胰岛素的基因结构
胰岛素的基因结构
该基因先转录 成mRNA， 然 后按此 mRNA 为模板， 翻译
合成整个肽链 — 前胰岛素原
它是胰岛素的前 体，人的胰岛素 原由86个氨基酸 组成。在谷胱甘 肽—胰岛素转氢 酶的作用下，被 分解成A和B两条 链．
胰岛素的基因结构
一、胰岛素基因组DNA结构 二、胰岛素基因的多态性 三、糖尿病患者胰岛素基因的异常 四、基因治疗的可能途径
一、胰岛素基因组DNA结构
人胰岛素基因组 DNA 是单一拷贝型的 基因，位于第11号 染色体的短臂上 （11P15）
在基因的转录与翻译区有三个外显子和二个内含子，除第一个外显 子实际上并不翻译多肽以外，第二及第三外显子都是胰岛素的主要肽链 编码区。外显子二中是前边的信号肽，B链肽及部分C肽的编码区，外 显子三包括有另一部分C肽与A肽的编码，另外还有一部分为不翻译区。
多态性
2.A肽 与B肽 中核苷 酸的不
同
不同动物的胰岛素都是由一个A肽和 一个B肽组成，但其一级结构有不同 程度的差异。
人与几种哺乳动物的胰岛素分子的氨基酸差异
胰岛素来源
氨基酸排列顺序的差异
A8
A9
A10
B30
人 猪 牛 狗 山羊
Thr （苏 ） Thr （苏 ） Ala （丙 ） Thr （苏 ） Ala （丙 ）
四、基因治疗的途径
1．胰岛素原基因的转移和表达
2.HLA一l型抗原表达的抑制
3．胰岛素受体基因因的转移
Ser（丝 ） Ser（丝 ） Ser（丝 ） Ser（丝 ） Gly（甘 ）
【高中生物】“胰岛素”知识梳理
【高中生物】“胰岛素”知识梳理一、知识体系二、知识解析（一）胰岛素的结构：胰岛素是由51个氨基酸组成的蛋白质，含有2条肽链，氨基酸的连接方式是脱水缩合，这其间要失去49分子的水，形成49个肽键；胰岛素分子中至少含有2个－COOH和2个－NH2；若一个氨基酸的平均分子量是128，那么胰岛素的分子量大约是5646。
（二）胰岛素的合成及分泌：1．胰岛素是分泌蛋白，其合成是在胰岛B细胞中的核糖体上进行的，与其合成及分泌相关的细胞器有核糖体、内质网、高尔基体、线粒体（注意掌握各细胞器所起的作用）；其合成及分泌的途径是：核糖体→内质网→高尔基体→细胞膜→胞外；该物质出入细胞的方式为外排作用。
2．控制胰岛素合成的基因是真核细胞基因，其结构包括编码区和非编码区，非编码区对编码区的表达起调控作用，编码区包括内含子和外显子。
3．基因控制胰岛素的合成包括转录和翻译过程。
在控制胰岛素合成的基因中，至少含有306个脱氧核苷酸；该过程中约需要51个tRNA，mRNA中大约有153个核糖核苷酸、51个密码子。
4．人体内合成胰岛素所需要的原料－氨基酸的来源途径有：肠道吸收、自身蛋白质的分解、氨基转换作用（其它物质的转变）等。
（三）胰岛素的作用及异常：1．胰岛素的生理作用是：调节糖类代谢，降低血糖含量，促进血糖合成为糖元，抑制非糖物质转化为葡萄糖，从而使血糖含量降低。
在血糖平衡调节中，胰岛素的分泌会抑制胰高血糖素的分泌，这两种激素间的关系表现为拮抗作用；当人饥饿时，胰岛素的分泌量会减少。
2．如果一个人持续性高血糖和糖尿，可能的原因是肾功能发生障碍或患糖尿病。
如果是前者，原因是由于肾小管不能有效地将葡萄糖重吸收回血液，他的尿中就会出现葡萄糖，该吸收方式为主动运输；如果是后者，其病因是胰岛B细胞受损，导致胰岛素分泌量过少，从而促进肝糖元的分解，促进非糖物质的转化，使葡萄糖进入组织细胞和在细胞内氧化利用发生障碍，从而导致血糖含量高于160～180mg／dL。
基因工程获取胰岛素的主要步骤
基因工程获取胰岛素的主要步骤胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的蛋白质激素，对调节血糖水平起着重要作用。
胰岛素的分子结构由两个多肽链组成，分别为A链和B链，通过二硫键连接在一起。
A链含有21个氨基酸残基，B链含有30个氨基酸残基。
胰岛素的结构决定了它的生物活性和稳定性。
基因工程是一种利用DNA技术对目标基因进行修饰和重组的方法，可以大规模生产胰岛素。
以下是基因工程获取胰岛素的主要步骤：1. 基因克隆：首先需要从人体或其他来源中获得胰岛素基因的DNA 序列，然后使用PCR技术扩增所需基因片段。
扩增后的基因片段将被插入到一个载体中，如质粒或病毒。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。
2. 转化宿主细胞：将质粒或病毒载体导入宿主细胞中，使其拥有胰岛素基因。
最常用的宿主细胞是大肠杆菌，因为大肠杆菌具有较高的转化效率和易于培养的特点。
3. 表达胰岛素基因：在宿主细胞中，胰岛素基因将被转录成mRNA，随后翻译成胰岛素蛋白。
为了提高胰岛素的表达水平，可以使用启动子和增强子等调控元件来增强基因的表达。
4. 纯化与结构修饰：经过表达后，胰岛素蛋白可以通过离心、层析和过滤等手段进行纯化。
纯化后的胰岛素蛋白需要进行结构修饰，如对A链和B链进行二硫键的形成，以及其他可能的糖基化修饰。
5. 活性检测与质量控制：获取的胰岛素蛋白需要进行活性检测，以确保其具有正常的生物活性。
同时，还需要进行质量控制，如测定蛋白的纯度、含量和杂质的检测。
6. 大规模生产与制剂开发：经过活性检测和质量控制后，胰岛素蛋白可以进行大规模生产。
生产过程中需要考虑生产工艺、设备的选择和合理的工艺优化。
同时，还需要开发适合临床使用的胰岛素制剂，如注射剂、胰岛素泵等。
通过基因工程获取胰岛素的方法使得胰岛素的大规模生产成为可能，不仅能够满足临床需求，还能够提高胰岛素的纯度和质量稳定性。
基因工程技术的不断发展也使得胰岛素的生产成本逐渐降低，更加便于患者的使用。
人胰岛素a、b链基因
人胰岛素a、b链基因
人胰岛素是一种由两条多肽链组成的激素，分别为A链和B链。
这两条链通过二硫键相互连接，形成了胰岛素的空间结构。
胰岛素是一种重要的调节血糖的激素，在胰岛细胞中合成，并在体内通过自身的受体发挥作用。
人胰岛素A链基因位于人类染色体11号，包含有3个外显子和
2个内含子。
A链的编码区为第2个外显子和第3个外显子，第1个
外显子和第一个内含子则编码A链的信号肽和5'非编码区。
人类胰
岛素B链基因位于人类染色体2号，包含有2个外显子和1个内含子。
B链的编码区位于第2个外显子，第1个外显子则编码B链的信号肽和5'非编码区。
因为A链和B链都是由基因编码的，所以人的DNA
序列中会包含A链和B链的编码序列。
这些序列会在转录和翻译过程中转化为多肽链，最终形成胰岛素分子。
胰岛素的合成受到多种因素的调控。
例如，胰岛素的合成和释放受到血糖水平的影响，当血糖水平升高时，胰岛素的合成和释放也会增加。
此外，许多激素和神经递质也可以影响胰岛素的合成和释放。
当胰岛素分泌过多或过少时，都会对人体健康产生负面影响。
例如，胰岛素分泌不足会导致糖尿病的发生，而过多的胰岛素分泌则可能导致低血糖等问题。
总之，人胰岛素A链和B链基因编码了两条多肽链，这些链通过二硫键相互连接形成胰岛素分子。
胰岛素的合成和释放受到多种因素的调控，而胰岛素分泌不足或分泌过多都会对人体健康产生负面影响。
因此，了解胰岛素的合成和调控机制，可以帮助我们更好地保护自己的健康。
胰岛素基因工程
性内切酶将目的基因从原DNA中分离。
重播
二、提取质粒
• 使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的
细胞质中提取质粒，质粒为环状。
质粒——基因的运载工具
• 质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够
进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器 （主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以 外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。（部分为RNA） 现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放 线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分 子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多 细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状 DNA分子
胰岛素的分类
• 动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相 同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不 同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体 • 半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换 成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素 • 生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高 纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生 物活性与人体本身的胰岛素完全相同
胰岛细胞根据其分泌激素的功能分为以下几种： ①B细胞(β细胞)，约占胰岛细胞的60%～80%，分泌胰岛素，胰岛素 可以降低血糖。 ②A细胞(α细胞)，约占胰岛细胞的24%～40%，分泌胰升糖素，胰升 糖素作用同胰岛素相反，可增高血糖。 ③D细胞，约占胰岛细胞总数的6%～15%，分泌生长激素抑制激素。
胰岛素立体结构
胰岛素的性质
• 〖化学本质〗蛋白质
• 〖分子式〗C257H383N65O77S6 • 〖分子量〗5807.69 • 〖性状〗白色或类白色的结晶粉末 • 〖熔点〗233℃（分解）
• 〖比旋度〗-64°±8°(C=2,0.003mol/L NaOH)
人胰岛素基因
人胰岛素基因胰岛素是一种由胰腺分泌的激素，它在调节血糖水平方面起着重要作用。
胰岛素基因是编码胰岛素蛋白的基因，它位于人类染色体11号上。
胰岛素基因的结构由多个外显子和内含子组成。
外显子是编码蛋白质的片段，而内含子则是在基因表达过程中被剪切掉的非编码片段。
胰岛素基因的外显子经过转录和剪接后形成成熟的胰岛素mRNA，再通过翻译过程生成胰岛素蛋白。
胰岛素基因的编码区域包含A链和B链两个子基因，它们分别编码胰岛素蛋白的两个多肽链。
A链和B链通过二硫键连接在一起，形成成熟的胰岛素蛋白。
胰岛素蛋白的结构决定了它的生物活性和稳定性。
胰岛素基因的突变会影响胰岛素蛋白的结构和功能。
一些突变会导致胰岛素蛋白的稳定性降低，从而减少胰岛素的分泌量。
这种情况下，人体往往无法维持正常的血糖水平，容易发生糖尿病。
研究人员发现，胰岛素基因的突变与糖尿病的发病风险密切相关。
一些突变会增加糖尿病的患病风险，而其他突变则可能减少患病风险。
通过研究胰岛素基因的突变，科学家们希望能够更好地理解糖尿病的发病机制，并寻找新的治疗方法。
近年来，基因编辑技术的发展为研究胰岛素基因提供了新的工具。
科学家们可以利用CRISPR-Cas9系统精确地修改胰岛素基因，进一步研究其在胰岛素分泌和血糖调节中的功能。
这种技术的应用有望为糖尿病的治疗提供新的思路和方法。
胰岛素基因的研究还涉及到药物研发领域。
通过深入了解胰岛素基因的结构和功能，科学家们可以设计针对胰岛素的药物，以更好地调节血糖水平。
这些药物可能具有更高的效力和更低的副作用，为糖尿病患者提供更好的治疗选择。
胰岛素基因对于人体的血糖调节至关重要。
通过研究胰岛素基因，我们可以更好地理解糖尿病的发病机制，并为糖尿病的治疗和药物研发提供新的思路和方法。
随着基因编辑技术的不断发展，胰岛素基因的研究将有望取得更大的突破，为人类健康做出更多贡献。
基因重组技术生产胰岛素
基因重组技术生产胰岛素介绍胰岛素是一种由胰岛细胞分泌的蛋白质激素，它在调节血糖水平中起着重要的作用。
胰岛素的生产曾经面临着供应不足的挑战，然而通过基因重组技术，科学家们成功地生产了大量的胰岛素，从而满足了临床需求。
本文将介绍基因重组技术生产胰岛素的过程和意义。
胰岛素的生产过程对基因重组技术生产胰岛素的理解首先需要了解传统的生产过程。
传统方法中，胰岛素是从猪和牛的胰腺中提取得到的。
这种方法存在着供应不稳定、产品纯度不高以及与人体胰岛素之间存在差异等问题。
而基因重组技术生产胰岛素则是通过将人类胰岛素基因导入到大肠杆菌等微生物中进行生产。
下面是具体的步骤：1.获得胰岛素基因：从人类胰岛细胞中获得胰岛素基因的DNA序列。
2.构建基因重组载体：将胰岛素基因插入到合适的基因重组载体中，如质粒或病毒。
3.转导宿主细胞：将构建好的基因重组载体导入到宿主细胞中，如大肠杆菌。
4.培养和表达：在适当的培养条件下，促使宿主细胞进行复制和转录，从而表达胰岛素基因并产生胰岛素蛋白质。
5.纯化和提取：通过分离和纯化的步骤，得到纯度较高的胰岛素。
基因重组技术的意义基因重组技术生产胰岛素具有许多优势和意义：1.提供稳定供应：通过基因重组技术生产的胰岛素能够提供更加稳定的供应，解决了传统生产方法中供应不足的问题。
2.提高纯度：基因重组技术可以实现胰岛素的高纯度生产，减少了杂质的存在，从而提高了产品质量。
3.与人体胰岛素相似：基因重组技术生产的胰岛素与人体胰岛素在结构和功能上更为接近，减少了在使用过程中出现的副作用和风险。
4.降低成本：基因重组技术可以实现胰岛素的大规模生产，从而降低了生产成本和售价，使胰岛素更加可负担。
应用领域和前景基因重组技术生产的胰岛素在医药领域有着广泛的应用。
主要包括：1.糖尿病治疗：胰岛素是糖尿病治疗中必不可少的药物，通过基因重组技术生产的胰岛素可以满足糖尿病患者的需求。
2.研究工具：基因重组技术生产的胰岛素可以作为研究工具，用于研究胰岛素的生物学功能以及与糖尿病等疾病的关系。
胰岛素
2、生产工艺 、 （1）工艺流程： ）工艺流程：
（2）工艺过程及控制要点 ）
3、质量检验 （1）原料质量控制 ① 不同种类和年龄的动物，胰脏中胰岛素的含量有差别。 ② 采摘胰岛素要保持腺体组织的完整；离体后要立即深冻，先在-30度 以下急冻后转入-20度保存备用。 （2）生产过程质量控制 浓缩工序的条件对胰岛素收率影响很大，尽量缩短浓缩液受热时间 （3）产品性状 （4）产品纯度要求 ① 常规的结晶胰岛素纯度不够高，需进一 步层析纯化。采用超细Sephadex G-50 凝胶过滤。 ② 美、英药典主要控制两个指标，即相对 分子质量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素 原。国外一般要求胰岛素原核脱酰胺胰 岛素含量在10*10-6，1000*10-6以下。
（四）生长素 ① 人生长素对人肝细胞有增加核分裂作用，对人红 细胞有抑制葡萄糖利用的作用，对人白细胞或淋 巴细胞有促进蛋白质和核酸合成的作用，有促进 骨骼，肌肉，结缔组织和内脏增长的作用。 ② 动物生长素能促进家禽生长，增加产量，在畜牧 业领域有很好的应用前景。 ③ 不同种属的哺乳动物的生长激素之间有明显的种 属特异性，只有灵长类的生长素对人有活性。 ④ 目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表 达成功，产品已投向市场。
（3）IL-2的表达和纯化 ① 利用大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞已经成功 表达了重组人IL-2。 ② 工程菌经发酵培养和诱导表达，收集裂解菌体， 离心沉淀收集包涵体。包涵体主要含由IL-2单体 分子聚合而成的多聚体，不溶于水，且其中的 重组IL-2无活性。 ③ 重组IL-2可用6 mol/L盐酸胍或8 mol/L尿素使包 涵体变性解聚成单分子，再利用空气氧化或用 1.5 mol/L还原型谷胱甘肽复性。恢复IL-2二硫键 和正常分子结构，获得生物活性。
胰岛素的生物合成
胰岛素的生物合成
注意：
转录的产物是胰岛素前体的mRNA，而不是胰岛素mRNA。胰 岛素前体 mRNA经过复杂的剪切和翻译过程，形成前胰岛素原 (preproinsulin)，然后再经过修饰，最终生成有生物活性的激素， 即胰岛素。这种先合成前激素再分解成为激素的方式，也是在胰岛素 首先发现的，后来证明几乎所有激素的生物合成均通过这种方式。
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胰岛素的生物合成——翻译
起始：
1.核糖体大小亚基分离。
2.Met-tRNAiMet 与核糖体小亚基结合。
3.mRNA在核糖体小亚基就位。 4.核糖体大亚基结合。（形成多聚核糖体）。
延长：
1.进位：翻译起始复合物形成后，核糖体P位结合Met-tRNAi Met
A位留空且对应于mRNA中的下一组三联体密码，进入A 位的氨基酰-tRNA即由该密码子决定。经过一次核糖体 循环后，核糖体P位将结合肽酰-tRNA,同样是A位留空。 2.成肽：在转肽酶的催化下，核糖体P位上起始氨基酰-tRNA的 甲硫氨酰基或肽酰-tRNA的肽酰基转移到A位并与A位上 的氨基酰-tRNA 的α-氨基结合形成肽键的过程。 3.转位：在转位酶催化下，核糖体向mRNA的3'-端移动一个密 码子的距离，使mRNA上的下一个密码子进入核糖体的 A位，而占据A位的肽酰-tRNA移入P位的过程。
胰岛素的生物合成——加工修饰
C肽
胰岛素的生物合成——调节
一.胰岛素合成的短期调节。
胰岛素生物合成受细胞外葡萄糖浓度波动的快速调节。研究
证明，葡萄糖优先刺激胰岛素原合成，对控制胰岛素原合成速度的转
胰岛素制备
胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
胰岛素的基因结构
Ser（丝 ） Ser（丝 ） Ser（丝 ） Ser（丝 ） Gly（甘 ）
Ile（异亮 ） Ile（异亮 ） Val（缬 ） Ile（异亮 ） Val（缬 ）
Thr （苏 ） Ala （丙 ） Ala （丙 ） Ala （丙 ） Ala （丙 ）
马 象 抹香鲸 兔
Ala （丙 ） Thr （苏 ） Thr （苏 ） Thr （苏 ）
Number of Tandem Repeats，
插入片段的核昔V酸NT序R )列又称分小析卫表星D明NA，不论 长短，都含一类高度(DM保NinA守i小sa的序tel列l1ite，4D至为N11A0)5到，个几是核百一核种昔苷重酸复， 酸的顺序，即ACAG拷G贝G数G1T0G一T1G00G0不G等G。；其重 复出现的频率很高。
四、基因治疗的途径
1．胰岛素原基因的转移和表达
2.HLA一l型抗原表达的抑制
3．胰岛素受体基因因的转移
三、糖尿病患者胰岛素基因的异常
5’末端插入顺序的异常
Ⅰ型糖尿病患者胰岛素基因结构的分析证 明，其插入顺序出现的机率远大于非I型糖尿 病糖尿病患者。认为胰岛素基因5'端插入顺序 的出现是I型糖尿病患者的分子病理基础。
非编码区的突变
前胰岛素原分子中某些氨基酸的改 变，可以导致胰岛素原分解及其结构异 常，如C肽与A肽之间，C肽与B肽之间 某些氨基酸的突变影响胰岛素原分解为 A肽、B肽的速率。
胰岛素的基因结构
一、胰岛素基因组DNA结构 二、胰岛素基因的多态性 三、糖尿病患者胰岛素基因的异常 四、基因治疗的可能途径
一、胰岛素基因组DNA结构
人胰岛素基因组 DNA 是单一拷贝型的 基因，位于第11号 染色体的短臂上 （11P15）
基因工程制备胰岛素2
2、用基因工程 E．coli 发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成 hI。
E． coli 系统表达量高，但缺点是不利于表达 hI 这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白 形式将 hPI 连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活 性的 hi； 3 、通过基因工程酵母菌发酵生产 hPI ，经后加工形成 hI 。酵母系统下游后加工比细菌表 达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少 (1 ～ 50 mg ／ L) ，产量低。 因此，虽然 rhI 投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的 表达策略 I2 J ，尤其是对
中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基 因从原 DNA 中分离。主要有如下 4 种方法： （ 1 ）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。 至于如何筛选，用 DNA 分子杂交，即 DNA 探针 （ 2 ）人工合成法：根据转录蛋白或者 mRNA 推导出基因序列，然后人（ 4 ） PCR 扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作 …… 2 、提取质粒：使用细胞工程 , 培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为 环状。主要有如下 2 种方法： （ 1 ）碱裂解法：此方法适用于小量质粒 DNA 的提取，提取的质粒 DNA 可直接用于 酶切、
E ． CO 一尻表达系统的研究更是越来越深入，用 E ． coli 系统表达 hPI 的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂 的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。 本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量， 简化 下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程 E ． coli 发酵表 达 (His)6 一 Arg — Arg 一人胰岛素原 [(His)6 一 Arg — Arg — human proinsulin ， PPh — PI] ，后加工 成 hI 的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1 、提取目的基因：既从人的 DNA
胰岛素的基因结构
胰岛素的基因结构
胰岛素是胰岛尽细胞分泌的与糖代谢有关的一种激素．最初表达的是一种比胰岛素分子大的单链多肽，称为胰岛素原，它是胰岛素的前体，人的胰岛素原由86个氨基酸组成。
在谷胧甘肽一胰岛素转氢酶的作用下，被分解成A和B两条链．，也可以把胰岛素原看作是由一条连接肽（C肽）的一端通过精一赖二肽与胰岛素A链N一末端的
甘氨酸相连，另一端通过精一精二肽与B链C一链一末端的苏氨酸相连。
胰岛素进入血液以后，被分解成A链、B链、C链以及上述四种氨基酸。
一、基因组DNA结构
胰岛素基因组DNA是单一拷贝型的基因，位于第11号染色体的短臂上（11P15）。
在基因的转录与翻译区有三个外显子和二个内含子，除第一个外显子实际上并不翻译多肽以外，第二及第三外显子都是胰岛素的主要肽链编码区。
外显子l中是前边的信号肽，B链肽及部分C肽的编码区，二，三外显子包括有另一部分C肽与A肽的编码，另外
还有一部分为不翻译区。
两个内含子中一个是在外显子I与l之间，另一个则是在C肽中间。
胰岛素有典型的真核基因转录启动子顺序，如TATAAAG处于转录起始部位上游约22一24bp处。
也有典型的转录终止信号及多聚腺昔酸的信号AATAAA。
1985年已发现在胰岛素基因5’末端上游约25Obp左右，有
一组织活性特异区，也叫组织特异性增强子，这部分的核昔酸序
列，只有在胰岛beta细胞的某一特异性蛋白因子的作用下，才能发挥
其增强序列，而其它组织中无此因子，因而胰岛素基因在许多组
织中都可以表达，只是表达水平不高，只有在胰岛的beta细胞中，此
基因才能有效表达。
基因工程制胰岛素(生工版)
2020/3/20
16
一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA （1）试剂准备：
① 3M醋酸钠（pH5.2）； ② 0.1M NaOH； ③ 上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH7.6）,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制 时可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的 母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒， 冷却至65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓 度为0.1%； ④ 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.6），1mM EDTA （pH8.0），0.05%SDS； ⑤ 无水乙醇、70%乙醇； ⑥ DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）
2020/3/20
13
一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程
（1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静置5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的 组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆， 室温静置5min。
③ 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动， 若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
⑤ 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg poly（A+）RNA， 约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
2020/3/20
23一、Βιβλιοθήκη 取外源目的基因片段4．得双链DNA
大肠杆菌产生胰岛素的转基因技术
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基因工程生产胰岛素的过程
基因工程生产胰岛素的过程
胰岛素是一种重要的激素，它能够调节人体内的血糖水平。
对于糖尿病患者来说，胰岛素的缺乏会导致血糖水平升高，从而引发一系列的健康问题。
因此，胰岛素的生产对于糖尿病患者来说至关重要。
而基因工程技术则是胰岛素生产的重要手段之一。
基因工程生产胰岛素的过程主要分为以下几个步骤：
1. 选择合适的宿主细胞
在基因工程生产胰岛素的过程中，需要选择一种合适的宿主细胞来承载胰岛素基因。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母菌等。
2. 克隆胰岛素基因
胰岛素基因是由两个多肽链组成的，分别是A链和B链。
在基因工程生产胰岛素的过程中，需要将A链和B链的基因分别克隆到载体上。
3. 将胰岛素基因导入宿主细胞
将克隆好的胰岛素基因导入宿主细胞中，使其能够表达出胰岛素蛋白。
4. 培养宿主细胞
将导入胰岛素基因的宿主细胞进行培养，使其能够大量生产胰岛素蛋白。
5. 纯化胰岛素蛋白
将培养好的宿主细胞进行破碎，然后通过一系列的纯化步骤，将胰岛素蛋白从其他蛋白质中分离出来。
6. 包装和贮存
将纯化好的胰岛素蛋白进行包装和贮存，以便后续的使用。
基因工程生产胰岛素的过程虽然复杂，但是其具有高效、可控、可重复等优点，能够大大提高胰岛素的生产效率和质量。
随着基因工程技术的不断发展，相信胰岛素的生产将会更加便捷和高效。
简述合成胰岛素的过程
简述合成胰岛素的过程胰岛素是一种重要的激素，用于调节血糖水平。
合成胰岛素的过程是通过基因工程技术，将胰岛素基因导入到细菌或其他生物体中，使其能够大量生产胰岛素。
下面将以简述的方式介绍合成胰岛素的过程。
第一步：基因克隆需要从人体胰腺或其他来源获得胰岛素基因。
胰岛素基因是一个由A、B、C和D四个多肽链组成的复杂基因。
利用酶切和连接技术，将胰岛素基因插入到载体DNA上。
载体DNA是一个能够在细菌中复制的DNA分子，常用的载体有质粒等。
第二步：转化细菌将带有胰岛素基因的载体DNA导入到细菌中，通过加热冷却或电击等方法，使细菌能够吸收和稳定胰岛素基因。
这样，细菌就成为了胰岛素基因的宿主，可以通过复制和传递胰岛素基因。
第三步：培养细菌将转化后的细菌培养在含有适当营养物质的培养基中。
培养基中含有大量的葡萄糖等碳源，细菌可以利用葡萄糖产生能量和合成胰岛素。
第四步：表达胰岛素在培养的过程中，细菌会合成和分泌胰岛素。
胰岛素是一种多肽链，需要经过一系列的加工和折叠才能形成完整的胰岛素分子。
第五步：纯化胰岛素将培养液中的细菌和其他杂质进行分离和纯化，得到纯净的胰岛素。
纯化的过程通常包括细菌的离心、蛋白质的沉淀和层析等步骤。
第六步：结晶和制剂经过纯化的胰岛素可以通过结晶等方法得到固体形式，并进行进一步的制剂。
制剂的过程包括胰岛素的配方、过滤、灭菌和包装等步骤。
合成胰岛素的过程中，需要进行多个步骤才能得到纯净的胰岛素。
这些步骤包括基因克隆、转化细菌、培养细菌、表达胰岛素、纯化胰岛素以及结晶和制剂等过程。
通过这些步骤，可以大量生产胰岛素，用于临床治疗糖尿病等相关疾病。
大肠杆菌生产的人胰岛素的生物活性
大肠杆菌生产的人胰岛素的生物活性
肠杆菌是原核生物，只有核糖体，只能形成多肽（肽链）。
而胰岛素是蛋白质，利用大肠杆菌等微生物表达生产胰岛素的过程中，表达产物常常形成包涵体，而不是分泌出来。
要通过变性和复性过程才能得到有活性的人胰岛素。
通过基因工程，将人胰岛素基因A、B链的人工合成基因分别组合到大肠杆菌的不同质粒上，然后再移至菌体内，这种重组质粒在大肠杆菌细胞内进行正常的复制和表达，从而使带有A、B链基因的工程菌株分别产生人胰岛素A、B链，然后再用人工的方法，在体外通过二硫键使这2条链连接成有活性的人胰岛素。
现在大都已经改为用酵母菌、昆虫培养细胞、或哺乳动物培养细胞等真核细胞作为表达载体，可以直接分泌胰岛素。
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三、糖尿病患者胰岛素基因的异常
5’末端插入顺序的异常
Ⅰ型糖尿病患者胰岛素基因结构的分析证明，其插入顺序出现的机率远大于非I型糖尿病 糖尿病患者。认为胰岛素基因5'端插入顺序的出现是I型糖尿病患者的分子病理基础。
非编码区的突变
前胰岛素原分子中某些氨基酸的改变，可以导致胰岛素原分解及其结构异常 ，如C肽与A肽之间，C肽与B肽之间某些氨基酸的突变影响胰岛素原分解为A肽 、B肽的速率。
多态性
不同动物的胰岛素都是由一个A肽和一个B肽组成，但其一 级结构有不同程度的差异。
2.A肽与B肽中核苷 酸的不同
人与几种哺乳动物的胰岛素分子的氨基酸差异
胰岛素来源
A8
氨基酸排列顺序的差异
A9
A10
B30
人பைடு நூலகம்
Thr （苏 ）
Ser（丝 ）
Ile（异亮 ）
Thr （苏 ）
猪
Thr （苏 ）
Ser（丝 ）
这类核苷酸的突变发现较多。其位置有些在内含子序列中
，也有的在基因两端的非翻译区，但都与胰岛素基因的表 达无关。
但1985年Shibasaki等报导，胰岛素基因的突变发生在C肽 与A肽的交界处，使交界处的一个氨基酸一精氨酸被碱性氨 基酸一组氨酸所取代，影响到胰岛素原分子中C肽的降解 ，因而出现了高胰岛素原血症。
胰岛素的基因结构
一、胰岛素基因组DNA结构 二、胰岛素基因的多态性 三、糖尿病患者胰岛素基因的异常 四、基因治疗的可能途径
一、胰岛素基因组DNA结构
人胰岛素基因组DNA 是单一拷贝型的
基因，位于第11号染色体的短臂 上（11P15）
在基因的转录与翻译区有三个外显子和二个内含子，除第一个外显 子实际上并不翻译多肽以外，第二及第三外显子都是胰岛素的主要肽链 编码区。外显子二中是前边的信号肽，B链肽及部分C肽的编码区，外 显子三包括有另一部分C肽与A肽的编码，另外还有一部分为不翻译区 。
插入片段的核昔酸序列分析表明，不论长短，都含一 类高度保守的14至15个核昔酸的顺序，即 ACAGGGGTGTGGGG；其重复出现的频率很高。
数目可变串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeats， VNTR )又称小卫星DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复 DNA小序列，为10到几百核苷酸 ，拷贝数10一1000不等。
Ile（异亮 ）
Ala （丙 ）
牛
Ala （丙 ）
Ser（丝 ） Val（缬 ） Ala （丙 ）
狗
Thr （苏 ）
Ser（丝 ）
Ile（异亮 ）
Ala （丙 ）
山羊
Ala （丙 ）
Gly（甘 ） Val（缬 ） Ala （丙 ）
马
Ala （丙 ）
Gly（甘 ） Val（缬 ） Ala （丙 ）
多态性 3．非编码区的突变
四、基因治疗的途径
1．胰岛素原基因的转移和表达 2.HLA一l型抗原表达的抑制 3．胰岛素受体基因因的转移
胰岛素由A、B两个肽链组成人胰岛素(Insulin
Human) A链有11种21个氨基酸， B链有15种30个氨基酸， 共16种51个氨基酸组成。
二、胰岛素基因的多态性
多态性
1. 5’端上游的插入顺序
胰岛素基因上游363bp处，有插入序列
插入顺序的长短，其变化范围很大，但据其长度可以分 成几类，短的小于600bp，中等的在1320bp左右最长的可 达1600一2200bp之间。中等长度的插入顺序较为少见，因 此也可将其分为600bp以下和1600bp以上两大类。
胰岛素有典型的真核基因转录启动子顺序，如TATAAAG处于转录起 始部位上游约22一24bp处。也有典型的转录终止信号及多聚腺苷酸的 信号AATAAA。
该基因先转录成mRNA， 然后按此 mRNA 为模板， 翻译合成整个肽链— 前 胰岛素原
它是胰岛素的前体，人的胰岛素原由86个 氨基酸组成。在谷胱甘肽—胰岛素转氢酶 的作用下，被分解成A和B两条链．