蛋白质分子量的测定
测定蛋白质分子质量的常用方法
测定蛋白质分子质量的常用方法
测定蛋白质分子质量是化学实验的重要环节，对于蛋白质的结构、功能及关联分子的组成、绝对结构等化学过程均有重要意义。测定蛋白质分子质量的常用方法主要有氨基酸含量分析、蒸馏法、双杂质定量法、穆斯堡定律、电泳法、电晶体谱法、气相色谱法等。
1、氨基酸含量分析是分析蛋白质分子量最常用的方法，其原理是依靠氨基酸构成蛋白质，根据其组成比例结合穆斯堡定律，来计算蛋白质分子量的大小。
2、蒸馏法的原理是依靠蛋白质的分子量与其溶解度成反比，通过改变溶解度进行测定蛋白质分子量的大小
3、双杂质定量法是指利用双重折射定量痕量并加上溶解度分析，来测定蛋白质分子质量的大小
4、穆斯堡定律指的是将蛋白质结合其底物、激素等特定分子特定比例共存时，通过蛋白质分子质量计算法或重量法，得到蛋白质分子质量的大小
5、电泳法是指用可吸收光谱法来测定蛋白质的分子量，利用穆斯堡定律的原理，对蛋白质的分子量在空间形状上进行分析
6、电晶体谱法是通过电晶体技术分析实施蛋白质质量测量，在电晶体条件下，分子会向模式堆叠成固体，并通过电晶定质量的测定方法，得到蛋白质分子质量的大小
7、最后，气相色谱法是指通过批处理和连续样品处理结合色谱技术，来分析蛋白质大小并计算其质量。
以上就是几种常用测定蛋白质分子质量的方法，此类方法大多利用一定原理来实现，在蛋白质研究中起着不可替代的作用。
蛋白分子量和检测条带
蛋白分子量和检测条带
蛋白分子量是指蛋白质分子的质量大小，通常以千道尔顿（kDa）为单位。蛋白质的分子量可以通过凝胶电泳等方法进行测定。在凝
胶电泳中，可以根据蛋白质在电场中的迁移速率来估算其分子量。
另一种常用的方法是质谱分析，通过质谱仪可以准确测定蛋白质的
分子量。
而检测条带通常是指在蛋白质凝胶电泳或者免疫印迹等实验中
观察到的蛋白条带。这些条带可以代表不同分子量的蛋白质，通过
与标准蛋白质分子量标记物进行比较，可以确定待测蛋白的分子量。此外，检测条带的强度和位置也可以提供关于蛋白质表达水平和其
他特性的信息。
从实验角度来看，测定蛋白质分子量和观察检测条带是蛋白质
研究中非常重要的步骤。这些数据可以帮助研究人员了解蛋白质的
结构和功能，以及在不同生理或病理条件下的变化。同时，这些信
息也对于药物研发、疾病诊断和治疗等方面具有重要意义。
从应用角度来看，蛋白质分子量和检测条带的信息在许多领域
都有广泛的应用。比如在生物医学研究中，可以通过测定蛋白质分
子量和观察检测条带来研究疾病机制、筛选药物靶点等。在生物工程和生物制药领域，这些数据也可以用于优化蛋白质表达和纯化工艺。总之，蛋白质分子量和检测条带的研究对于推动生命科学领域的发展具有重要意义。
综上所述，蛋白质分子量和检测条带在蛋白质研究中扮演着重要角色，从实验和应用两个角度来看，这些数据对于我们深入了解蛋白质的结构、功能和应用具有重要意义。
蛋白质分子量测定实验报告
蛋白质分子量测定实验报告实验报告：蛋白质分子量测定
一、实验目的
1.掌握蛋白质分子量测定的基本原理和方法。
2.学习使用SDS-PAGE电泳技术测定蛋白质分子量。
3.了解蛋白质的基本性质和分子结构。
二、实验原理
蛋白质分子量测定是蛋白质研究中的基本操作之一。通过测定蛋白质的分子量，可以了解蛋白质的结构、功能和分类等信息。常用的蛋白质分子量测定方法有SDS-PAGE电泳、渗透压法、凝胶色谱法等。本实验采用SDS-PAGE电泳法测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE电泳法是一种基于电泳分离和分子筛作用的蛋白质分离技术。在SDS-PAGE电泳中，样品蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，然后在电场作用下迁移。由于SDS的分子量已知，因此根据迁移率和分子量的关系，可以通过计算得出蛋白质的分子量。
三、实验步骤
1.准备试剂和仪器
（1）试剂：蛋白质样品、SDS、甲叉双丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）、甘氨酸碱溶液、冰醋酸、超纯水。
（2）仪器：电泳仪、垂直板电泳槽、摇床、离心管、移液器、计时器、分光光度计。
2.样品制备
（1）将蛋白质样品用Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）稀释至一定浓度。
（2）加入等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液，搅拌均匀。
（3）煮沸5-10分钟，使蛋白质变性并充分与SDS结合。
（4）离心10分钟，取上清液备用。
3.电泳分离
（1）按照电泳仪使用说明书，装配垂直板电泳槽，加入预冷的Tris-HCl缓冲液（pH 6.8）。
（2）将制备好的样品加入电泳槽中，注意不要产生气泡。
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法
目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法
一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法
在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法
SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
蛋白质 分子量 色谱
蛋白质 分子量 色谱
蛋白质的分子量可以通过色谱法进行测定。色谱法是一种分离和分析混合物的技术，它基于混合物中各成分在固定相和流动相之间的分配系数不同而实现分离。
在蛋白质分子量的测定中，常用的色谱技术是凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography，GFC）和高效液相色谱 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。
凝胶过滤色谱是一种基于分子筛原理的色谱技术，它使用具有一定孔径大小的凝胶作为固定相，通过分子量大小的差异来分离蛋白质。蛋白质分子通过凝胶孔时，分子量较小的蛋白质会更容易进入凝胶孔中，而分子量较大的蛋白质则会被排除在凝胶孔外，从而实现分离。通过测量蛋白质的洗脱时间和分子量标准品的洗脱时间，可以计算出蛋白质的分子量。
高效液相色谱则是一种基于吸附-解吸原理的色谱技术，它使用高效液相色谱柱作为固定相，通过蛋白质与固定相之间的相互作用来分离蛋白质。在高效液相色谱中，蛋白质的分子量可以通过测量其保留时间和分子量标准品的保留时间来计算。
蛋白质的分子量通常是一个范围，而不是一个确定的值，因为蛋白质
分子在溶液中的构象可能会发生变化，从而影响其分子量的测量结果。因此，在使用色谱法测量蛋白质分子量时，需要选择合适的色谱条件和分子量标准品，并进行适当的校正和验证。
测定蛋白质相对分子
测定蛋白质相对分子
相对分子量（Mw）是衡量蛋白质大小和形式，用来契合蛋白质之间的比较。它可以被定义为某种蛋白质的分子重量除以其他某种蛋白质的分子重量的比例。相对分子量的测定是有效的方法来确定蛋白分子的特定结构，因为它可以帮助有效地比较和分析多种蛋白分子之间的量，分子形式和结构。
蛋白质相对分子量的测定主要可以通过以下几种方法来实现：
一是电泳分析技术。所谓电泳，就是将带有指定电荷的蛋白质投入到一种凝胶中，然后在电场作用下移动，和分割不同W，相对分子量的蛋白质。这是一种简单快捷的方式来测量蛋白质相对分子量。
二是分光光度法。这是一种利用飞行时间质谱来测定蛋白质相对分子量的先进技术，利用一种称为非相对质谱的先进仪器，以固态的质谱图显示和确定不同蛋白质的相对分子量。
三是双向电泳。这是一种用于测量蛋白质相对分子量的灵活的技术，利用双向凝胶中的使用双向电场来分离不同的蛋白质。它利用不同的电场，可以准确地测定蛋白质之间的区别，并准确确定相对分子量。
最后，细胞分解技术也可以用来测量蛋白质的相对分子量。这种技术不仅可以测量蛋白质的相对分子量，而且还可以用来测量已有的蛋白质的完整性和数量，以用来研究特定的蛋白质性质。
通过以上所提及的几种方法，来测量蛋白质的相对分子量，使科学家们能够有效地了解蛋白质之间的关系，从而加深对蛋白质的研究。它们也有助于确定新的蛋白质结构降解途径和深入研究该领域者关心的各种问题。
蛋白质分子量的测定方法
蛋白质的紫外光谱法测定是基于朗伯比尔定律，即吸光度与溶液浓度和液 层厚度成正比。
操作步骤
1. 准备标准蛋白质溶液和未 知蛋白质溶液，确保浓度准
确。
1
2. 将标准蛋白质溶液和未知 蛋白质溶液分别倒入石英比 色皿中，并记录液层厚度。
操作步骤
样品准备
将蛋白质样品进行适当处理， 如溶解、变性等，以便进行离
子化处理。
离子化处理
通过电喷雾、激光解析等手段 将蛋白质样品进行离子化。
质谱分析
将离子化的蛋白质样品引入质 谱仪中，通过电场和磁场的作 用进行分离和检测。
结果处理
对检测到的质谱数据进行处理 和分析，推算出蛋白质的分子
量。
注意事项
测定蛋白质分子量的重要性
生物功能研究
了解蛋白质的结构和功能关系，有助于研究蛋白 质在生物体内的生理和病理作用。
药物研发
测定蛋白质分子量是药物研发过程中质量控制的 重要环节，有助于评估药物的纯度和有效性。
生物技术应用
在生物技术领域，测定蛋白质分子量对于蛋白质 表达、分离纯化和下游应用具有重要意义。
02 凝胶电泳法
蛋白质分子量的测定 方法
目录
CONTENTS
• 引言 • 凝胶电泳法 • 紫外光谱法 • 质谱法 • 荧光光谱法 • 其他测定方法
蛋白质的分子量测定
蛋白质的分子量测定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
目的要求
∙学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
∙掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。
实验原理:
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
试剂和器材
一、试剂
30％分离胶贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
10％浓缩胶贮存液：10g Acr,0.5g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法
测定蛋白质相对分子质量的方法有多种，以下列举几种常用的方法：
1. SDS-PAGE：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质按照分子量大小分离出来。蛋白质在胁迫条件下与SDS形成复合物，其电荷密度相对一致，所以主要根据蛋白质在凝胶中的迁移距离来估算其分子量。
2. SDS-PAGE-Western blotting：在SDS-PAGE的基础上，将分离出的蛋白质转移到聚合物膜上，并使用特异性抗体检测靶蛋白。通过与已知分子量的标准品比较，可以推断目标蛋白质的相对分子质量。
3. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）：该方法通过将蛋白质与基质结合后，利用激光辐射将其离子化，并通过不同质荷比（m/z）的飞行时间分析获得蛋白质的质量/电荷比。结合已知质量的标准品，可计算得到蛋白质的分子量。
4. 高效液相色谱-多角度光散射（HPLC-MALS）：通过高效液相色谱分离蛋白质，并结合多角度光散射检测器，测量蛋白质溶液中散射光强的变化。根据多角度光散射理论，计算出蛋白质颗粒的质量和大小分布，从而推断其相对分子质量。
需要注意的是，不同的方法可能有其适用范围和准确性上的差异，因此选择合适的方法需要根据具体实验目的和条件进行评估。
高等生化实验报告：蛋白质分子量的测定
试验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法
一、原理
凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有肯定孔径大小的多孔
凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流淌相经过凝胶层析柱时，其
中各组分按其分子大小不同而被分别的技术。该法设备简洁、操作便利、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状构造、呈珠状颗粒
的物质，每个颗粒的微小构造及筛孔的直径均匀全都，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子
大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析
柱上时，这些物质即随洗脱液的流淌而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再集中出来，故流程长，移动速度慢，最终被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此
获得分别。假设分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和集中的程度不同，在凝胶柱中所经过的路
程和时间也不同，从而彼此可以分别开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt 表示。实质上
Vt 是由Vo，Vi 与Vg 三局部组成，Vo 称为“孔隙体积”或“外水体
积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流淌相的体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg 为凝胶本身的体积。洗脱体积〔Ve〕与Vo 与Vi 之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。
测定蛋白质分子量的常用方法
测定蛋白质分子量的常用方法
测定蛋白质分子质量常用的方法有三种：沉降分析法、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。其基本原理如下：
(1)沉降分析法：又叫超速离心法。蛋白质溶液经高速离心分离时，在离心场的作用下蛋白质分子下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据沉降速度求出沉降系数(以s表示)，即单位离心场的沉降速度。将沉降系数代入公式，即可计算出蛋白质的相对分子质量。
M=RTs/D(1-Vρ)
式中：R——气体常数(8.314×107)；T——绝对温度；D——扩散系数；V——蛋白质分子的偏微比容(即无限大体积的溶液中加入1g蛋白质时溶液所增加的体积)；ρ——溶剂密度[20℃时每毫升的质量(g)]；s——沉降系数；M——蛋白质的相对分子质量。
(2)凝胶过滤法：又称分子筛层析法。此法是在层析柱中装入葡聚糖(如Sephadex)凝胶，这种凝胶颗粒具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，分子量小的后下来。将已知分子量的标准蛋白质混合物上柱，洗脱，根据洗脱峰位置量出各种蛋白质的洗脱体积，然后用分子量的对数为横坐标，以洗脱体积为纵坐标，制作标准曲线。测定时，根据紫外检测洗脱峰位置，量出待测样品的洗脱体积，由标准曲线
可查出其分子质量。
(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、形状和所带的电荷。而
走进蛋白质的微观世界：详解测定蛋白质分子量的多种方法
走进蛋白质的微观世界：详解测定蛋白质分子量
的多种方法
蛋白质是生物体内最重要的分子之一，扮演着调节生命活动的关键角色。了解蛋白质的分子量对于理解其结构和功能至关重要。然而，由于蛋白质的复杂性和多样性，测定其分子量一直是生物药物领域的挑战之一。在本文中，我们将详细介绍测定蛋白质分子量的多种方法，为您揭示蛋白质微观世界的奥秘。
1.SDS-PAGE电泳法。
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分子量测定方法。该方法通过将蛋白质溶液与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合，使蛋白质变性并带负电荷，然后将其分离在凝胶中。根据蛋白质在凝胶中的迁移速度，可以估计其分子量。
2.小角X射线散射法。
小角X射线散射（SAXS）是一种高级的技术，可用于测定蛋白质的分子量和结构。通过照射蛋白质样品并测量散射的X射线，可以获得关于蛋白质的结构信息。结合其他技术，如晶体学和核磁共振（NMR），SAXS可提供关于蛋白质三维结构的宝贵
信息。
3.质谱法。
质谱法是一种高分辨率的方法，可用于测定蛋白质的分子量。其中，基于时间飞行（TOF）质谱和质荷比（m/z）测量的飞行时间质谱（MALDI-TOF）是最常用的技术
之一。通过将蛋白质样品与基质混合，并通过激光脉冲使其电离，可以测量蛋白质离子的质量和荷质比，从而得出其分子量。
4.胶体浊度法。
胶体浊度法是一种简单而常用的测定蛋白质分子量的方法。基于蛋白质在水溶液中形成的胶体粒子导致光的散射，可以测量光的强度来估计蛋白质的分子量。这种方法在工业中广泛应用于蛋白质的质量控制和纯化过程中。
蛋白质分子量鉴定
百泰派克生物科技
蛋白质分子量鉴定
分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能是否正确。蛋白质分子量鉴定是蛋白质相关鉴定工作的基础。百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质分子量鉴定服务。
蛋白质分子量
蛋白质分子量，一般指蛋白质相对分子质量，是蛋白质化学式中各个原子的相对原子质量的和，用符号Mr表示。分子量正确与否往往预示着蛋白质的结构和功能是否正确。蛋白质分子量鉴定是蛋白质相关鉴定工作的基础，可用于对蛋白质是否为目的蛋白进行判断，以及用于未知蛋白的测定等。
蛋白质分子量鉴定方法
蛋白质分子量测定的方法有很多，目前常用的主要包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-PAGE法、渗透压法、光散射法、超速离心沉降法，以及质谱分析法。其中质谱分析法主要包括电喷雾离子化（ESI）质谱技术和基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱技术。在这些方法中，SDS-PAGE法是实验室应用最普遍的，它可分为还原电泳和非还原电泳，还原电泳中蛋白质二硫键被还原使得蛋白质可以充分伸展，因此还原电泳的测定结果更为准确。质谱法鉴定蛋白质分子量相对于其他方法对样品的消耗很少，且具有更高的灵敏度、分辨率和准确度，有利于对复杂混合物样品的分析，如MALDI质谱技术不仅能对有较高污染的样品进行鉴定且能覆盖更广泛的分子量范围。
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法
目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法
一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法
在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法
SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
蛋白质分子量的测定方法
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．蛋白质空间结构与功能的关系
◆ 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础， 空间结构变化，其功能也随之改变。肌红 蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的 例子。
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◆ 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进 行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb 是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储
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◆ 4．沉降法（超速离心法）
◆ 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的 沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分 子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时 ，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉， 沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用 光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉 降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根 据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式 ，即可计算出蛋白质的分子质量。
◆ 例如哺乳动物的胰岛素，其一级结构仅个别氨基酸差异 （A链5、6、10位，B链30位），它们对生物活性调节糖 代谢的生理功能不起决定作用。
◆ 从各种生物的细胞色素C(cytochrome c ) 的一级结构分析， 可以了解物种进化间的关系。进化中越接近的生物，它们 的细胞色素c的一级结构越近似。
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◆ （三）分子病
◆ 分子病是指机体DNA分子上基因缺陷引起mRNA 分子异常和蛋白质生物合成的异常，进而导致机 体某些功能和结构随之变异的遗传病。在1904年， 发现镰刀状红细胞贫血病。大约化费了40多年才 清楚患病原因，患者的血红蛋白（HbS）与正常 人的（HbA）相比，仅β-链的第6位上，Val取代 了正常的Glu。目前全世界已发现有异常血红蛋白 400种以上。
测定蛋白质分子量的原理
测定蛋白质分子量的原理
测定蛋白质分子量的原理一般有以下几种：
1. SDS-PAGE：SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分子量测定方法。首先，将蛋白质样品与SDS（阴离子表面活性剂）热处理使其具有带负电荷，然后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。由于SDS使蛋白质分子呈现均匀的线性形态，电泳时会根据蛋白质分子的大小形成不同的带。通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质分子量。
2. 基于质谱的方法：质谱测定蛋白质分子量的常用方法是质谱分析（如质谱摄谱法或飞行时间质谱法）。该方法将蛋白质样品经过解析后，通过对产生的质谱图谱进行分析，可以得到蛋白质的质量/电荷比（m/z）信息。通过与已知分子量的标准蛋白质比对，可以推断待测蛋白质的分子量。
3. 整体流动测定法：整体流动测定法是一种通过测量蛋白质在流体中的行为进行分析的方法。其中，动态光散射与色散数据被用于推导一些与蛋白质分子量相关的参数。这些参数可用于估算待测蛋白质的分子量。
4. 其他方法：还有一些其他的方法可以用于测定蛋白质分子量，如凝胶过滤法、凝胶渗析法、次级结构分析等。这些方法根据蛋白质分子量对物质在某种条件下的行为差异进行分析和测定。
需要注意的是，不同的方法可能在操作步骤和条件上有所差异，因此在选择和应用方法时需要根据具体实验需求和条件选择适合的方法。
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南京林业大学实验报告
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实验四蛋白质分子量的测定
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
一、实验原理
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。它具有电泳和分子筛的双重作用。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE) ，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠）。
3.SDS是阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。（空间构象破坏）
4.蛋白质与SDS分子按比例(1.4gSDS/g蛋白质)结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷,因而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
5.当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
二、凝胶的原理
1.聚丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂 N ， N –亚甲基双丙烯酰胺（Bis 在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
2.双丙烯酸铵决定交联形成的程度，丙烯酰胺决定决定交联的长度
3.常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）
（1）过硫酸铵 (AP) – TEMED （四甲基乙二胺）系统
在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵 [（NH4）2S2O8 ] 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行（pH8.8)。
（2）核黄素– TEMED 系统
这是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。
4.凝胶的浓度：
常用的所谓标准胶是指浓度为 7.5 ％的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此
胶中电泳都能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用 7.5 ％的标准凝胶或用4％～ 10％的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。
5.SDS-PAGE电泳系统有两种：
（1）连续聚丙烯酰胺电泳系统：凝胶全部有分离胶组成，不具备浓缩效应。（2）不连续的聚丙烯酰胺电泳系统：由浓缩胶和分离胶组成。
通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。
三、实验试剂：
Acr（acrylamide）/Bis 储备液
10% (w/v) SDS ：
TEMED(四甲基乙二胺)
过硫酸铵 (AP):10%现配现用
Tris－HCL缓冲系统，
分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8）
浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8
电极泳缓冲液：使用的Tris－甘氨酸缓冲系统：pH 8.3内含SDS
样品缓冲液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ）
染色液（考马斯亮蓝 R-250）
脱色液：（甲醇：冰醋酸：水=4：1：5）
溴粉兰：0.1%
四、实验步骤：
l. 贮液配制：
应注意：
（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放 l ～ 2 个月。
（2）过硫酸铵应当天配制。
（3）如有不溶物要过滤。
（4）显色液用前再混和。
（5）电极缓冲液用时稀释 10 倍。
2. 安装夹心式垂直板电泳槽
3.配胶：采用不连续系统
1）分离胶的制备（10ml，12%）：
4. 样品的处理及点样：
将提取的蛋白质（或标准蛋白）中加入等体积的上样缓冲液，混匀，置于沸水浴中加热5min，冷却后经10000rpm离心15min，取上清液点样。
5.电泳：
将制好胶的电泳槽放入底座中，加入电极缓冲液，上层液中加入溴粉兰指示剂，连接好电泳仪，开始电泳。
浓缩胶恒压75V，分离胶恒压120V，电泳时间约90min。
6.染色和脱色：
当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘 1 cm 时，电泳结束。
将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗2-3遍，倒入染色液染色2-3h或静置过夜。
染色结束后，用蒸馏水冲洗胶2-3遍，以清除多余的染料，倒入脱色液，置于脱色摇床上脱色，中间换1-2次脱色液，直至背景色完全脱掉。
附：样品的制备
称取植物材料 1 g ，放入研钵内，加 pH8.0 提取液 1 mL ，于冷水浴中研成匀浆，然后以 2 mL 提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000 rpm 离心 10min
注意事项 :
制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
五、实验结果
logMV=K-bX
由图线得：K= 8.44 b=4.51
六、反思总结
本次实验操作十分复杂并且耗时长，所以我们就以理论方式来完成这次实验。通过学习理论知识我知道这次实验有一定的危险性，所以在做实验时就要需要注意人身安全。