从JAK2_STAT3信号通路探_省略_脊液对神经干细胞增殖与分化的影响_王凯

75%的乙醇中2-3min，无菌条件下剥取胎鼠大脑皮质，眼科剪 将组织剪碎。离心管中吹打、静置，取上清，如此反复3-4次。 将收集的所有上清液过200目滤网，1 000r/min离心5min。弃上 清液，加入完全培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下进行 原代培养，待长成NSCs球后进行消化传代。检测NSCs标志物 Nestin，见图1。
Key words: JAK2/STAT3 signaling pathway; Yishen Huazhuo Decoction; Cerebrospinal fluid; Neural stem cells;
Differentiation
Funding: National Natural Science Foundation of China (No.81202654)
Abstract: Objective: To explore the effects of cerebrospinal fluid containing Yishen Huazhuo Decoction (YSHZD) on
the proliferation and differentiation of neural stem cells (NSCs) via JAK2/STAT3 signaling pathway. Methods: The NSCs were extracted from 14.5 d pregnant Kunming mice, which were cultured in vitro were divided into the blank group, normal group, AG490 (JAK/STAT inhibitor) group and the YSHZD group. The blank group was the basic medium, the others were given 10% normal cerebrospinal fluid, AG490, and cerebrospinal fluid containing YSHZD respectively. The proliferation of NSCs was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8), the differentiation of NSCs was detected by immunofluorescence staining, the protein expression levels of Tubulin, GFAP and others related to JAK2/STAT3 signaling pathway were detected by Western blot. Results: CCK-8 result showed: Compared with the control group, the optical density (OD) of YSHZD group significantly increased at 24h and 48h (P<0.05), but there were no significantly difference between them at 72h. Immunofluorescence and Western blot showed that compared with the control group, the number of Tubulin-positive cells and the protein expression of Tubulin in QNYZD group significantly increased (P<0.05), while the number of GFAP-positive cells and the expression of GFAP reduced (P<0.05). Moreover, YSHZD reduced the protein expressions of STAT3, p-STAT3 and Smad1 (P<0.05). Conclusion: The cerebrospinal fluid containing Yishen Huazhuo Decoction could promote NSCs proliferation, regulate the differentiation of NSCs into neurons, and inhibit the differentiation of astrocytes, which might be related to the inhibition of JAK2/STAT3 signaling pathway.
通讯作者：张玉莲，天津市河北区真理道816号天津中医药大学第二附属医院，邮编：300150，电话：，E-mail：zhyl220@
• 1880 •
阿尔茨海默病（Alzheimer,s disease，AD）是一种以记忆力 减退为主要症状的中枢神经系统退行性疾病。研究发现，神经 元丢失是神经退行性病变的最终致病因素[1]，而大脑神经元主 要来源于神经干细胞（neural stem cell，NSCs）的分化，因此如 何激 活内源性 N S C s，并 适当调 控 其分 化方向，弥 补 神经 元 不 足，已成为减缓AD的有效治疗方法[2]。
当代医药论丛杂志
• 1879 •
·论著·
从JAK2/STAT3信号通路探讨益肾化浊方含药
脑脊液对神经干细胞增殖与分化的影响
王凯1，张琳琳2，宋宛珊1，周震2，徐家淳1，张玉莲2
（1天津中医药大学，天津 300193；2天津中医药大学第二附属医院，天津 300150）
摘要：目的：观察益肾化浊方含药脑脊液对神经干细胞（NSCs）增殖与分化的影响，并探讨其相关作用机 制。方法：从孕14.5d的昆明小鼠分离培养NSCs，分为空白组，正常组，AG490（JAK/STAT通路抑制剂）组和益 肾化浊方组。空白组为培养基本底，其余各组分别予10%的正常脑脊液、AG490和益肾化浊方含药脑脊液。采 用CCK-8检测各组NSCs的增殖率，免疫荧光检测其分化情况，Western blot检测Tubulin、GFAP及JAK2/STAT3通路 相关蛋白的表达情况。结果：CCK-8检测结果显示：与空白组比较，益肾化浊方组在24h和48h时OD值显著升高 （P<0.05），而72h时升高无统计学差异。免疫荧光和Western blot检测结果显示：与空白组比较，益肾化浊方组 能显著增加Tubulin阳性细胞率及Tubulin蛋白的表达（P<0.05），显著降低GFAP阳性细胞率和GFAP蛋白的表达 （P<0.05），且益肾化浊方组还可显著下调JAK2/STAT3通路中STAT3、p-STAT3、Smad1蛋白的表达（P<0.05）。 结论：益肾化浊方含药脑脊液可促进NSCs的适度增殖，调控NSCs向神经元分化，抑制其向星形胶质细胞分化，该 作用可能与抑制JAK2/STAT3通路相关。
WANG Kai1, ZHANG Lin-lin2, SONG Wan-shan1, ZHOU Zhen2, XU Jia-chun1, ZHANG Yu-lian2
( 1Tianjin University of Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM, Tianjin 300150, China )
益肾化浊方是在张伯礼院士主老年期血管性痴呆的研究”基础上组方 形成。前期研究发现，益肾化浊方及组分具有改善认知功能， 调控神经-内分泌-免疫网络，保护NSCs等作用[3-5]。文献报道 表明，淫羊藿、女贞子和石菖蒲等中药的小分子有效成分具有 透过血脑屏障的可能性[6]。本实验拟借助脑脊液药理学方法， 观察益肾化浊方对NSCs增殖与分化的影响，并对可能的作用机 制进行探讨，以期为AD的防治机制提供进一步的实验依据。
关键词：JAK2/STAT3通路；益肾化浊方；脑脊液；神经干细胞；分化 基金资助：国家自然科学基金项目（No.81202654）
Effects of cerebrospinal fluid containing Yishen Huazhuo Decoction on proliferation and differentiation of neural stem cells via JNK2/STAT3 signaling pathway
3. 分组及给药 采用Accttuase酶消化计数后的NSCs分 为4组，即空白组（培养基本底），正常组（10%正常脑脊液）， AG490组（10%AG490），益肾化浊方组（10%益肾化浊方含药脑 脊液）。按1×105个/mL（每孔100μL）接种于96孔板，4×105个/孔 （每孔2mL）接种于6孔板，培养24h后用于各项检测。
材料 1. 动物 SPF级孕14.5d昆明小鼠，购自上海斯莱克实验动 物有限责任公司，许可证号：SCXK2007-0005。大耳白家兔，体 质量（2.0+0.2）kg，SPF级，由中国医学科学院生物医学工程研 究所惠赠。 2. 药物与试剂 益肾化浊方（淫羊藿10g，补骨脂10g，女贞 子10g，石菖蒲12g，炙黄芪10g，川芎10g）由天津中医药大学制 剂中心制备，煎煮浓缩后生药浓度为0.62g/mL，4℃保存备用。 参照《药理实验方法学》[7]换算后，家兔灌胃剂量为3.4g/kg。 细胞培养基与Wester n blot 相关试 剂盒[8]，Anti- Nestin （abcam公司，批号：ab93157），Anti-glial fibrillary acid protein （GFA P，abcam公司，批号：ab 68 428），Anti-Tubulin beta Ⅲisoform（Millipore公司，批号：MAB1637），β-actin（CST公司， 批号：4 9 7 0 s），H R P 标 记山羊抗 小鼠 I g G（H+L）（M R Bio t e ch 公司，批号：M R- M10 0）、H R P 标 记山羊抗 兔 I g G（H+L） （MRBiotech公司，批号：MR-R100），CCK-8细胞增殖及毒性检 测试剂盒（碧云天公司，批号：C0038），免疫荧光试剂盒（碧云 天公司，批号：P0098、P0102-P0106），Alexa Fluor®594抗兔IgG （H+L）、Alexa Fluor®488抗小鼠 IgG（H+L）（Jackson Immuno Research Laboratories公司），AG-490（Invivo Gen公司，批号： tlrl-ag4）等。 3. 仪器 超净工作台（美国，Thermo Fisher Scientific公 司），CO2恒温培养箱（美国，Themro Scientific Forma公司），荧 光显微镜（日本，Nikon），Biotek aQuant型全自动酶标仪（中国， 上海坤肯生物化工有限公司），-80℃低温冰箱（日本，Sanyo公 司），小型离心机（德国Eppendorf公司）等。 方法 1. NSCs培养 NSCs提取与培养：将孕鼠断颈处死，浸泡在