓶中5℃保存 •水中溶解度37％，能与丙酮、醚和氯仿任意混合 •对皮肤、粘膜及眼有强刺激性，对动物有致癌性。 •病毒灭活后，能保持良好的免疫原性
蜂胶佐剂（ Propolis）
• 是一种优良的天然药物
• 供免疫佐剂用的蜂胶外观应具备其固有的特征
• 具有广泛的生物活性和药理作用（抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎） • 具有免疫增强作用： 能保持抗原特性，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的 产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。
蜂胶佐剂疫苗制备方法：
~2%硬脂酸铝，经高压灭菌后备用，注射前将配好的油佐剂与
抗原水相1：1混合，强力振摇，可配制成性状良好的乳剂疫苗。
大量生产乳剂疫苗:
• 油相: 94％白油、6％司本-80、1%~2％硬脂酸铝，灭菌即可；
• 水相：抗原液加2％~4%吐温-80
• 乳化：将油相与水相按3：1~2：1比例配制，先缓速混合，再 通过胶体磨充分乳化，可获得稳定的油包水乳剂苗。 或者将粘稠的W/O乳剂疫苗，再加2％吐温-80生理盐 水，通过搅拌或胶体磨乳化，可制成双相乳剂疫苗。
• 烷化剂（alkylating agent）
灭活机制： 1. 烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂 或双螺旋链交联，因改变DNA的结构而破坏其功能，妨碍 RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。 2. 与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸代谢。 优点：能破坏病毒的核酸芯髓，使病毒完全丧失感染力，而 不损害其蛋白衣壳，保留其保护性抗原。 烷化剂类灭活剂： 乙酰基乙烯亚胺（AEI)、二乙烯亚胺(BEI) 、缩水甘油醛
乳剂配方与乳化方法
（1）剂在水中法：
将乳化剂直接溶于水中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生
成O/W乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发生变型。该
法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅拌而得到较好的乳剂。
（2）剂在油中法： 将乳化剂溶于油相，将油相直接加入水相中得O/W，如水相 直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至变型。该 法制成的乳剂，一般均匀颗粒直径在0.5µ m左右，比较稳定。
•主要用于狂犬病灭活疫苗的制备。
影响灭活作用的因素
•
• • • • •
灭活剂特异性
微生物种类与特性 灭活剂浓度 灭活时间 酸碱度（pH） 有机物的存在
保护剂（protector）
又称稳定剂（stabilizer）：指一类能防止生物活性物质
在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。
分类： •（根据其作用机理） ——渗透剂：如二甲基亚砜（DMSO）、甘油和蔗糖等 ——非渗透剂：如聚乙烯吡咯啶酮(PVP)和蛋白质等
1．保护剂种类
2．保护剂组分浓度
3．保护剂配制方法
4．保护剂酸碱度（pH）
兽医生物制品常用的保护剂：
1．5%蔗糖（乳糖）脱脂乳保护剂 3．聚乙烯吡咯烷酮乳糖保护剂 2．明胶蔗糖保护剂 4．SPGA保护剂
免疫佐剂
免疫佐剂( Immunologic Adjuvant)概念 ——当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内， 能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发 挥其辅佐作用的物质 ——可以增强抗原特异性免疫应答的物质。
阳离子类乳化剂：氯化苯甲烃铵、溴化十六烷三甲基
• 非离子型：月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油酸脂、 司本-80、吐温-80
白油佐剂
国内外常用白油：Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4 7号或10号白油 质量标准: •无色无味
•50℃运动粘度7m2／s左右
•紫外吸收A250-350＜0.1％，紫外消光系数＜12×108； •单环芳烃与双环芳烃含量低于0.5％，无多环芳烃； •小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，观察60d， 表现正常。
1、乙酰基乙烯亚胺（N-acetyl ethylenimine，AEI）
•淡黄色澄明液体，有轻微氨臭味，能与水或醇任意混合。 •0～4℃可保存1年，在-20℃可保存2年
•AEI功能基团是乙烯亚胺基，可用于口蹄疫灭活苗。
•口蹄疫病毒液: 终浓度0.05％，30℃8h, 加2％硫代硫酸钠阻断
2、二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI） •市购商品为0.2％的BEI溶液，在0～4℃可保存1个月; •终浓度0.02%, 加入2％硫代硫酸钠中断灭活。
（二）非颗粒性佐剂
1．肽类佐剂（peptides）：胞壁酰二肽（MDP）及其衍生物、 去胞壁酰多肽、脂肽和免疫调节多肽。
2．表面活性分子类佐剂：海藻糖合成衍生物（TDM）
3．核酸及其衍生物类佐剂：合成核苷酸聚合体、CpG 4．含硫复合物类佐剂：左旋咪唑 5．碳水化合物高分子类佐剂：香菇多糖、DEAE-葡聚糖 6．细胞因子类佐剂（cytokine）：IL-2、IL-4和γ-IFN等。
1．盐类佐剂 氢氧化铝胶、明矾、磷酸铝等。
2．油水乳剂佐剂
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗 氏不完全佐剂（ FIA）和矿物油白油佐剂。 3．免疫刺激复合物佐剂（ISCOM） 4．蜂胶佐剂（propolis）
5．脂质体佐剂（liposomes）。
6．其他：MF59佐剂、微囊化佐剂（microencapsulation)、 硬脂酰酪氨酸佐剂和γ －菊粉等。
期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。
冻干保护剂作用机制
① 防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生 物活性物质的损伤； ② 降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保 持细胞的活力； ③ 保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复 苏和迅速修复自身。
影响保护剂效能的因素
灭活剂、保护剂与免疫佐剂
灭活剂
• 灭活 inactivation
指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽
可能不影响其免疫原性。或指破坏诊断血清或待检血清 中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。 • 灭活剂 inactivator 用于灭活微生物的化学试剂或药物。