04第四章 灭活剂、保护剂和免疫佐剂(兽医生物制品学)

3．保护剂配置方法 配置方法不同会影响保护剂的效果。例如含糖保护剂灭菌温度不宜
过高，以114C 30min灭菌或间歇灭菌为宜；血清保护剂就不能用热灭菌 法，必须以滤过法除菌。
4．保护剂pH 保护剂的pH应与微生物生存时的pH相同或相近，过高或过低都能导
致微生物的死亡。例如明胶蔗糖保护剂的pH以6.8~7.0为最佳，否则会造 成微生物大量死亡。又如含葡萄糖、乳糖保护剂经高压灭菌后能改变保护 剂的pH值，从而影响保护效果，为此最好采取滤过除菌。
总之，每种新的冻干制品在批量生产前应进行系统的最佳保护剂选择 试验，包括保护剂冻干前后的活菌数、病毒滴度和效价测定的比较试验； 不同保存条件和不同保存期的比较试验。
三、常用的冻干保护剂
各类微生物适用的保护剂很多，各国的配制方法各异。即使同一种制 品所使用的保护剂组成也不一样。
例如鸡新城疫弱毒疫苗，我国选用5%蔗糖脱脂乳为冻干保护剂，而日 本则用5%乳糖、0.15%聚乙烯吡咯烷酮、1%马血清；或0.4%蔗糖脱脂乳、 0.2%聚乙烯吡咯烷酮作保护剂。猪丹毒弱毒菌苗，我国以5%蔗糖、1.5% 明胶作冻干保护剂；而日本用5%脱脂乳、2.5%酵母浸膏为保护剂。
或氨基结合保护其二级和三级结构。
2. 对活细胞（细菌） 降低细胞内外的渗透压，防止细胞膜破损水； 防止因细胞内水分结晶而对细胞膜或其他生物成份产生的应力，以
致改变膜或分子的立体结构； 若保护剂是细胞（细菌）的营养物质，可以在细胞复苏时迅速修复
细胞膜所受的损伤。
二、影响冻干保护剂效能的因素
每种生物制品一般都有其最佳冻干保护剂的组合，从而获得在冻干过 程中失活率最低、制品的保存期长。冻干保护剂的种类、组合、配制以 及组分的浓度对其效能的影响十分明显，影响保护剂效能的因素有下列 几方面。
烷化剂的化学性质活泼，灭活机制是： 在于烷化DNA分子中的鸟嘌呤或腺嘌呤等，引起单链断裂或双螺旋 链交联，妨碍RNA的合成，从而抑制细胞的有丝分裂。 也可与酶系统和核蛋白起作用而干扰核酸的代谢。
这类烷化剂包括：二乙烯亚胺（binary ethylenimine，BEI）、N-乙酚 乙 烯 亚 胺 (N-Acetyl ethylenimine ， AEI) 、 2- 乙 基 乙 烯 亚 胺 (2-ethylenthylenimine，EEI)及缩水甘油醛等。
附：
用乙烯亚胺衍生物对病毒进行灭活，当灭活结束时，应中止灭活并 除去其残存物，以免继续作用而损害疫苗的免疫原性。采用的方法是： 在乙烯亚胺衍生物灭活的病毒液中加入过量的硫代硫酸钠或亚硫酸钠， 不论是0.05%AEI或0.02%BEI，病毒液中硫代硫酸钠最终浓度均为2%， 以中断灭活剂灭活作用。
此外，-丙内脂（-propiolactone）也是一种良好的病毒灭活剂， 它是一种不稳定的液体，于37C 2h后能自行水解为无毒物质。
(四)温度
温度越高，灭活越快，灭活作用随温度上升而加速。在低温时，温 度每上升10C，细菌死亡率可成倍增加。每升高10C，金属盐类的灭菌 作用增加2-5倍，石炭酸的杀菌作用增加5-8倍。但是，如果温度超过 40C 或更高，对微生物的抗原性将有不利影响。
(五)pH
在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好，在碱性时灭活速度快，但 抗原性易受破坏。灭活初期损失较快，以后逐渐减慢，尤其甲醛溶液浓度 高时，在碱性溶液中抗原性损失更大。
疫苗名称
灭活剂及其浓度
灭活和毒方法
3-1
肉毒梭菌(C型)菌苗
0.8%甲醛
37C，10天
表
羊大肠杆菌病菌苗 猪丹毒、猪肺疫氧氧化铝二联苗
0.3%甲醛 0.25%甲醛
37C，24-48h 37C，l8-24h
禽霍乱油乳剂菌苗
0.1%甲醛
37C，12h
常 山羊传染性胸膜肺炎氢氧化铝菌苗 0.1%甲醛
用 犬瘟热肝脾组织灭活苗
(二) 微生物种类及其特性
不同种类的微生物如细菌、病毒、真菌以及革兰氏阳性菌与革兰氏 阴性菌对各类灭活剂的敏感性是个完全相同的；细菌的繁殖体及其芽胞 对化学药物的抵抗力不同；生长期和静止期的细菌对灭活剂的敏感程度 亦有差别，另外细菌的浓度也会影响灭活的效果。
(三)灭活剂浓度
以甲醛力例，甲醛浓度越高，灭活脱毒越快，但抗原损失量亦较大。 有人证明，加0.5%甲醛溶液脱毒的类毒素，其结合力仅相当于0.2%甲醛 溶液脱毒类毒素结合力的2/3。也可以采用分次加入甲醛溶液进行灭活、 脱毒比较缓和的方法。
甲醛的使用浓度
甲醛用于病毒灭活其浓度可在0.05%~0.4%范围内，大部分使用浓 度为0.2%~0.3%。
一般需氧细菌用0.1%~0.2%的浓度。 厌氧菌则多用0.4%~0.5%杀菌或脱毒，处理时间37~39C 24h以上， 有的需要更长时间。 例 如 猪 肺 疫 灭 活 苗 ， 用 0.1% 的 甲 醛 溶 液 ， 在 37~38C 条 件 下 灭 活 7~12h；气肿疽灭活苗，用0.5%的甲醛液，37-38C灭活72~96h；破伤 风类毒素用0.4%甲醛液，在37~38C条件下灭活21~23天。
目前多用化学方法进行微生物的灭活，用来灭活的化学试剂或药物等 称为灭活剂(inactivator)。化学灭活剂灭活是制备灭活苗最重要的手段， 化学灭活剂的灭活效能与使用剂量、灭活时间、灭活时的温度及溶液的 pH等都与灭活苗的质量密切相关。
二、常用的灭活剂
(一)甲醛
甲醛是最古典和应用最广的灭活剂。早在1911年，Lowenstein和Eisler 用甲醛处理破伤风毒素，使之脱毒而成类毒素。1924年Puntoni以0.1%甲 醛制成犬瘟热疫苗，1925年，Casta、Boyer和Placidi等用甲醛灭活制备猪 丹毒菌苗。
(结晶紫甘油含2.5%结晶紫)
破伤风明矾沉降类毒素
0.4%甲醛
38C，21-31天
第二节 冻干保护剂
保护剂（protector）又称稳定剂（stabilizer）或分散剂。冻干保护剂 是指在冻干过程中及其后使制品的活性物质免受破坏的一类物质。
一、保护剂的组成与功用
生物制品冻干保护剂通常由以下三类物质组成：
3．抗氧化剂
抗氧化剂包括一些有机的和无机的物质，诸如抗坏血酸钠、硫脲、碘 化钾、钼酸铵等。抗氧化剂具有抑制冻干制品中的酶作用，从而保持微生 物等活性物质的稳定性。
保护Fra Baidu bibliotek的效用
1. 对生物活性物质 防止生物活性物质失去结构水； 防止结构水形成结晶，造成生物活性物质的分子破坏； 一些含羟基的有机保护剂能够替代部分结构水，与蛋白质中的羧基
0.2%AEI或0.02%BEI
20-37C，72-20h
方 猪瘟结晶紫疫苗 法 举 狂犬病羊脑组织 例
血毒:甘油结晶紫为 4:1
(1000ml甘油+2.5g结晶紫)
组织苗:石炭酸甘油溶液为1: 4
(60%甘油及1%酚蒸馏水)
37-38C，6-8天 36C，7天
猪水泡病细胞毒结晶紫疫苗
细胞毒原液:结晶紫甘油为3:1 37C，18天
农牧渔业部1984年发布的《兽医生物制品制造及检验规程》中20种 灭活苗，以甲醛灭活者达17种，占85%。
甲醛为无色气体，易溶于水和乙醇，水溶液称为福尔马林，通常浓 度为36%-40%，有强烈的刺激性。长期低温或受冻保存，可以聚合而成三 聚甲醛或多聚甲醛。
甲醛的作用原理
甲醛的灭活作用主要是甲醛的醛基作用于微生物蛋白质。
酚类化合物的抗菌作用是通过损害细菌细胞膜，使胞浆漏出，并使菌 体溶解；可使菌体蛋白质凝固，抑制细菌特异酶系统(如脱氢酶和氧化酶) 活性。
苯酚在0.2%浓度时，即可抑制一般细菌的生长，而杀菌则需要1%以 上的浓度，如杀死葡萄球菌和链球菌需要3%的浓度作用1-3min，芽胞和 病毒对苯酚的耐受性很强。
(三) 结晶紫
这里所讲的灭活是指微生物的灭活，即破坏微生物的生物学活性，破 坏病原微生物的繁殖能力及致病性，并且尽可能不影响或少影响其免疫原 性，用以制备灭活疫苗。
灭活的方法包括物理学方法和化学方法，其中物理学方法有加热及射 线照射等方法。该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗率，容 易造成蛋白质变性，明显影响微生物的免疫原性，所以这种灭活方法已 基本淘汰。
作用于蛋白质的氨基产生羟甲基胺； 作用于羧基形成亚甲基二醇单酯，作用于羟基生成羟甲基酚； 作用于巯基生成硫代亚甲 基二醇。 还可引起细菌蛋白中氨基与羟基发生分子内交联。 甲醛还可与RNA碱基中的游离氨基特异性结合； 甲醛与核糖体中的氨基结合，使两个亚单位间形成交联链。
所有这些交联使微生物结构有轻微改变，失去活性，但不明显影响其 免疫原性。
1．不同微生物的保护剂
由于细苗、病毒、支原体、立克氏体、酵母菌等生物学特性不同，其 适用的冻干保护剂也不相同。各类微生物常用的保护剂如下：
病 原 性 细 菌 ： 冻 干 保 护 剂 有 10% 蔗 糖 、 5% 蔗 糖 脱 脂 乳 、 1.5% 明 胶 、 10~20%脱脂乳、含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳、5%牛血清白蛋白的蔗糖、 灭活马血清等。 厌氧细菌：含0.1%谷氨酸钠10%乳糖、10%脱脂乳、7.5%葡萄糖血清等。
2．低分子物质
低分子物质包括糖类和氨基酸类，前者如葡萄糖、乳糖、蔗糖、棉子 糖等，后者如谷氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、赖氨酸等。低分子物质可产 生均匀的混悬液，使微生物保持稳定的活存状态及对水分子起缓解作用， 并能使冻干生物制品仍含有一定量水分，还可促进高分子物质形成骨架， 使冻干制品呈多孔的海绵状，从而增加溶解度。
1．保护剂种类 利用不同保护剂冻干的同一种微生物的保存期的存活率不同。如分
别用7.5%葡萄糖肉汤和7.5%乳糖肉汤作保护剂冻干的沙门氏菌，在室温 保存7个月后的细菌存活率分别为35%与21%
2．保护剂组分浓度 Frey(1951)曾以一种大肠杆菌加不同浓度葡萄糖作保护剂进行冻干，
证明用5%-10%葡萄糖存活率最高。
结晶紫是一种碱性染料，为甲基紫的纯品，化学名为六甲基副玫瑰 苯胺。
结晶紫的灭活机制主要是： 它的阳离子与微生物蛋白质带阴电的羧基形成弱电离化合物，妨碍 了微生物的正常代谢，扰乱微生物的氧化还原作用。 干扰胞壁粘肽的合成，主要是对革兰氏阳性菌。
(四) 烷化剂
烷化剂（alkylating agent）是含有烷基的分子去掉一个氢原子基团 的化合物，它能与另一种化合物作用，将烷基引入，形成烷基取代物。
第四章
灭活剂、保护剂和免疫佐剂
内容提要 第一节 灭活与灭活剂
第二节 冻干保护剂
一、灭活的概念 二、常用的灭活剂 三、影响灭活作用的因素
一、保护剂的组成与功用 二、影响冻干保护剂效能的因素 三、常用的冻干保护剂
第三节 免疫佐剂
一、佐剂概述 二、不溶性盐类胶体佐剂 三、油乳佐剂
第一节 灭活与灭活剂
一、灭活的概念
注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！
(二) 苯酚
酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚(phenolum)， 又称石炭酸(acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解， 溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深， 所以应避光保存。
1．高分子物质 2．低分子物质
1．高分子物质
3．抗氧化剂
高分子物质范围很广，种类甚多。它们在冻干类生物制品中主要起
骨架作用，防止低分子物质的碳化和氧化；保护活性物质不受加热的影响；
使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，从而使溶解度增加。
诸如白蛋白、血清、明胶、脱脂乳、液体培养基、淀粉、酵母浸膏
以及聚乙烯吡咯烷酮等合成聚合物。
0.05%甲醛
灭 活
兔出热组织灭活苗
0.4%甲醛
剂 鸡传染性法氏囊病组织灭活苗
0.4%甲醛
及 牛、羊伪狂大病疫苗
0.15%甲醛
16-18C，48h 37C，24h 37C，12-24h 37C，20-24h 4-10C，冷库内7天
灭 犬传染性肝炎灭活苗
0.5%甲醛
37C，24h
活 口蹄疫细胞培养灭活苗
三、影响灭活作用的因素
(一) 灭活剂的特异性
某些灭活剂只对一部分微生物有明显的灭活作用，而对另一些微生物 则效力很差。如酚类能抑制和杀灭大部分细菌的繁殖体，5%石炭酸溶液 于数小时内能杀死细菌的芽胞。阳离子表面活性剂抗菌谱广，效力快，对 组织无刺激性，能杀死多种革兰氏阳性菌和阴性菌，但对绿脓杆菌和细菌 芽胞作用弱。
(六)微生物含氮量
一般微生物或毒素的总氮量和氨基氮含量对灭活有一定影响。一般 含氮量越高，甲醛等灭活剂的消耗量就越大、灭活脱毒越慢。
(七)有机物的存在
被灭活的疫苗中，如果含有血清或其他有机物质，会影响灭活剂的 灭活能力。因为环境中的这些蛋白质等有机物吸附于灭活剂的表面或者 和灭活剂的化学基团相结合。