蛋白质分子量的测定
蛋白分子量和检测条带
蛋白分子量和检测条带
蛋白分子量是指蛋白质分子的质量大小，通常以千道尔顿（kDa）为单位。
蛋白质的分子量可以通过凝胶电泳等方法进行测定。
在凝
胶电泳中，可以根据蛋白质在电场中的迁移速率来估算其分子量。
另一种常用的方法是质谱分析，通过质谱仪可以准确测定蛋白质的
分子量。
而检测条带通常是指在蛋白质凝胶电泳或者免疫印迹等实验中
观察到的蛋白条带。
这些条带可以代表不同分子量的蛋白质，通过
与标准蛋白质分子量标记物进行比较，可以确定待测蛋白的分子量。
此外，检测条带的强度和位置也可以提供关于蛋白质表达水平和其
他特性的信息。
从实验角度来看，测定蛋白质分子量和观察检测条带是蛋白质
研究中非常重要的步骤。
这些数据可以帮助研究人员了解蛋白质的
结构和功能，以及在不同生理或病理条件下的变化。
同时，这些信
息也对于药物研发、疾病诊断和治疗等方面具有重要意义。
从应用角度来看，蛋白质分子量和检测条带的信息在许多领域
都有广泛的应用。
比如在生物医学研究中，可以通过测定蛋白质分
子量和观察检测条带来研究疾病机制、筛选药物靶点等。
在生物工程和生物制药领域，这些数据也可以用于优化蛋白质表达和纯化工艺。
总之，蛋白质分子量和检测条带的研究对于推动生命科学领域的发展具有重要意义。
综上所述，蛋白质分子量和检测条带在蛋白质研究中扮演着重要角色，从实验和应用两个角度来看，这些数据对于我们深入了解蛋白质的结构、功能和应用具有重要意义。
蛋白质分子量的测定方法
精品课件
◆ 1．根据化学组成测定最低相对分子质量
◆ 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假 设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质 的最低分子量。肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分别 求它们的最低分子量：
◆ 肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷0.335×100=16700，与其 他方法测分子量相符。
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◆ 4．沉降法（超速离心法） ◆ 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的
沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分 子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时 ，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉， 沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用 光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉 降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根 据沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式 ，即可计算出蛋白质的分子质量。
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．蛋白质空间结构与功能的关系
◆ 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础， 空间结构变化，其功能也随之改变。肌红 蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的例 子。
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◆ 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进行 可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb是 四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存 氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们 的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一条 S 型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧 亲和性高很多，p(O2)为2.8torr(1torr≈133.3Pa) 时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高p(O2)下，如 在肺部（大约100torr）时，两者几乎都被饱和。 其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧 转运系统。
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◆ 3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。
通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。
分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。
通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。
分子量大约为5000kd的蛋白质分子量检测体积排阻
为了测定分子量大约为5000kd（即5×10^6 Da）的蛋白质分子的分子量，采用体积排阻色谱法（SEC）是一种常用的方法。
这种方法基于分子流过凝胶孔洞时的排阻作用来分离不同大小的分子。
在体积排阻色谱中，凝胶或聚合物的孔径决定了它们能够分离的最大分子量。
通常，商用SEC柱的孔径范围从几百纳米到几微米不等。
因此，对于5×10^6 Da的蛋白质分子，需要选择孔径足够小的凝胶来确保其完全排阻。
具体的选择取决于所使用的SEC柱的规格和性能。
一般来说，对于这种分子量范围的蛋白质，使用具有较小孔径的SEC柱是一种理想的选择，如使用细粒度的Superdex或Toya Soka GEL。
在实际操作中，使用适当规格的SEC柱并遵循色谱柱的操作指南至关重要。
通过这种方式，可以获得准确且可靠的分子量测定结果。
同时，也可以根据所使用的设备规格和手册，进行具体的色谱柱选择和操作步骤。
蛋白质 分子量 色谱
蛋白质 分子量 色谱
蛋白质的分子量可以通过色谱法进行测定。
色谱法是一种分离和分析混合物的技术，它基于混合物中各成分在固定相和流动相之间的分配系数不同而实现分离。
在蛋白质分子量的测定中，常用的色谱技术是凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatography，GFC）和高效液相色谱 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。
凝胶过滤色谱是一种基于分子筛原理的色谱技术，它使用具有一定孔径大小的凝胶作为固定相，通过分子量大小的差异来分离蛋白质。
蛋白质分子通过凝胶孔时，分子量较小的蛋白质会更容易进入凝胶孔中，而分子量较大的蛋白质则会被排除在凝胶孔外，从而实现分离。
通过测量蛋白质的洗脱时间和分子量标准品的洗脱时间，可以计算出蛋白质的分子量。
高效液相色谱则是一种基于吸附-解吸原理的色谱技术，它使用高效液相色谱柱作为固定相，通过蛋白质与固定相之间的相互作用来分离蛋白质。
在高效液相色谱中，蛋白质的分子量可以通过测量其保留时间和分子量标准品的保留时间来计算。
蛋白质的分子量通常是一个范围，而不是一个确定的值，因为蛋白质
分子在溶液中的构象可能会发生变化，从而影响其分子量的测量结果。
因此，在使用色谱法测量蛋白质分子量时，需要选择合适的色谱条件和分子量标准品，并进行适当的校正和验证。
蛋白直径 分子量
蛋白直径分子量蛋白质是生物体中至关重要的分子，其结构和功能的研究对于深入了解生命现象和疾病机制具有重要意义。
在蛋白质研究中，蛋白直径和分子量是两个关键参数。
本文将介绍蛋白直径与分子量的基本概念、测量方法以及在生物科学中的应用和重要性。
一、蛋白直径与分子量的基本概念蛋白直径是指蛋白质分子在空间中的最大尺寸，通常用纳米（nm）作为单位。
分子量则是指蛋白质分子中所有原子质量的总和，单位为道尔顿（Da）。
这两个参数可以反映蛋白质的结构特征和功能性质。
二、蛋白直径与分子量的测量方法1.光散射法：通过测量蛋白质溶液中的光散射强度，结合斯托克斯-埃雷尔方程，计算出蛋白直径和分子量。
2.动态光散射法：通过测量蛋白质溶液在动态条件下的光散射强度，计算出蛋白直径和分子量。
3.电泳法：利用电场驱动蛋白质分子在凝胶中迁移，根据迁移速度和分子量的关系，计算出蛋白直径和分子量。
4.质谱法：通过对蛋白质进行断裂解离，分析断裂片段的质量，推算出蛋白质的分子量。
三、蛋白直径与分子量的应用领域1.生物化学与分子生物学研究：蛋白直径和分子量对于研究蛋白质结构与功能的关系具有重要意义。
2.药物研发：通过测量药物靶点蛋白的直径和分子量，有助于筛选潜在的药物候选分子。
3.生物传感器：利用蛋白直径和分子量的特异性，开发具有高灵敏度和特异性的生物传感器。
4.生物工程：在蛋白质工程中，精确测量蛋白直径和分子量有助于优化蛋白质设计和生产过程。
四、蛋白直径与分子量在生物科学中的重要性1.结构生物学：蛋白直径和分子量是蛋白质结构研究的基础数据，有助于揭示蛋白质的空间构象和功能域。
2.功能研究：蛋白直径和分子量与蛋白质的生物活性、相互作用、定位等生物学功能密切相关。
3.疾病诊断与治疗：蛋白质异常导致的疾病，如肿瘤、炎症等，其蛋白直径和分子量的变化可作为疾病诊断和治疗的生物标志物。
五、提高蛋白直径与分子量测量技术的展望随着生物科学技术的不断发展，蛋白直径和分子量测量技术也在不断进步。
高等生化实验报告：蛋白质分子量的测定
实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法一、原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。
当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。
凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。
当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。
大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。
若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。
总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。
将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。
实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。
Vg为凝胶本身的体积。
洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。
式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。
它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。
Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。
蛋白质的分子量测定
蛋白质的分子量测定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法目的要求∙学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
∙掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。
实验原理:SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS 的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
试剂和器材一、试剂30％分离胶贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
10％浓缩胶贮存液：10g Acr,0.5g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。
样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。
用来溶解标准蛋白质及待测固体染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。
蛋白质分子量的测定方法
荧光光谱法是一种利用荧光物质发出 荧光的特性进行检测的方法。在蛋白 质分子量的测定中，荧光光谱法通过 测量荧光物质与蛋白质结合前后荧光 光谱的变化，推算出蛋白质的分子量。
VS
荧光物质能够吸收特定波长的光，并 发出特定波长的荧光。当荧光物质与 蛋白质结合时，荧光光谱会发生改变， 这种改变与蛋白质的分子量有关。
根据荧光光谱的变化，利 用已知的荧光物质分子量 和蛋白质分子量之间的关 系，计算出蛋白质的分子 量。
注意事项
选择合适的荧光物质
根据蛋白质的性质选择合适的荧光物质，以 确保测量结果的准确性。
避免光漂白
在测量过程中，应避免长时间照射导致荧光 物质光漂白的现象。
控制实验条件
保持实验温度、pH值等条件的恒定，以减 小误差。
操作步骤
样品准备
将蛋白质样品进行适当处理， 如溶解、变性等，以便进行离
子化处理。
离子化处理
通过电喷雾、激光解析等手段 将蛋白质样品进行离子化。
质谱分析
将离子化的蛋白质样品引入质 谱仪中，通过电场和磁场的作 用进行分离和检测。
结果处理
对检测到的质谱数据进行处理 和分析，推算出蛋白质的分子
量。
注意事项
操作步骤
01
02
03
04
05
准备荧光物质和 蛋白质样品
测量荧光光谱
蛋白质与荧光物 质结合
测量结合后的荧 光光谱
计算分子量
选择适当的荧光物质，制 备已知浓度的蛋白质样品 。
在激发波长下照射荧光物 质，测量其发射波长下的 荧光光谱。
将蛋白质样品与荧光物质 混合，静置一段时间，使 两者充分结合。
再次测量荧光光谱，观察 荧光光谱的变化。
01
测定蛋白质分子量的常用方法
测定蛋白质分子量的常用方法测定蛋白质分子质量常用的方法有三种：沉降分析法、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
其基本原理如下：(1)沉降分析法：又叫超速离心法。
蛋白质溶液经高速离心分离时，在离心场的作用下蛋白质分子下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。
根据沉降速度求出沉降系数(以s表示)，即单位离心场的沉降速度。
将沉降系数代入公式，即可计算出蛋白质的相对分子质量。
M=RTs/D(1-Vρ)式中：R——气体常数(8.314×107)；T——绝对温度；D——扩散系数；V——蛋白质分子的偏微比容(即无限大体积的溶液中加入1g蛋白质时溶液所增加的体积)；ρ——溶剂密度[20℃时每毫升的质量(g)]；s——沉降系数；M——蛋白质的相对分子质量。
(2)凝胶过滤法：又称分子筛层析法。
此法是在层析柱中装入葡聚糖(如Sephadex)凝胶，这种凝胶颗粒具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。
当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，分子量小的后下来。
将已知分子量的标准蛋白质混合物上柱，洗脱，根据洗脱峰位置量出各种蛋白质的洗脱体积，然后用分子量的对数为横坐标，以洗脱体积为纵坐标，制作标准曲线。
测定时，根据紫外检测洗脱峰位置，量出待测样品的洗脱体积，由标准曲线可查出其分子质量。
(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、形状和所带的电荷。
而SDS(十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同。
SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。
当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，并且使蛋白质分子形状都变成长椭圆棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有电荷和形状的差异。
这样电泳的速度只取决于蛋白质分子质量的大小。
走进蛋白质的微观世界：详解测定蛋白质分子量的多种方法
走进蛋白质的微观世界：详解测定蛋白质分子量的多种方法蛋白质是生物体内最重要的分子之一，扮演着调节生命活动的关键角色。
了解蛋白质的分子量对于理解其结构和功能至关重要。
然而，由于蛋白质的复杂性和多样性，测定其分子量一直是生物药物领域的挑战之一。
在本文中，我们将详细介绍测定蛋白质分子量的多种方法，为您揭示蛋白质微观世界的奥秘。
1.SDS-PAGE电泳法。
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
该方法通过将蛋白质溶液与SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂混合，使蛋白质变性并带负电荷，然后将其分离在凝胶中。
根据蛋白质在凝胶中的迁移速度，可以估计其分子量。
2.小角X射线散射法。
小角X射线散射（SAXS）是一种高级的技术，可用于测定蛋白质的分子量和结构。
通过照射蛋白质样品并测量散射的X射线，可以获得关于蛋白质的结构信息。
结合其他技术，如晶体学和核磁共振（NMR），SAXS可提供关于蛋白质三维结构的宝贵信息。
3.质谱法。
质谱法是一种高分辨率的方法，可用于测定蛋白质的分子量。
其中，基于时间飞行（TOF）质谱和质荷比（m/z）测量的飞行时间质谱（MALDI-TOF）是最常用的技术之一。
通过将蛋白质样品与基质混合，并通过激光脉冲使其电离，可以测量蛋白质离子的质量和荷质比，从而得出其分子量。
4.胶体浊度法。
胶体浊度法是一种简单而常用的测定蛋白质分子量的方法。
基于蛋白质在水溶液中形成的胶体粒子导致光的散射，可以测量光的强度来估计蛋白质的分子量。
这种方法在工业中广泛应用于蛋白质的质量控制和纯化过程中。
5.分子排斥色谱法。
分子排斥色谱（SEC）是一种基于蛋白质在柱子上分离的方法，可用于测定其分子量。
蛋白质样品在分子量标准物质中的作用下，根据大小进行分离。
分子量较大的蛋白质会较快地通过柱子，而分子量较小的蛋白质会较慢。
通过与已知分子量的标准物质进行比较，可以确定待测蛋白质的分子量。
通过这些方法，科学家们能够准确地测定蛋白质的分子量，进而揭示其功能和结构。
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。
通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。
分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。
通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。
第4章 蛋白质的分子量研究法
二. 分子量的研究方法 • 测定蛋白质的分子量有多种, 现分述如下:
(一) 根据化学组成推测最低分子量
• 是根据蛋白质样品中含有某种微量 元素或某种特殊物质的百分含量, 並假设分子中只含一个被测元素原 子或基团,推测最低分子量.
• 肌红蛋白含铁0.335%,其最低分子量: (铁的原子量/铁的百分含量)×100＝ (55.8/0.335)×100＝16657
(六) 凝胶薄板层析法
将凝胶涂在玻璃板上,把样品点在 胶板上, 然后用推动剂推动,不同的样品即 可据分子量不同而分开.
设层析后溶剂前沿到点样线的距离 为do, 层析后某标准蛋白质位置到点样线 的距离为de. 则 Rf=de/do Rf与分子量的关系为: lgM=a-b/Rf
25 20
lg M
但是,蛋白质溶液不是理想溶 液,故上式不适合蛋白质溶液,需修 正. P=(C/M)RT + KC2 K是和溶质、溶剂有关的常 数。整理得 P／C ＝ RT／M ＋KC P／C称为比浓渗透压。
• 这是一条直线方程，测定一系列 浓度蛋白质溶液的渗透压后，由 P／C对C作图，得一直线。 • 该直线的截距是RT／M。 • 由RT／M计算分子量。
Kd有不同情况： 1. 当Kd＝0时，Ve=Vo,样品全部 被排阻，不能进入凝胶颗粒中。 2.当kd=1时，Ve=Vo+Vi,样品全部 进入凝胶颗粒内部。
3.当0<Kd<1时,Ve=Vo+kdVi, 表示内水体积只有一部分被利用. 不同样品的Kd不同,洗脫体积 就不同,就可以分离开. 4.有时Kd>1,表示凝胶对组分 有吸附作用.
第四章 蛋白质分子量研究法
蛋白质是分子量很大的分子, 其分子量的研究方法与研究小分子 的方法不同.用研究小分子的方法 来研究蛋白质的分子量是无能为力 的. 用化学方法测得的分子量称为 化学分子量;用物理方法测得的分 子量称为物理分子量.
测定蛋白质分子量的原理
测定蛋白质分子量的原理
测定蛋白质分子量的原理一般有以下几种：
1. SDS-PAGE：SDS-PAGE是一种常用的蛋白质分子量测定方法。
首先，将蛋白质样品与SDS（阴离子表面活性剂）热处理使其具有带负电荷，然后在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离。
由于SDS使蛋白质分子呈现均匀的线性形态，电泳时会根据蛋白质分子的大小形成不同的带。
通过与已知分子量的标准品比较，可以确定待测蛋白质分子量。
2. 基于质谱的方法：质谱测定蛋白质分子量的常用方法是质谱分析（如质谱摄谱法或飞行时间质谱法）。
该方法将蛋白质样品经过解析后，通过对产生的质谱图谱进行分析，可以得到蛋白质的质量/电荷比（m/z）信息。
通过与已知分子量的标准蛋白质比对，可以推断待测蛋白质的分子量。
3. 整体流动测定法：整体流动测定法是一种通过测量蛋白质在流体中的行为进行分析的方法。
其中，动态光散射与色散数据被用于推导一些与蛋白质分子量相关的参数。
这些参数可用于估算待测蛋白质的分子量。
4. 其他方法：还有一些其他的方法可以用于测定蛋白质分子量，如凝胶过滤法、凝胶渗析法、次级结构分析等。
这些方法根据蛋白质分子量对物质在某种条件下的行为差异进行分析和测定。
需要注意的是，不同的方法可能在操作步骤和条件上有所差异，因此在选择和应用方法时需要根据具体实验需求和条件选择适合的方法。
蛋白质分子量的测定方法
整理版
7
◆ （二）种属差异
◆ 大量实验结果证明，一级结构相似的多肽或蛋白质，其 空间结构和功能也相似，不同种属的同源蛋白质有同源序 列，反映其共同进化起源，通过比较可以揭示进化关系。
整理版
3
◆ 3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
◆ 蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质 分子的大小、分子形状和所带电荷的多少。SDS（十二烷
基磺酸钠）是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基 。当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，
使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的 形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带 电荷量和分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白 质分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分 子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数 和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相 对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。
◆ 血红蛋白含铁也是0.335%，最低分子量也为16700，但 用其他方法测分子量为68000，即每一个血红蛋白含有4 个铁原子，由此计算更为准确分子量为： 16700×4=66800。
整理版
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◆ 2．凝胶过滤法
◆ 凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子 量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一 特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量 的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几 种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析， 以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数 作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样 的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积 ，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的 分子量。
蛋白质的分子量
蛋白质的分子量蛋白质是生命体中最为重要的有机物之一，其分子量是评价蛋白质性质和功能的重要指标之一。
蛋白质的分子量通常用dalton（Da）或kilo dalton（kDa）来表示，其中1kDa等于1000Da。
本文将从蛋白质分子量的定义、测定方法、影响因素和意义等方面进行详细介绍。
一、蛋白质分子量的定义蛋白质分子量是指一个蛋白质分子中所有氨基酸残基的相对分子量之和。
每个氨基酸残基都有一个相对分子量，这些相对分子量加在一起就得到了整个蛋白质分子的相对分子量。
二、测定方法1. SDS-PAGE法SDS-PAGE法是目前最常用的测定蛋白质相对分子量的方法之一。
该方法利用SDS（十二烷基硫酸钠）使样品中的所有蛋白质带有同等数量的电荷，从而使它们在电场作用下按照大小排列成带状图谱。
通过与已知相对分子量的标准品比较，可以确定样品中各蛋白质的相对分子量。
2. 质谱法质谱法是一种高灵敏度、高分辨率的测定蛋白质相对分子量的方法。
该方法将蛋白质分子离子化后，通过质谱仪测定其离子的质荷比，从而计算出其相对分子量。
3. 其他方法除了上述两种方法外，还有许多其他测定蛋白质相对分子量的方法，如凝胶过滤色谱法、反射光谱法等。
三、影响因素1. 氨基酸序列不同氨基酸序列的蛋白质具有不同的相对分子量。
例如，含有大量重氮酸（D）和丙氨酸（P）残基的蛋白质相对分子量较低。
2. 翻译后修饰翻译后修饰可以改变蛋白质中氨基酸残基的性质和数量，从而影响其相对分子量。
例如，磷酸化会增加蛋白质的相对分子量。
3. 聚合状态某些蛋白质在特定条件下可以形成聚合体，其相对分子量会随着聚合体的大小而增加。
四、意义蛋白质的相对分子量是评价蛋白质性质和功能的重要指标之一。
不同相对分子量的蛋白质具有不同的生物学功能和结构特点。
例如，小分子量的蛋白质通常具有较强的扩散性和可溶性，而大分子量的蛋白质则通常具有较高的稳定性和复杂结构。
总之，蛋白质分子量是评价蛋白质性质和功能的重要指标之一。
蛋白质分子量的测定方法
．蛋白质空间结构与功能的关系
◆ 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础， 空间结构变化，其功能也随之改变。肌红 蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的 例子。
◆ 肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进 行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb 是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储 存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它 们的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一 条 S型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白 对氧亲和性高很多，p(O2)为 2.Байду номын сангаасtorr(1torr≈133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱和 状态。在高p(O2)下，如在肺部（大约100torr） 时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的 将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。
◆ 4．沉降法（超速离心法） ◆ 沉降系数（S）是指单位离心场强度溶质的
沉降速度。S也常用于近似地描述生物大分 子的大小。蛋白质溶液经高速离心分离时， 由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，沉 降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光 学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降 行为，可判断出蛋白质的沉降速度。根据 沉降速度可求出沉降系数，将S带入公式， 即可计算出蛋白质的分子质量。
蛋白质分子量的测定方法
◆ 1．根据化学组成测定最低相对分子质量
◆ 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元素的含量，并假 设分子中只有一个这种元素的原子，就可以计算出蛋白质 的最低分子量。肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分 别求它们的最低分子量：
◆ 肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷0.335× 100=16700，与 其他方法测分子量相符。
概率计算表明，8个半胱氨酸残基结合成4对二硫键，可随机组合成105 种配对方式，而事实上只形成了天然酶的构象，这说明一级结构未破 坏，保持了氨基酸的排列顺序就可能回复到原来的三级结构，功能依 然存在。
蛋白质总分子量测定的方法有哪些？
蛋白质总分子量测定的方法有哪些？蛋白质是生物体内重要的功能分子，其总分子量对于了解蛋白质的结构、功能和相互作用具有重要意义。
蛋白质总分子量的准确测定为生物研究、生物医学和药物研发提供了关键信息。
本文将介绍蛋白质总分子量测定的方法，包括质谱分析、凝胶电泳和色谱技术，并探讨它们在不同应用领域的优势和适用性。
1.质谱分析。
质谱分析是一种高分辨率、高灵敏度的方法，可用于准确测定蛋白质总分子量。
质谱仪器通过测量蛋白质样本中离子的质量和质荷比，根据离子质量与电荷之比推算蛋白质的分子量。
质谱分析方法包括飞行时间质谱（TOF）、离子阱质谱和多重四极杆质谱（MS/MS）等。
质谱分析具有高分辨率、高准确性和高通量的优势，适用于复杂蛋白质样本的分子量测定。
2.凝胶电泳。
凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，可用于估算蛋白质总分子量。
常见的凝胶电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳-免疫印迹（Western blotting）。
在PAGE中，蛋白质根据其分子量在凝胶中进行分离，通过与标准分子量蛋白进行比较，可以大致估算样品中蛋白质的总分子量。
凝胶电泳具有操作简单、成本低廉的优点，常用于初步估算蛋白质总分子量。
3.色谱技术。
色谱技术是一类常用的分离和分析方法，也可用于蛋白质总分子量的测定。
例如，凝胶渗透色谱（GPC）和高效液相色谱（HPLC）等。
在GPC中，蛋白质在固定相中根据分子大小进行分离，通过与标准分子量蛋白进行比较，可以推测样品中蛋白质的总分子量。
HPLC则利用流动相中的梯度洗脱和不同色谱柱的分离能力，实现蛋白质的分离和分析。
4.方法选择和综合应用。
不同的方法在蛋白质总分子量测定中具有各自的优势和适用性。
质谱分析提供高精确度和高通量，适用于复杂蛋白质样本的精确测定。
凝胶电泳操作简单、成本低廉，适用于快速估算蛋白质总分子量。
色谱技术在蛋白质分离和分析方面具有优异的分辨能力和灵敏度。
蛋白质总分子量的准确测定对于生物研究、生物医学和药物研发具有重要意义。
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南京林业大学实验报告
专业学号姓名日期
实验四蛋白质分子量的测定
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
一、实验原理
1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）是根据被分离物质所带的电荷多少及其分子大小、形状的不同，在电场的作用下，产生不同的移动速度而分离的方法。
它具有电泳和分子筛的双重作用。
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE) ，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠）。
3.SDS是阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
（空间构象破坏）
4.蛋白质与SDS分子按比例(1.4gSDS/g蛋白质)结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷,因而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
5.当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
二、凝胶的原理
1.聚丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂 N ， N –亚甲基双丙烯酰胺（Bis 在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。
相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
2.双丙烯酸铵决定交联形成的程度，丙烯酰胺决定决定交联的长度
3.常用的催化剂（包括催化剂和加速剂）
（1）过硫酸铵 (AP) – TEMED （四甲基乙二胺）系统
在 Acr 和 Bis 的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵 [（NH4）2S2O8 ] 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。
聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。
这种催化系统需要在碱性条件下进行（pH8.8)。
（2）核黄素– TEMED 系统
这是一个光激发的催化反应。
核黄素在光照下分解，被还原成无色型，但在有氧条件下，无色型又被氧化成有游离基的黄素环，使聚合作用开始。
4.凝胶的浓度：
常用的所谓标准胶是指浓度为 7.5 ％的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此
胶中电泳都能得到满意的结果。
当分析一个未知样品时，常常先用 7.5 ％的标准凝胶或用4％～ 10％的凝胶梯度来试测，选出适宜的凝胶浓度。
5.SDS-PAGE电泳系统有两种：
（1）连续聚丙烯酰胺电泳系统：凝胶全部有分离胶组成，不具备浓缩效应。
（2）不连续的聚丙烯酰胺电泳系统：由浓缩胶和分离胶组成。
通过浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。
三、实验试剂：
Acr（acrylamide）/Bis 储备液
10% (w/v) SDS ：
TEMED(四甲基乙二胺)
过硫酸铵 (AP):10%现配现用
Tris－HCL缓冲系统，
分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8）
浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8
电极泳缓冲液：使用的Tris－甘氨酸缓冲系统：pH 8.3内含SDS
样品缓冲液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ）
染色液（考马斯亮蓝 R-250）
脱色液：（甲醇：冰醋酸：水=4：1：5）
溴粉兰：0.1%
四、实验步骤：
l. 贮液配制：
应注意：
（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放 l ～ 2 个月。
（2）过硫酸铵应当天配制。
（3）如有不溶物要过滤。
（4）显色液用前再混和。
（5）电极缓冲液用时稀释 10 倍。
2. 安装夹心式垂直板电泳槽
3.配胶：采用不连续系统
1）分离胶的制备（10ml，12%）：
4. 样品的处理及点样：
将提取的蛋白质（或标准蛋白）中加入等体积的上样缓冲液，混匀，置于沸水浴中加热5min，冷却后经10000rpm离心15min，取上清液点样。
5.电泳：
将制好胶的电泳槽放入底座中，加入电极缓冲液，上层液中加入溴粉兰指示剂，连接好电泳仪，开始电泳。
浓缩胶恒压75V，分离胶恒压120V，电泳时间约90min。
6.染色和脱色：
当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘 1 cm 时，电泳结束。
将胶剥离，放入容器中，用蒸馏水清洗2-3遍，倒入染色液染色2-3h或静置过夜。
染色结束后，用蒸馏水冲洗胶2-3遍，以清除多余的染料，倒入脱色液，置于脱色摇床上脱色，中间换1-2次脱色液，直至背景色完全脱掉。
附：样品的制备
称取植物材料 1 g ，放入研钵内，加 pH8.0 提取液 1 mL ，于冷水浴中研成匀浆，然后以 2 mL 提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000 rpm 离心 10min
注意事项 :
制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
五、实验结果
logMV=K-bX
由图线得：K= 8.44 b=4.51
六、反思总结
本次实验操作十分复杂并且耗时长，所以我们就以理论方式来完成这次实验。
通过学习理论知识我知道这次实验有一定的危险性，所以在做实验时就要需要注意人身安全。