基因工程制胰岛素的资料120页PPT
大肠杆菌基因工程人胰岛素课件
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
大肠杆菌基因工程人胰岛素
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工业上可采用下列四种方法大规 模生产人胰岛素： （1）从人的胰中直接提取胰岛素； （2）由单个氨基酸直接化学合成； （3）由猪胰岛素化学转型为人胰 岛素；
（4）利用基因工程菌大规模大规 模发酵生产重组人胰岛素。
大肠杆菌基因工程人胰岛素
产人胰岛素大肠杆菌 工程菌的构建策略
大肠杆菌基因工程人胰岛素
AB链分别表达法
本次以重组人胰岛素为例，论述利用大肠杆菌生产外 大肠杆菌基源因工基程人因胰表岛素达产物的基本过程。
胰岛素的生产方法
人胰岛素是一种由两条多肽链 ( A 链和 B 链) 组成的蛋白 质。胰岛素合成时，最初在胰岛 B 细胞内的附着核糖体上形 成的是一条单链多肽———前胰岛素原，其进入内质网腔后， 信号肽酶切除信号肽形成胰岛素原，后者被运输至高尔基体， 在高尔基体中切除连接 序列( C 链) 形成 A 链和 B 链，然后 通过二硫键将两者结合形成有生物活性的胰岛素。
胰岛素制备
生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。
胰岛素生产ppt课件
确保原料的储存环境符合要求，防止污染、变质等情况。
原料的质量控制记录
建立完整的原料质量控制记录，确保可追溯性。
生产过程的质量控制
1 2
生产过程的规范化
制定严格的胰岛素生产操作规程，确保生产过程 的规范化。
生产过程的监督与检查
对生产过程进行定期监督与检查，确保生产环节 的质量符合要求。
此外，根据作用时间不同，胰岛 素又可分为速效、中效和长效胰
岛素。
胰岛素的作用与重要性
胰岛素的主要作用是调节血糖 ，它能够促进细胞对葡萄糖的 摄取和利用，从而降低血糖水 平。
对于糖尿病患者来说，胰岛素 是控制血糖的重要手段，尤其 是对于1型糖尿病患者，胰岛素 是必不可少的药物。
此外，胰岛素还对脂肪和蛋白 质代谢有重要影响，能够促进 脂肪合成和抑制蛋白质分解。
02
胰岛素生产流程
原料准备
胰岛素原料
确保胰岛素原料的质量和稳定性 。
辅助原料
如用于溶液
将胰岛素原料溶解于适当的溶剂中， 形成均匀的溶液。
过滤与除菌
去除溶液中的杂质和微生物，确保溶 液的纯净度。
胰岛素结晶
调节pH值
通过调节溶液的pH值，使胰岛素分子以正确的构象稳定下来 。
到了20世纪20年代，加拿大医生班廷和他的助手贝斯特通过实验证实了这种物质可 以治疗糖尿病，从而开启了胰岛素的临床应用。
班廷和贝斯特因此获得了1923年的诺贝尔生理学或医学奖。
胰岛素的种类
根据来源不同，胰岛素可分为动 物胰岛素、人胰岛素和胰岛素类
似物。
动物胰岛素是从猪和牛的胰腺中 提取而来，人胰岛素则是通过基 因工程合成，而胰岛素类似物则 是通过修饰氨基酸序列得到的。
基因工程制备胰岛素的原理
基因工程制备胰岛素的原理基因工程制备胰岛素的原理主要涉及三个步骤：基因克隆、表达和纯化。
第一步：基因克隆。
首先，从人类组织或细胞中提取出编码胰岛素的基因，即胰岛素原基因（proinsulin gene）。
然后，使用酶切酶将这个基因剪切成多个片段。
接下来，将剪切好的基因片段与载体（通常是质粒）连接，形成重组质粒。
再将这个重组质粒转化到细菌中（如大肠杆菌）进行复制。
经过培养、筛选和鉴定，得到含有胰岛素基因的重组质粒。
第二步：基因表达。
将所得到的重组质粒注入到宿主细胞（通常是培养的动物细胞或真核表达系统）中，使其成为重组表达宿主。
在宿主细胞中，重组质粒会被转录成胰岛素的mRNA，并被细胞质中的核糖体翻译成胰岛素的前体蛋白（proinsulin）。
然后，前体蛋白经过一系列的翻译后修饰，如信号肽的剪切和糖基化等，转变成成熟的胰岛素蛋白。
第三步：纯化。
经过表达的胰岛素会以包括其他蛋白质的复杂混合物的形式出现在表达宿主细胞中。
因此，需要对这个混合物进行纯化，以获得高纯度的胰岛素。
一种常用的方法是使用层析技术，如亲和层析和离子交换层析等，根据胰岛素与某些特定配体（如金属离子或抗胰岛素抗体）的亲和性来进行分离和富集。
通过这些层析步骤，可以得到纯度较高的胰岛素。
总结起来，基因工程制备胰岛素的原理主要涉及基因克隆、基因表达和纯化。
通过基因克隆，首先获得含有胰岛素基因的重组质粒；接着，通过基因表达，将胰岛素基因在宿主细胞中转录和翻译成胰岛素蛋白；最后，通过纯化步骤，将胰岛素从其他蛋白质中分离出来，并得到高纯度的胰岛素。
这种方法可以大量制备胰岛素，为临床治疗糖尿病等疾病提供重要药物。
胰岛素的相关知识PPT课件
注射部位的选择和轮换
注射部位的选择
根据患者的需求和胰岛素的类型 ，选择合适的注射部位，如腹部 、大腿外侧、上臂外侧等。
注射部位的轮换
为了避免皮肤硬结、脂肪萎缩等 不良反应，应定期更换注射部位 ，并确保每次注射部位都正确。
胰岛素的保存和运
胰岛素的保存
胰岛素应存放在阴凉干燥处，避免阳 光直射和高温，以免影响药效。
患者在接受胰岛素治疗过程中应密切 关注自身状况，如有异常及时就医， 以便及时发现并处理不良反应。
06
胰岛素的未来发展
新型胰岛素的开发和研究
总结词
随着科技的不断进步，新型胰岛素的开发和研究也在不断深入，旨在提供更加安全、有效、方便的治疗方案。
详细描述
目前，新型胰岛素的研究主要集中在两个方面，一是长效胰岛素的研究，旨在减少注射次数，提高患者的依从性； 二是新型胰岛素类似物的研发，旨在提供更加精准的血糖控制。
胰岛素在糖尿病治疗中的应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
胰岛素是治疗糖尿病的重要药物之一，可用于控制血糖、 预防并发症。
对于1型糖尿病患者，由于胰岛素分泌绝对不足，需要依赖 外源性胰岛素来控制血糖。对于2型糖尿病患者，随着病程 进展，胰岛功能逐渐衰退，也需要使用胰岛素来补充治疗 。此外，妊娠期糖尿病患者也需要使用胰岛素来控制血糖 。胰岛素治疗可以有效降低血糖水平，预防和延缓糖尿病 并发症的发生，提高患者的生活质量和预后。
注射部位脂肪增生和脂肪萎缩
长期注射胰岛素的患者可能会出现注射部位脂肪增生和脂肪萎缩的情况，导致胰 岛素吸收不良，影响治疗效果。
为避免这种情况，患者应定期更换注射部位，避免在同一部位反复注射，同时注 意注射技巧和方法，避免过度用力按摩注射部位。
《胰岛素注射知识》PPT课件
定期对患者进行随访和评估，了解治疗情况和患者需求，及时调整治 疗方案和提供必要的支持。
培养患者自我管理能力
教育患者如何自我监测血糖、调整饮食和运动计划等，培养患者的自 我管理能力，提高治疗效果和生活质量。
05 临床案例分析与经验分享
成功案例展示与启示
案例一
患者李先生，62岁，患有2型糖尿病多年。通过规范的胰 岛素注射治疗，血糖控制良好，生活质量显著提高。
D
处理方法与技巧
皮下脂肪增生处理
注射部位感染处理
停止在增生部位注射胰岛素，可局部热敷 或按摩促进消散。
轻度感染可局部涂抹消炎药膏，严重感染 需及时就医治疗。
胰岛素过敏处理
低血糖反应处理
立即停用胰岛素并就医，必要时可使用抗 过敏药物治疗。
立即进食含糖食物或口服葡萄糖水，严重者 需静脉注射葡萄糖。同时调整胰岛素剂量和 饮食计划，避免再次发生低血糖。
注射角度、深度与速度控制
01
02
03
注射角度
一般选择90°垂直进针， 瘦人或儿童可选择45°进 针。
注射深度
确保针头全部刺入皮肤， 避免胰岛素注入肌肉层。
注射速度
快速进针，缓慢推注胰岛 素，注射完毕后停留10秒 再拔针，确保胰岛素充分 吸收。
03 并发症预防与处理
常见并发症类型及原因分析
皮下脂肪增生
多学科协作
建立由内分泌科、营养科、心理科等多学科组成的协作团队，为 患者提供全面的治疗和管理方案。
患者教育与培训
加强对患者的教育和培训，提高患者对胰岛素注射的认识和自我 管理能力。
谢谢聆听
案例二
患者张女士，45岁，新诊断的2型糖尿病患者。经过胰岛 素注射治疗及饮食、运动调整，血糖迅速达标，避免了并 发症的发生。
胰岛素制备
胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。
二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。
3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。
这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。
E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。
酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。
因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。
利用大肠杆菌生产胰岛素ppt课件
4.将质粒送回大肠杆菌
在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收.
将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性， 使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处 于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来 DNA的生理状态）。
❖ 通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高 cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降 低，加速糖原合成、抑制糖原分解。
❖ 通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速 丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。
❖ 通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖 异生。
5.胰岛素的产生
在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的 折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。
2.提取质粒
从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提 取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩 增、银染序列分析。 2.煮沸法
3.基因重组
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶 将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质 粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质
利用大肠杆菌生产胰岛素
基因工程育种
胰岛素作用机理
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯 一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。
胰岛素生产流程图 PPT
L iq W a s te 1 6
P-12 / V-111
Crystallization
S -1 7 2
P-33 / DF-104 L iq W a s te 1 5
Diafiltration
L iq W a s te 1 4
P-31 / C-105
Gel Filtration
P-29 / DF-1L0i3q W a s te 1 3
P-14 / DS-101
Centrifugation
再次离心， 去除菌体碎 片和可溶性 蛋白 共用前面回 收工段的碟 片离心机
反应工段—嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个
氨基酸的Trp-LE’-Met和82个氨基酸的Proinsulin
WFI透析至盐 酸胍浓度为 20%w/w
pH 9-11，50%w/w(6M)盐酸
--菌液从37000L浓 缩到9165L菌泥 EDTA Solution S -1 3 8 --菌体收率98%
Primary Recovery Section
三次高压匀
浆机破菌释
放包涵体
L iq W a s te 2
压降800bar
终物料体积： 1400L
T ri to n-X-100
S -1 2 5
L iq W a s te 1 2
Diafiltration
P-28 / C-104
RP-HPLC
P-30 / DF-103
Diafiltration
Media
S -1 0 2
发酵工段
W ater
Fermentation Section
S-108 P-6 / AF-102
S -1 0 7
大肠杆菌基因工程——人胰岛素PPT课件
下游，后者所编码是降解青霉素的酶蛋白，通
常能被大肠杆菌分泌到细胞外。由此构建得到
的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融
合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分离纯化
工序减轻了负担。
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感谢聆听
还有202-2的小伙伴们
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感谢您的观看！
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虽然上述工艺路线并不比AB链 分别表达更为简捷，而且需要 额外使用两种高纯度的酶制剂， 但由于其体外折叠成功率相当 高，在一定程度上弥补了工艺 繁琐的缺陷，使得产品的生产 成本仅为50美元/g。
AB链同时表达法
3 这种方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，
然后组装在大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋 白经溴化氢CNBr处理后，分离传话A-B链多肽，然后再根据两条链连接 处的氨基酸性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体 外折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与第一种方法相似，其最大的缺 陷仍是体外折叠的正确率较低，因此目前尚未进入应用阶段。
第7页/共10页
小结
上述三种工程菌的构建路线均采用胰岛素或
胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基
1
因拼接的方法，所生产的融合型重组蛋白表达
率高，且稳定性强，但不能分泌，主要以包含
2
5
体的形式存在与细胞内。一种能促进融合蛋白
分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原
3
3
编码序列插入到表达型质粒β-内酰胺酶基因的
目录
1.利用重组大肠杆菌 生产医用蛋白或多肽
2.胰岛素的生产方法 3.产人胰岛素大肠杆 菌工程菌的构建策略
基因工程
基因工程制药的基本过程
DNA
胰岛素基因 1
限制酶
人体细胞
胰岛素 DNA 质粒 2 限制酶
细菌细胞
胰岛素的基本制法
胰岛素制药生产的主要程序
获得目的基因
组建重组质粒
构建工程菌（或细胞） 构建工程菌（或细胞）
培养工程菌
产物分离纯化
除菌过滤
半成品素须保存在10℃以下的冷藏器内，在 2℃~8℃温度的冰箱中可保持活性不变2~3 年，即使已部分抽吸使用的胰岛素也是如 此。使用时，温度不超过30℃和大于2℃ 的地方均可，但必须避开阳光，以防失效。 混浊型胰岛素若是被震摇几个小时或是没 有适当保存时便可能会形成团块，这时胰 岛素就应该丢弃。
基因工程药品 —— 胰岛素
班级： 班级： 姓名： 姓名： 学号： 学号： 08制药工程 08制药工程 张 宝 2008125007
胰岛素的简介
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质一 种蛋白质激素 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素 同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。
胰岛素的结构
胰岛素的化学结构如右图 胰岛素由A、B两个 肽链组成。人胰岛素链有 11种21个氨基酸，B链有 15种30个氨基酸，共26 共 个氨基酸组成。其中 种51个氨基酸 个氨基酸 A7(Cys)-B7(Cys)、 A20(Cys)-B19(Cys)四个 半胱氨酸中的巯基形成两 个二硫键，使A、B两链 连接起来。此外A链中 A6(Cys)与A11(Cys)之间 也存在一个二硫键。
敬请老师斧正！ 敬请老师斧正！ 谢谢！ 谢谢！
基因工程药品 —— 胰岛素
胰岛素从猪、 胰岛素从猪、牛等动物的胰 腺中提取，100Kg胰腺只能提取 腺中提取，100Kg胰腺只能提取 4-5g的胰岛素，其产量之低和价 5g的胰岛素， 的胰岛素 格之高可想而知。 格之高可想而知。
利用大肠杆菌生产胰岛素幻灯片PPT
基因工程育种
胰岛素作用机理
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯 一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。 作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。
〔一〕调节糖代谢
胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原分 解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。 促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄
粒。
4.将质粒送回大肠杆菌
在大肠杆菌的培养液中参加含有Ca+的物质,如 CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的 质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒 吸收. 将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细
胞壁的通透性， 使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，
此时的细胞处
5.胰岛素的产生
在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产 生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便 可大量生产出胰岛素! 注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生 物没有内质网、高尔基体等，不能进展多肽的 折叠、修饰等，还需人为进展菌体外加工。
2.提取质粒
从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。 此质粒将作为胰岛素基因的载体。 1.碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提 取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩 增、银染序列分析。 2.煮沸法
3.基因重组
取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶 将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质 粒“缝合〞,形成一个能表达出胰岛素的DNA质
糖转运入细胞。 通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高
cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降 低，加速糖原合成、抑制糖原分解。 通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙 酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。 通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异 生。 抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪发动，使组织 利用葡萄糖增加。