基因工程制胰岛素(生工版)
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2015/9/30 27
一、获取外源目的基因片段
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
4.2.2模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结 合；
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一、获取外源目的基因片段
2
基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
化学合成 A链和B链
的编码序
列
2015/9/30
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
表达产
物的后
期处理 路线：
2015/9/30
4
基因工程制胰岛素三种方法
二、人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
2015/9/30
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基因工程制胰岛素三种方法
2015/9/30
16
一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA （1）试剂准备： ① 3M醋酸钠（pH5.2）； ② 0.1M NaOH； ③ 上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH7.6）,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制时可先配制 Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压 消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至 65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%； ④ 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.6），1mM EDTA （pH8.0），0.05%SDS； ⑤ 无水乙醇、70%乙醇； ⑥ DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程 （1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静臵5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组 织均可）臵1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室 温静臵5min。 （2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静臵2min。 （3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。 （4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静臵 10min。 （5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。 （6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min， 弃上清液。 （7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。
1．选择实验材料 2．提取RNA，分离RNA 3．逆转录mRNA,得cDNA第一链 4．得双链DNA 5．DNA序列纠错 6. 目的基因通过细胞克隆扩增 7. 目的基因回收及DNA测序，最终目的 基因获取
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一、获取外源目的基因片段
1．选择实验材料 胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛 素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内 源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核 糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分 泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中 才能转录出信使RNA，所以用基因工程 方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为 获取目的基因的实验材料。
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一、获取外源目的基因片段
4．得双链DNA
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
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一、获取外源目的基因片段
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
mRNA－cDNA 杂合双链中的 mRNA 链在 RNA 酶 H 作用下先形成很多切 口， mRNA 链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌 DNA 聚 合酶 Ⅰ 提供了合成第二链的引物。大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 以第一 链 cDNA 为模板合成一段段互补的 cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而 在 DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即 cDNA 的第二链。遗留在 5'末端的一段很小的 mRNA 也被大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5'3' 核 酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3'-端部分 序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5' 核酸外切酶的活性可 将暴露出的第一链 cDNA 的 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平 端 优点: a)合成cDNA的效率高 b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化 c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
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一、获取外源目的基因片段
3．逆转录mRNA,得cDNA第一链
mRNA在反转录酶的作用下由引物引导合成cDNA。 加入高浓度的 Oligo（dT）引物， ，Oligo（dT）引 物与 mRNA 的 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转 录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为 普遍，其缺点主要是由于 cDNA 末端存在较长 的 poly（A）而影响 cDNA 测序。（原因：oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3‘ 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一 端，有时这种全合成难以达到）
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
（2）操作步骤：
① 将0.5-1.0g寡聚（dT）纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。 ② 用DEPC处理的1ml 注射器或适当的细管，将寡聚（dT）纤维素装柱0.5-1ml，用3 倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。 ③ 使用1*上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 ④ 将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2*上样 缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1*上样 缓冲液洗柱，继续收集流出液。 ⑤ 将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。 ⑥ 用5-10倍柱床体积的1*上样缓冲液洗柱，每管1ml分步收集，OD260测定RNA含量。 前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无polyA尾的RNA。后部分收集管 中流出液的OD260值很低或无吸收。 ⑦ 用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly（A+）RNA，分步收集，每部分为1/3-1/2柱 体积。 ⑧ OD260测定poly（A+）RNA分布，合并含poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放臵30min。 ⑨ 4℃离心，10000g*15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。4℃离心， 10000g*5min，弃上清，室温晾干。 ⑩ 用适量的DEPCH2O溶解RNA。
用基因工程方法 获得胰岛素
第四组
2015/9/30 1
2015/9/30
胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白 质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖 的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治 疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因 子具有高度生物活性，分子量很大，立 体结构异常复杂，体外难以人工合成。 所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪 体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰 岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪 胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期 服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治 疗。
2015/9/30 11
一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取 2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
2015/9/30 12
一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可 以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释 放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有 效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8 －羟基喹啉、异硫氰酸胍、β- 巯 基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。 TRIzol 是从细胞和组织中提取总 RNA的即用型试剂，在样品裂 解或匀浆过程中， TRIzol 能保持 RNA 完整性。提取 RNA 时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入 TRIzol 试剂， 进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提， 离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过 异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA 的纯化。
方法三： 需体外折叠。
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基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
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一、获取外源目的基因片段
二、人胰岛素原表达法
表达产物的后 期处理路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
三、A链和B链同时表达法
2015/9/30
7
基因工程制胰岛素三种方法
三种方法比较：
方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二 硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成 本高。
方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正 确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程图
2015/9/30
15
一、获取外源目的基因片段
2．2 mRNA的纯化
该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷 酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时， 在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结 合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。 经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的 mRNA。
2015/9/30wk.baidu.com18
一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
（3）注意事项
① 整个实验过程必须防止Rnase的污染。 ② 步骤④中将RNA溶液臵65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有 两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA poly（A+）尾处的二 级结构，使poly（A+）尾充分暴露，从而提高poly（A+）RNA的回收率； 另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所 以此步骤不能省略。 ③ 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动， 若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。 ④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。 ⑤ 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg poly（A+）RNA， 约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
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一、获取外源目的基因片段
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
2015/9/30
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一、获取外源目的基因片段
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
4.2.1模板DNA的变性 向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐热的DNA 聚合酶、PCR缓冲液（ 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4)，150mmol／L MgCl2，lmg／m1明胶）、5mmo1／L dNTP贮备 液，然后加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备
2015/9/30 19
一、获取外源目的基因片段
2．3 mRNA的保存
用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成 或保存在70%乙醇中并于-70℃下贮存。
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一、获取外源目的基因片段
胰岛素基因mRNA序列
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一、获取外源目的基因片段
胰岛素基因mRNA序列
NCBI中搜索得
一、获取外源目的基因片段
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
4.2.2模板DNA与引物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结 合；
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一、获取外源目的基因片段
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
化学合成 A链和B链
的编码序
列
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基因工程制胰岛素三种方法
一、A链和B链分别表达法
表达产
物的后
期处理 路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
二、人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
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基因工程制胰岛素三种方法
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA （1）试剂准备： ① 3M醋酸钠（pH5.2）； ② 0.1M NaOH； ③ 上样缓冲液：20mM Tris-HCl（pH7.6）,0.5M NaCl,1M EDTA (pH8.0),0.1%SLS(十二烷基氨酸钠)。配制时可先配制 Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压 消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至 65℃，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%； ④ 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.6），1mM EDTA （pH8.0），0.05%SDS； ⑤ 无水乙醇、70%乙醇； ⑥ DEPC（0.1%焦炭酸二乙酯）
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程 （1）样品处理① 培养细胞：收获细胞1-5*10^7，移入 1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol，混匀，室温静臵5min。 ② 组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组 织均可）臵1.5ml离心管中，加入1ml TRIzol充分匀浆，室 温静臵5min。 （2）加入0.2ml氯仿，振荡15s，静臵2min。 （3）4℃离心，12000g*15min，取上清液。 （4）加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静臵 10min。 （5）4℃离心，12000g*10min，弃上清液。 （6）加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g*5min， 弃上清液。 （7）晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。
1．选择实验材料 2．提取RNA，分离RNA 3．逆转录mRNA,得cDNA第一链 4．得双链DNA 5．DNA序列纠错 6. 目的基因通过细胞克隆扩增 7. 目的基因回收及DNA测序，最终目的 基因获取
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一、获取外源目的基因片段
1．选择实验材料 胰岛素是一种蛋白质类激素，体内胰岛 素是胰岛B细胞（即胰岛β细胞）受内 源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核 糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分 泌的。胰岛素基因只有在胰岛B细胞中 才能转录出信使RNA，所以用基因工程 方法生产胰岛素时，选用胰岛B细胞为 获取目的基因的实验材料。
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一、获取外源目的基因片段
4．得双链DNA
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
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一、获取外源目的基因片段
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
mRNA－cDNA 杂合双链中的 mRNA 链在 RNA 酶 H 作用下先形成很多切 口， mRNA 链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌 DNA 聚 合酶 Ⅰ 提供了合成第二链的引物。大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 以第一 链 cDNA 为模板合成一段段互补的 cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而 在 DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即 cDNA 的第二链。遗留在 5'末端的一段很小的 mRNA 也被大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5'3' 核 酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3'-端部分 序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5' 核酸外切酶的活性可 将暴露出的第一链 cDNA 的 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平 端 优点: a)合成cDNA的效率高 b)直接利用第一链的反应产物,不需纯化 c)避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA
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一、获取外源目的基因片段
3．逆转录mRNA,得cDNA第一链
mRNA在反转录酶的作用下由引物引导合成cDNA。 加入高浓度的 Oligo（dT）引物， ，Oligo（dT）引 物与 mRNA 的 3' 末端的 poly（A）配对，引导反转 录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为 普遍，其缺点主要是由于 cDNA 末端存在较长 的 poly（A）而影响 cDNA 测序。（原因：oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3‘ 端，因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一 端，有时这种全合成难以达到）
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
（2）操作步骤：
① 将0.5-1.0g寡聚（dT）纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。 ② 用DEPC处理的1ml 注射器或适当的细管，将寡聚（dT）纤维素装柱0.5-1ml，用3 倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。 ③ 使用1*上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 ④ 将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2*上样 缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1*上样 缓冲液洗柱，继续收集流出液。 ⑤ 将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。 ⑥ 用5-10倍柱床体积的1*上样缓冲液洗柱，每管1ml分步收集，OD260测定RNA含量。 前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无polyA尾的RNA。后部分收集管 中流出液的OD260值很低或无吸收。 ⑦ 用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱poly（A+）RNA，分步收集，每部分为1/3-1/2柱 体积。 ⑧ OD260测定poly（A+）RNA分布，合并含poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放臵30min。 ⑨ 4℃离心，10000g*15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。4℃离心， 10000g*5min，弃上清，室温晾干。 ⑩ 用适量的DEPCH2O溶解RNA。
用基因工程方法 获得胰岛素
第四组
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胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性 物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、 胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白 质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖 的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质 合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治 疗。胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因 子具有高度生物活性，分子量很大，立 体结构异常复杂，体外难以人工合成。 所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪 体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰 岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪 胰岛素B链第30个氨基酸残基不同，长期 服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用 基因工程方法获得重组人胰岛素进行治 疗。
2015/9/30 11
一、获取外源目的基因片段
2．提取RNA，分离RNA
2．1 总RNA的提取 2．2 mRNA的纯化
2．3 mRNA的保存
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一、获取外源目的基因片段
2．1 总RNA的提取
总RNA的抽提方法有多种，TRIzol试剂是使用组广 泛的RNA抽提试剂，主要由苯酚和异硫氰酸胍组成，可 以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的 RNA释 放出来，并使核糖体蛋白与RNA分子分离。苯酚虽可有 效地变性蛋白质，但不能完全抑制 RNA 酶活性，因此 TRIzol 中还加入了 8 －羟基喹啉、异硫氰酸胍、β- 巯 基乙醇等来抑制内源和外源 RNase （ RNA 酶）。 TRIzol 是从细胞和组织中提取总 RNA的即用型试剂，在样品裂 解或匀浆过程中， TRIzol 能保持 RNA 完整性。提取 RNA 时，首先用液氮研磨材料，匀浆，加入 TRIzol 试剂， 进一步破碎细胞并溶解细胞成分。然后加入氯仿抽提， 离心，分离水相和有机相，收集含有RNA的水相，通过 异丙醇沉淀，可获得比较纯的总RNA，用于下一步mRNA 的纯化。
方法三： 需体外折叠。
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基因工程获取胰岛素的步骤
一、获取外源目的基因片段 二、选择与获取表达载体 三、重组目的DNA片段与表达载体 四、选择与获取表达细胞 五、重组体导入表达细胞 六、对重组体细胞进行筛选纯化鉴定 七、工程菌产物鉴定和保存 八、发酵培养
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二、人胰岛素原表达法
表达产物的后 期处理路线：
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基因工程制胰岛素三种方法
三、A链和B链同时表达法
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基因工程制胰岛素三种方法
三种方法比较：
方法一： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二 硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此成 本高。
方法二： 胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正 确配对率提高，折叠率高。工艺路线依然繁琐。
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一、获取外源目的基因片段
2．1．1 TRIzol法提取流程图
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一、获取外源目的基因片段
2．2 mRNA的纯化
该方法利用mRNA 3＇端含有PolyA（多聚腺苷 酸）的特点，当RNA流经寡聚dT纤维素柱时， 在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性的结 合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。 经过两次寡聚纤维柱后可得到较高纯度的 mRNA。
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一、获取外源目的基因片段
2．2．1 寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
（3）注意事项
① 整个实验过程必须防止Rnase的污染。 ② 步骤④中将RNA溶液臵65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有 两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA poly（A+）尾处的二 级结构，使poly（A+）尾充分暴露，从而提高poly（A+）RNA的回收率； 另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所 以此步骤不能省略。 ③ 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动， 若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。 ④ 寡聚（dT）纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依 次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。 ⑤ 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg poly（A+）RNA， 约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
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一、获取外源目的基因片段
4.1合成cDNA第二链得双链DNA
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一、获取外源目的基因片段
4.2将DNA双链通过PCR技术进行扩增
4.2.1模板DNA的变性 向离心管加入ＤＮＡ模板、引物、耐热的DNA 聚合酶、PCR缓冲液（ 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl(pH8.4)，150mmol／L MgCl2，lmg／m1明胶）、5mmo1／L dNTP贮备 液，然后加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备
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一、获取外源目的基因片段
2．3 mRNA的保存
用少量水溶解mRNA，即可用于cDNA合成 或保存在70%乙醇中并于-70℃下贮存。
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一、获取外源目的基因片段
胰岛素基因mRNA序列
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一、获取外源目的基因片段
胰岛素基因mRNA序列
NCBI中搜索得