葡萄芪合酶基因家族上游调控序列分析
葡萄VvWRKY70_基因生物信息学及表达特性分析
山西农业科学 2023，51（9）：1034-1041Journal of Shanxi Agricultural Sciences葡萄VvWRKY70基因生物信息学及表达特性分析李晋圆1，李莉娟1，宋晶晶1，闫冬梅1，董志刚2，仪慧兰1（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西农业大学果树研究所，山西太谷 030800）摘要：WRKY是植物特有的转录因子，在多种生物和非生物胁迫中发挥作用。
基于RNA-seq技术，课题组前期研究发现，SO2熏蒸结合低温保鲜过程中多个功能未知的葡萄WRKY基因差异表达。
经氨基酸序列同源性比对，研究选择与AtWRKY70氨基酸序列相似度最高的VvWRKY70进行生物信息学及表达特性分析。
生物信息学分析结果表明，VvWRKY70基因启动子区含有W-box元件及茉莉酸甲酯、水杨酸等激素响应元件；编码蛋白由322个氨基酸组成，分子质量约36.57 ku，属亲水性蛋白；该蛋白丝/苏氨酸含量丰富；二级结构主要由无规卷曲和α-螺旋组成，N端含有高度保守的WRKY结构域，C端为C2HC型锌指结构，属WRKY第Ⅲ亚家族；预测显示，其主要定位于细胞核中，且在进化上较为保守。
qRT-PCR分析表明，VvWRKY70在玫瑰香葡萄根、茎、叶、花蕾、果中均有表达；葡萄果实VvWRKY70受SO2和灰霉菌诱导上调表达，低温处理组下调表达。
综上可见，VvWRKY70可能作为转录因子参与调节植株生理和果实发育过程，并在葡萄果实采后SO2保鲜过程中发挥作用，调节果实贮藏期间的生物和非生物胁迫应答。
关键词：葡萄；VvWRKY70；生物信息学；转录特征中图分类号：S663.1 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）09‒1034‒08Bioinformatics and Expression Characteristics Analysis ofVvWRKY70 Gene in Vitis vinifera L.LI Jinyuan1，LI Lijuan1，SONG Jingjing1，YAN Dongmei1，DONG Zhigang2，YI Huilan1（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute of Pomology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030800，China）Abstract：WRKY transcription factors(TFs), as plant-specific transcription factors, play significant roles in various biological and abiotic stress. In this study, based on RNA-seq analyses, many differentially expressed grapes WRKY genes with unknown function were found during the process of SO2 fumigation combined with low temperature preservation. Through amino acid sequence homology comparison, VvWRKY70 which had the highest similarity to the amino acid sequence of AtWRKY70 was selected for bioinformatics and expression characteristics analysis. The results of bioinformatics analysis showed that the promoter region of VvWRKY70gene contained W-box element and the response elements to the hormones such as methyl jasmonate and salicylic acid. VvWRKY70encoding protein was composed of 322 amino acids with a molecular weight about 36.57 ku and hydrophilic, rich in serine/threonine. The secondary structure was mainly composed of random coil and α-helix. The N-terminal contained a highly conserved WRKY domain, and the C-terminal was a C2HC zinc finger structure, belonging to the third WRKY subfamily. Predictions also showed that VvWRKY70 protein was mainly located in the nucleus and conserved in evolution. Analysis of qRT-PCR showed that the VvWRKY70expressed in Muscat root, stem, leaf, bud, and fruit. The expression of VvWRKY70in fruit was up-regulated by SO2and Botrytis cinerea, and down-regulated by low temperature. These results revealed that VvWRKY70 was probably involved in regulation of the process of plant physiology and fruit development, played a role in the process of SO2preservation of fruits after harvest, and regulated the biotic and abiotic stress responses during fruit storage.Key words：Vitis vinifera L.; VvWRKY70; bioinformatics analysis; transcriptional characteristicsWRKY基因组成了植物特有的转录因子家族，编码蛋白具有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，参与植物生长发育、物质代谢及非生物（紫外线、低温、H2O2等）和生物（病原菌）胁迫应答[1-2]，是doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.08收稿日期：2023-01-03基金项目：国家自然科学基金项目（3197161278；31371868）作者简介：李晋圆（1995-），女，山西保德人，在读博士，研究方向：果蔬保鲜分子机制。
葡萄VvWDR1生物信息学分析及其互作蛋白分析
2022，42（1）:043J.SHANXI AGRIC,UNIV .（Natural Science Edition ）学报（自然科学版）04081葡萄VvWDR1生物信息学分析及其互作蛋白分析郭建勇1，杨波1，梁长梅2，张鹏飞1，温鹏飞1*（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801）摘要：［目的］探究葡萄WDR1蛋白的作用机理，丰富原花青素和花青苷物质合成调控机理。
［方法］采用PCR 技术克隆葡萄WDR1基因CDS 区，运用生物信息学分析对其编码蛋白理化性质、亲疏水性、信号肽及跨膜结构域、二级结构、三级结构、保守结构域等进行预测；将VvWDR1的CDS 全长克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，转化酵母感受态细胞并进行毒性及自激活检测分析；通过酵母双杂系统对葡萄WDR1与MYBPA2、MYC2蛋白互作机制进行研究。
［结果］WDR1基因cDNA 全长1011bp ，编码366个氨基酸，分子量37.8kD ，等电点5.07，分子式为C 1671H 2588N 458O 518S 11；无信号肽且不具有跨膜结构域，其编码蛋白的二级结构中无规则卷曲39.29%，β⁃折叠26.79%，α⁃螺旋22.02%，β⁃转角11.90%；该蛋白含有5个WD40基序。
同时对葡萄WDR1蛋白进行系统进化分析，发现与PhAN11、AtTTG1的同源性较高；成功构建表达载体pGBKT7⁃WDR1、pGBKT7⁃MYC2、pGADT7⁃MYC2，并鉴定出VvWDR1在酵母细胞中无自激活活性且无毒性；酵母双杂交试验结果显示，共转化pGBKT7⁃WDR1/pGADT7⁃MYBPA2与pGBKT7⁃WDR1/pGADT7⁃MYC2的酵母菌可以在SD/⁃Trp⁃Leu⁃His⁃Ade 的四缺培养基上正常生长。
［结论］克隆得到葡萄WDR1基因，对其进行生物信息学分析，且通过酵母双杂交证明VvWDR1与VvMYBPA2、Vv⁃MYC2编码的蛋白之间存在相互作用。
中国野生华东葡萄芪合成酶基因启动子转化番茄的研究
主要以化学 防治为 主口 ］ ， 但 化学 防 治不 仅污 染环 境 ， 也
启动子上 ， 该启 动子 同芪合成 酶基 因一起被 广泛应用 于
转化植物 的抗 病性 研究［ １ “ ］ 。中国野 生葡 萄蕴 涵着 丰 富 的抗病 资源＿ １ ， 该 课题 组 前期 从 中 国野 生 华东 葡 萄 （ Ｖ ｉ ｔ ｉ ｓ ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ａ ） 高抗病 株 系“ 自河一 ３ ５ 一 ｌ ” 的芪合
其 白藜 芦醇含 量 变化进 行 了测 定 。结 果表 明 ： 经 Ｐ Ｃ Ｒ — Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｅ ｒ ｎ鉴 定 ， 获得 转 基 因株 系 ４个 共 ５ ４株 ； 不 同载体 转化 的 番茄株 系对灰 霉病 抗性 均 高 于野 生 型 ， 但 抗性 存在 差异 ； 添加 增 强 元件 ｅ ｎ ｈ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ启 动 子 启 动 的 芪 合 成 酶 基 因 表 达 的 番 茄 株 系 ， 可使 白藜 芦 醇含 量提 高
摘 要 ： 中 国野 生华 东葡 萄“ 白河一 ３ ５ ～ １ ” 中的 芪合 成 酶基 因启 动 子被 证 明 具有 病 原 茵 和
胁迫 诱 导表达 活性 。现 将 芪合 成酶 基 因置 于增 添 不 同增 强子 的该 启动 子 下 ， 构 建 ４个植 物
表 达 载体 ， 通 过农 杆 菌介 导法进 行 了转化 番 茄的研 究 ， 并 对转基 因株 系抗番 茄灰 霉病表 现及
芪合酶基因的研究进展
芪合酶基因的研究进展摘要在植物中芪类化合物被认为是一种重要的植保素。
最近几年有报道称，芪类化合物还有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等多方面有益人类健康的药理活性。
因此，芪类化合物的研究引起了人们的高度重视。
在大多数植物中仅存在合成芪类化合物所需要的底物，却缺少芪合酶基因来催化这些底物合成芪类化合物。
特综述芪合酶基因的种类、诱导表达和芪合酶基因转基因方面的研究进展。
关键词芪合酶基因；种类；诱导表达；转基因芪类化合物是一类具有均二苯乙烯母核的物质的总称，多存在于植物的木质部。
自从1882年从大黄中分离出第一个天然芪类化合物以来，目前已从24科54属植物中分离得到。
另外，芪类化合物也分布在一些微生物中（如链霉菌属、酵母和细菌）。
以往，芪类化合物主要是作为一种植保素被人们所认识。
近年来又发现一些芪类化合物有抑制人的皮肤真菌和皮肤细菌、抗血小板凝集、抗低密度脂蛋白氧化、调节雌激素、抗增殖、诱导细胞凋亡、抗癌抗氧化等保健功能，这引起了人们极大的兴趣。
芪类化合物和其他次生代谢物质一样，产生于活体薄壁组织中，产生芪的类型和数量取决于植物基因及受刺激薄壁细胞的状态。
芪合酶（Stilbene synthase ，STS）是芪类化合物合成的关键酶，它以苯乙丙烷途径中间物的辅酶A（如香豆酰辅酶A，肉桂酰辅酶A等）和丙二酰辅酶A为底物合成芪类化合物的分子骨架再加由其他酶进行修饰。
特就芪合酶基因的研究进展作一综述。
1芪合酶基因的种类芪合酶属于多聚酮合酶家族，与该家族的另一成员查尔酮合酶具有非常密切的关系，结构上具有高度同源性，功能也很相似。
芪合酶主要是由芪合酶基因转录并转译而成。
根据底物的偏好性及生成的产物，芪合酶基因可分为两类：一类是偏好底物p-香豆酰辅酶Ａ合成白藜芦醇的白藜芦醇合酶（RS）基因，另一类是偏好底物肉桂酰辅酶Ａ合成银松素的银松素合酶（PS）基因。
2芪合酶基因的诱导表达研究大部分芪合酶基因在一般情况下不表达，只有当植物受病原菌侵染、紫外线照射和臭氧、创伤等刺激时，它才被诱导表达。
两个中国野生葡萄抗病相关基因的表达分析
两个中国野生葡萄抗病相关基因的表达分析葡萄是世界性重要的经济类果树之一，在我国也享有很高的经济地位，目前的栽培面积和产量均位居世界前列。
但是葡萄白粉病等严重影响了葡萄产业的发展,尤其是世界广泛种植的主要的栽培品种欧洲葡萄，果实品质优良但对白粉病抗性较差。
作为世界上最重要的葡萄属植物起源中心之一，我国拥有很多葡萄野生资源，并对白粉病有抗性。
尤其是中国野生华东葡萄由于抗病性强，成为葡萄抗病育种的珍贵资源。
本课题组多年研究发现，中国野生华东葡萄株系‘白河-35-1’对白粉病抗性很强，因此构建了白粉菌诱导的‘白河-35-1’的全长cDNA文库，已经从中克隆了一些与抗病相关的转录因子，并研究其功能。
本研究从该cDNA文库中克隆了一个WRKY转录因子，分析生物和非生物胁迫下的表达模式，并应用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，研究其功能。
中国野生毛葡萄‘丹凤-2’抗白粉病并且果实中白藜芦醇含量高。
白藜芦醇是一种植保素，不仅能够增强植物的抗病性，而且在生物制药方面，发挥了抗癌、抗肿瘤、预防心血管疾病等作用。
由于白藜芦醇是芪合成酶基因的表达产物，因此我们应用实时定量的方法研究了毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因家族的组织特异性表达,以期获得高量表达的中国野生毛葡萄芪合成酶基因。
本研究主要取得以下结果：1.采用RACE技术从白粉菌诱导的中国野生华东葡萄‘白河-35-1’（Vitispseudoreticulata）全长cDNA文库中分离得到WRKY基因，命名为VpWRKY3（GenbankAccession No.JF500755），全长1280bp,包含960bp开放阅读框，编码319个氨基酸，分子量为35.4kDa。
氨基酸序列同源性比对分析表明，VpWRKY3属于WRKY家族II型a，VpWRKY3含有一个WRKY保守结构域、一个C2-HH型(C-X5-C-X23-H-X1-H)锌指结构域，和两个预测核定位信号RKRK和KKPR。
欧洲葡萄芪合酶基因的克隆、表达及其进化分析
欧洲葡萄芪合酶基因的克隆、表达及其进化分析芪类化合物是植物体内一种重要的植保素,是作为植物参与应激反应、保护其免受外界环境包括微生物侵害的重要物质。
芪合酶(stilbene synthase,STS)属于Ⅲ型聚酮化合物合酶(PKSIII)超家族,是芪类化合物合成的关键酶,其活性直接受制于芪合酶基因的活性和表达。
自然界中存在两种类型的芪类化合物——白藜芦醇和赤松素。
本课题采用白藜芦醇含量较高的欧洲葡萄作为研究材料,STS基因作为研究对象,利用反转录PCR方法,从欧洲葡萄叶片中分离得到了STS基因家族中的一个成员VvSTS6。
通过对NCBI-UniGene数据库进行搜索,最终得到六个具有完整开放阅读框(ORF)的欧洲葡萄STS基因,查找与VvSTS6基因编码的氨基酸序列有较高相似性的其他物种STS氨基酸序列及其对应的基因编码区序列(CDS),并对以上这些基因序列以及氨基酸序列进行相关生物信息学分析,主要包括葡萄STS基因的生物信息学分析和不同物种STS基因的分子进化研究两部分内容:第一部分内容涵盖欧洲葡萄STS基因的理化性质、结构特征及其生化功能等方面的分析。
结果表明葡萄STS家族蛋白各成员具有相同的保守结构域CHS-like,相似的理化性质、功能位点、二级结构和三级结构,其二级结构主要由α螺旋和随机卷曲组成;葡萄STS不属于分泌蛋白,是弱亲水性胞浆蛋白;葡萄STS基因启动子具有多种顺式作用元件,表明STS基因能够受多种因素诱导表达;对于葡萄科植物STS氨基酸序列的比对及亲缘关系分析说明葡萄科植物STS具有不同程度的相似性,符合种属间亲缘关系,进一步推测葡萄科植物STS功能可能相同。
第二部分内容包括不同植物STS基因密码子适应指数分析、不同物种芪合酶的序列比对和系统进化分析以及不同物种芪合酶的保守结构域分析。
这些分析表明不同植物中的STS具有相对保守的结构;系统发育树说明STS在物种间的进化符合物种进化规律;STS的保守结构域分析证实了物种进化关系稳定。
2022-2023学年上海市闵行区高三二模生物试卷(含解析)
2022-2023学年上海市闵行区高三二模生物试卷学校:___________姓名：___________班级：_______________一、单选题1．下列关于细胞中无机化合物的叙述，正确的是（）A．自由水是生化反应的介质，不直接参与生化反应B．结合水是细胞结构的重要组成成分，主要存在于液泡中C．无机盐参与维持细胞的酸碱平衡，不参与有机物的合成D．无机盐多以离子形式存在，参与生物体的代谢活动和调节内环境稳定2．在观察叶绿体与细胞质流动实验中，以下关于显微镜的使用，正确的是（）A．用高倍镜可以观察到叶绿体的内膜结构B．由低倍镜转换到高倍镜后，视野变亮C．显微镜下观察到叶绿体流动方向为顺时针，则实际流动方向也为顺时针D．高倍镜观察时，转动粗准焦螺旋使叶绿体形态清晰3．在生物体中糖类不仅是维持生命活动所需能量的主要来源，也是A．绝大多数生物化学反应的介质B．细胞内携带遗传信息的物质C．组成生物体结构的基本原料D．含量最多的化合物4．双钩黄芪是一种能够吸收土壤中重金属硒的植物，下列相关叙述错误的是（）A．土壤中的硒以离子形式被植物吸收B．植物从土壤中吸收硒的方式为自由扩散C．硒的吸收可能需要消耗能量D．硒的吸收需要载体5．生物多样性的描述及其所属层次不相符的是（）A．A B．B C．C D．D6．下列关于ATP和酶的叙述中，正确的是（）A．ATP和所有的酶中都不含糖类B．催化ATP合成与分解的酶相同C．线粒体中大量产生ATP时，一定伴随着氧气的消耗D．酶活性随温度的升高而升高，随温度的降低而降低7．图表示淀粉被人体摄入后，在体内发生的一系列代谢变化，其中能形成ATP的是（）A．①②③B．②③④C．①③④D．①②8．关于人体正常细胞中ATP的叙述，正确的是（）A．ATP中含有的五碳糖是脱氧核糖B．ATP中只有远离腺苷的高能磷酸键可以断裂C．植物叶内细胞中ATP只能通过呼吸作用产生D．ATP与ADP的互相转化处于动态平衡之中9．在“观察牛蛙的脊髓反射现象”实验中，对健康牛蛙的脚趾皮肤进行环割剥除的操作是为了研究（）A．脊髓在反射活动中的作用B．感受器在反射活动中的作用C．效应器在反射活动中的作用D．传入神经在反射活动中的作用10．在特异性免疫应答中，能产生抗体的细胞是（）A．B淋巴细胞B．浆细胞C．T淋巴细胞D．致敏T细胞11．下列过程发生在人体内环境中的是（）A．葡萄糖氧化分解B．神经递质与受体结合C．肝细胞合成载脂蛋白D．唾液溶菌酶分解口腔中细菌12．如图所示是生长素发现过程部分示意图，下列相关说法中不正确的是（）A．图1和图2可以证明胚芽鞘具有向光弯曲生长现象B．图2和图3可以证明与生长和弯曲有关的部位是胚芽鞘尖端C．图4和图5可以证明感受光刺激的部位是胚芽鞘尖端D．图1和图3可以证明生长部位是胚芽鞘尖端以下部位13．如图是脂蛋白的结构示意图，有关脂蛋白的说法正确的是（）A．脂蛋白是血液中脂质的总称B．①是胆固醇分子，④是蛋白质分子C．③的含量越多脂蛋白的密度就越低D．脂蛋白沉积在血管壁上会引起血管硬化14．“有心栽花花不开，无心插柳柳成荫”描述的生殖方式是（）A．孢子生殖B．分裂生殖C．营养繁殖D．卵式生殖15．容量性渴觉（HT）是指有效循环血量降低引起的渴觉。
中国葡萄属野生种华东葡萄芪合成酶基因序列及其应用[发明专利]
![中国葡萄属野生种华东葡萄芪合成酶基因序列及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/270d8ef7c281e53a5902ff42.png)
专利名称：中国葡萄属野生种华东葡萄芪合成酶基因序列及其应用
专利类型：发明专利
发明人：王跃进,王西平,徐伟荣,郝炜
申请号：CN200510041662.4
申请日：20050127
公开号：CN1807604A
公开日：
20060726
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及中国葡属野生种华东葡萄芪合成酶基因序列及其应用，本发明采用mRNA差异显示技术(mRNA differential display reverasetranscriptional－PCR，DDRT－PCR)结合末端快速扩增技术(Rapid amplificationof cDNA ends，RACE)克隆了中国葡萄属野生种华东葡萄(Vitispseudoreticulata)抗病相关基因一芪合成酶(stilbene synthase)基因家族成员7个，其大小分别为1288bp、1343bp、1411bp、1468bp、1492bp、1506bp和1556bp，它们均编码392个氨基酸。
该基因编码产物芪合成酶能把1分子香豆酰辅酶A(P－Coumaroyl－CoA)和3分子丙二酰辅酶A(Malonyl－CoA)转化为白藜芦醇。
白藜芦醇作为一种植保素不仅抵抗病菌，还有抗氧化、预防心血管病和防癌、降血脂等作用。
本发明涉及通过转基因方法使小麦、番茄、水稻、玉米、大豆、油菜等植物具有合成白藜芦醇的能力，提高这些植物的抗病性和增加其营养保健功能。
申请人：西北农林科技大学
地址：712100 陕西省杨凌示范区邰城路3号
国籍：CN
代理机构：西安通大专利代理有限责任公司
代理人：李郑建
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中国野生毛葡萄芪合成酶基因表达与抗病功能分析
中国野生毛葡萄芪合成酶基因表达与抗病功能分析葡萄是世界重要的栽培果树之一,欧洲葡萄品种是主栽品种。
葡萄白粉病是严重危害葡萄生产的主要真菌病害之一,病害的流行往往会带来巨大的经济损失。
利用葡萄抗病种质资源培育抗白粉病新品种是提高欧洲葡萄品种抗病性的有效方法。
项目组前期的研究表明中国野生毛葡萄‘丹凤-2’中白藜芦醇含量高,对白粉病具有较高的抗性,挖掘其抗病基因对提高欧洲葡萄抗病性与品质具有十分重要的意义。
本研究从‘丹凤-2’葡萄中克隆得到VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25基因序列,利用农杆菌介导法转入抗病性弱的欧洲葡萄无核白中,进行抗白粉病功能分析。
主要得到的结果如下:1.中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25受生物与非生物胁迫诱导表达,并响应白粉菌及非生物胁迫诱导与刺激,表达上调。
这3个芪合成酶基因在接种白粉菌后12 h表达量显著上升,分别达到了为对照的38.2倍、54.15倍和103.4倍,其次在96 h至120 h表达量较高。
在其他生物小分子化合物MeJA、SA、ABA和非生物类因子创伤、低温、盐、干旱胁迫处理下表达上调,其中VqSTS12基因和VqSTS24基因对低温处理最敏感;VqSTS25基因对创伤处理最敏感。
2.利用同源序列克隆技术获得编码区序列长度均为1179 bp的VqSTS12、VqSTS24和VqSTS25基因,编码392个氨基酸,均定位于16号染色体。
序列分析发现在欧洲葡萄‘PN40024’中的同源基因分别为VvSTS31、VvSTS43和VvSTS39。
亚细胞定位结果表明这3个芪合成酶定位在细胞质中。
利用农杆菌介导法转入欧洲葡萄无核白愈伤组织,共得到304个转VqSTS12基因无核白抗性苗,275个转VqSTS24基因无核白抗性苗,224个转VqSTS25基因无核白抗性苗。
经PCR及Western blot检测最终得到7个转VqSTS12基因无核白植株,阳性率为2.30%;5个转VqSTS25基因无核白植株,阳性率为2.23%;转VqSTS24基因无核白抗性苗在Western blot检测中未检测到明显条带。
中国野生毛葡萄芪合成酶基因抗白粉病表达分析
中国野生毛葡萄芪合成酶基因抗白粉病表达分析葡萄是世界重要栽培果树之一,欧洲葡萄(Vitis vinifera)品种因优质高产而被广泛栽培,但其突出缺点是抗病害能力弱,尤其是白粉病[Uncinulanecator(Schw.)Burr],病害对葡萄的产量与品质造成严重的损失。
中国野生葡萄资源蕴藏着丰富的抗病性,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’不仅白藜芦醇含量高而且抗病性强,是葡萄育种的重要种质资源。
本研究从‘丹凤-2’中筛选了果实中高表达的芪合成酶基因VqSTS13、VqSTS26和叶片中高表达的VqSTS32,经遗传转化至欧洲葡萄无核白中,获得转基因葡萄植株,对转基因植株进行接种白粉菌的抗病性鉴定;进一步以野生型无核白和课题组前期获得的VqSTS6转基因无核白为试材,通过抑制剂处理和微嫁接实验,研究白粉菌诱导下芪合成酶的产物芪类植保素的积累特性。
取得的主要结果如下:1.克隆了中国野生毛葡萄芪合成酶基因VqSTS13(JQ868685)、VqSTS26(JQ868666)和VqSTS32(JQ868672)的cDNA序列,序列大小为1179 bp,经与欧洲葡萄基因组Vitis vinifera cv.‘Pinot Noir’clone PN40024序列比对,得出VqSTS13、VqSTS26、VqSTS32均定位于葡萄第16号染色体上,编码392个氨基酸。
亚细胞定位结果表明VqSTS13、VqSTS26、VqSTS32定位在细胞质中。
2.通过农杆菌介导法,分别将携带‘丹凤‐2’VqSTS13、VqSTS26和VqSTS32基因的植物表达载体转入欧洲葡萄无核白中,获得了VqSTS26、VqSTS32转基因无核白植株。
经PCR检测和Western blot鉴定,获得转VqSTS26基因无核白株系8株、转VqSTS32基因无核白株系5株。
3.对转基因株系进行生物与非生物胁迫处理下芪合成酶基因的表达分析,转基因植株芪合成酶基因的表达水平提高;分析芪合成酶代谢通路相关基因表达,芪合成酶上游PAL基因与下游RSGT基因的表达水平上调,而与芪合成酶存在底物竞争关系的CHS基因表达下调。
4种鲜食葡萄果实糖积累和代谢相关酶及基因表达差异分析
任 言，李美璇，刘婉君，等．４种鲜食葡萄果实糖积累和代谢相关酶及基因表达差异分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（９）：１４０－１４６．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．０９．０１９４种鲜食葡萄果实糖积累和代谢相关酶及基因表达差异分析任 言，李美璇，刘婉君，乔月莲，王 莉，师校欣，杜国强（河北农业大学园艺学院，河北保定０７１００１） 摘要：为明确鲜食葡萄果实糖积累规律及相关机理，以阳光玫瑰、巨峰、意大利和摩尔多瓦葡萄为试材，对发育期果实糖组分含量、蔗糖代谢相关酶活性及糖转运蛋白基因表达进行分析。
结果表明，葡萄果实成熟过程中葡萄糖与果糖含量呈上升趋势，果实成熟时果糖与葡萄糖含量由高到低依次为阳光玫瑰＞巨峰＞意大利＞摩尔多瓦，且差异显著。
在糖代谢中，酸性转化酶（ＡＩ）活性在各品种果实成熟初期均达峰值，且阳光玫瑰葡萄ＡＩ活性比巨峰、意大利和摩尔多瓦分别高３９．８９％、７２．５５％和８６．２０％；阳光玫瑰葡萄蔗糖合酶－分解方向（ＳＳ－ｃ）活性分别比巨峰、意大利和摩尔多瓦高１１．１３％、３４．４４％和４５．７６％。
转色末期至成熟期，阳光玫瑰葡萄果实糖转运蛋白基因ＶｖＨＴ２和ＶｖＳＷＥＥＴ１５相对表达量分别是其他品种的１．２３～２．６０倍与１．１４～３．０５倍。
各品种葡萄果实果糖和葡萄糖含量与ＶｖＨＴ２、ＶｖＳＷＥＥＴ１５表达量和ＡＩ活性均呈显著正相关，阳光玫瑰和巨峰果实果糖、葡萄糖含量与ＳＳ－ｃ活性呈显著正相关。
综上所述，４种鲜食葡萄果实果糖及葡萄糖的积累规律差异主要由糖转运蛋白基因ＶｖＨＴ２、ＶｖＳＷＥＥＴ１５的差异表达和ＡＩ、ＳＳ－ｃ酶活性差异所致。
关键词：葡萄果实；品种；糖含量；代谢酶；表达量；相关性 中图分类号：Ｓ６６３．１０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０２３）０９－０１４０－０７收稿日期：２０２２－０７－１１基金项目：热杂果现代种业科技创新团队（编号：２１３２６３１０Ｄ）；河北省现代农业产业技术体系葡萄创新团队（编号：ＨＢＣＴ２０１８１００２０４）。
巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究
巨峰葡萄Rs基因的克隆鉴定、序列分析与时空表达特征研究崔腾飞;王晨;谭红雨;贾海锋;白云赫;王文然;房经贵【摘要】探究白藜芦醇合酶(Resveratrol synthase,Rs)在巨峰葡萄果实发育中的潜在作用.对其序列进行结构及功能分析,并鉴定其在果实不同发育时期的时空表达特异性.采用生物信息学分析及qRT-PCR的方法,对巨峰葡萄Rs基因序列进行分析,并对其结构和亚细胞定位进行预测,以及分析果实不同时期不同组织的表达情况.克隆得到的Rs基因cDNA全长1539 bp,开放阅读框(ORF)为1179 bp,编码392个氨基酸,预测蛋白分子质量42.88 ku,理论等电点(pI)为6.09,且该基因含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位点以及完整的芪合酶家族特征位点;蛋白互作预测发现,Rs和OMT2.1具有互作,后者可催化白藜芦醇生物合成紫檀芪;亚细胞预测结果表明,Rs基因主要在细胞质和叶绿体中表达;启动子分析发现,Rs基因表达可能受光照、MYB、真菌和激素的调控并存在一定的组织特异性.qRT-PCR表达分析显示,葡萄Rs基因在果皮和果肉中不同时期均有表达,但在花后25 d的青皮中表达量最高.结合Rs基因在白藜芦醇积累的作用,可以推测可能在果实发育前期的果皮中白藜芦醇有较高积累.巨峰葡萄Rs基因在进化过程中具有较高的保守性,其表达可能受环境、真菌和激素的调控且与OMT2.1具有互作效应.而且在不同的组织和时期存在一定的特异性.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2019(034)003【总页数】9页(P59-67)【关键词】葡萄;Rs基因;克隆;序列与表达分析【作者】崔腾飞;王晨;谭红雨;贾海锋;白云赫;王文然;房经贵【作者单位】南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京 210095【正文语种】中文【中图分类】S663.1白藜芦醇(Resveratrol)，简称Res，早在1924年就被发现[1]，化学名称为3，4′，5-三羟基-1，2-二苯乙烯(3，4′，5-trihydroxystilbene)，分子式C14H12O3，相对分子质量228.25[2]，其存在顺式和反式2种类型[3]。
植物芪类次生代谢物的功能、合成调控及基因工程研究进展
芪类是一类次生代谢物，是在葡萄、花生和松树等多个科的植物中分离鉴定得出。
它们多在各种诱发因子或植物病原菌的侵染作用下诱导合成，具有抗病及对人体健康的保健作用等多种生物活性。
随着分子生物学研究的深入及其相关研究手段向植物次生代谢研究的渗透和应用，近一、二十年来，芪类次生代谢物的生物学功能、代谢调控及基因工程等研究领域均取得了重要的进展，芪类次生代谢基因工程已成为植物次生代谢途径基因工程（engineer-ing of secondary metabolism ）成功的典范。
本文对上述方面进行综述，为进一步开展白藜芦醇等芪类次生代谢物在作物品质改良中应用的研究奠定基础。
1植物芪类次生代谢物合成及其功能1.1芪类次生代谢物的基本结构芪属于多酚类次生代谢物，其基本结构由2C桥连接的两个芳香环（C6C2C6）构成，其中两个C桥之间含有烯键。
已在豆科、葡萄科、松科和禾本科、买麻藤科、禾本科、蓼科、青梅属等不同的植物中分离、鉴定出多种芪类次生代谢物。
Langcake 和Pryce [1]首先在真菌（）侵染的葡萄中发现白藜芦醇，在葡萄中发现的多种芪类次生物中，白藜芦醇含量占绝大部分，α-viniferin 和ε-viniferin 是由白藜芦醇进一步聚合反应而合成。
在山葡萄中也分离鉴定出(+)-hopeaphenol,isohopeaphenol,vitisin A,(+)-vitisifuran A,和heyneanol A 等多种白藜芦醇四聚体芪类次生代谢物[2]。
在葡萄中虽也鉴定出了*基金项目：福建省自然科学基金重大项目（No.2002F009）。
何水林：男，1965年生，博士，教授。
E-mail:<hsl324@>.收稿日期:2002-07-30接受日期:2003-05-16农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(1):102~108·综述·植物芪类次生代谢物的功能、合成调控及基因工程研究进展*何水林1**郑金贵2林明2王燕华2（1.福建农林大学作物学院;2.福建农林大学生物中心，福州350002）摘要：芪类(stilbenes)是松树、葡萄和花生等植物中发现的具有抗病及保健等多种功能的次生代谢物。
中国野生毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因表达与功能分析
中国野生毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因表达与功能分析杜杨建;李瑞民;程思妍;张剑侠;王跃进【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2016(36)2【摘要】为了研究中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd.)‘丹凤-2’3个芪合酶基因的表达与功能,该研究采用同源克隆技术分离了毛葡萄‘丹凤-2’3个芪合酶基因VqSTS21、VqSTS30和VqSTS32(GenBank登录号分别为JQ868677、JQ868668和JQ868666),3个基因的cDNA全长均为1 179 bp,编码392个氨基酸.以抗葡萄白粉病(Uncinula necator)的毛葡萄‘丹凤-2’和不抗病的欧洲葡萄‘赤霞珠’为材料分别进行接种白粉菌和ABA、SA、MeJA、高温、低温和高盐胁迫处理,利用实时定量PCR检测这3个基因在胁迫处理下的表达情况;同时利用农杆菌介导法将这3个基因分别转入模式植物烟草中,检测这3个基因在烟草中的表达产物,分析比较这3个基因的表达功能.结果显示:在2个供试材料中,葡萄白粉菌胁迫下芪合成酶VqSTS32诱导表达量高于VqSTS21和VqSTS30;在非生物胁迫处理下,芪合酶基因VqSTS32对高温处理反应最敏感.采用高效液相色谱分析检测转3个基因烟草的结果显示,转VqSTS32基因烟草比转VqSTS30基因烟草植株中白藜芦醇的累积量高.研究表明,3个基因中VqSTS32具有较高的抗葡萄白粉菌特性并能在转基因烟草中表达出较高的反式云杉新苷产物,这为进一步利用VqSTS32转目的植物葡萄基因研究提供了依据.【总页数】10页(P215-224)【作者】杜杨建;李瑞民;程思妍;张剑侠;王跃进【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100;西北农林科技大学园艺学院,旱区作物逆境生物学国家重点实验室,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨陵712100【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.中国葡萄属野生资源毛葡萄的研究与利用进展 [J], 林玲;张瑛;卢江;潘凤英;周咏梅;黄羽;韦荣福2.中国野生毛葡萄芪合成酶基因克隆及表达分析 [J], 曹江玲;贺明阳;朱自果;王跃进3.中国野生毛葡萄芪合成酶基因表达与抗白粉病分析 [J], 刘梦琦; 吴凤颖; 王跃进4.中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响 [J], 丁茜;赵凯茜;王跃进5.野生毛葡萄芪合成酶基因双向启动子活性分析 [J], 和静;李瑞民;王跃进因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
β-葡萄糖醛酸苷酶的关键loop对其稳定性和活性的调控
β-葡萄糖醛酸苷酶的关键loop对其稳定性和活性的调控β-葡萄糖醛酸苷酶是一种重要的酶，在生物学上具有广泛的应用价值。
本文对其关键loop进行了研究，探究其对酶的稳定性和活性的调控作用。
首先，我们对β-葡萄糖醛酸苷酶的整体结构进行了研究和探索。
通过分子模拟和分析，发现酶的活性中心是由一系列关键loop，特别是N214、G305和Y336 loop 组成。
这些loop直接参与到酶的底物结合和催化作用，因此对酶的稳定性和活性有着至关重要的影响。
接着，我们对这些关键loop进行了系统地变异和分析，发现这些loop的结构以及序列变异都会对酶的稳定性和活性产生不同程度的影响。
其中N214 loop对底物的结构限制起到了至关重要的作用，G305 loop则直接参与到催化反应的过渡态形成，Y336 loop则作为维持整个酶分子结构的重要纽带。
最后，我们通过蛋白质工程手段进行了定向修饰，旨在优化酶分子的结构和性能。
结果显示，通过对关键loop进行适当的修饰和改变，β-葡萄糖醛酸苷酶的稳定性和活性均得到了明显的提高，极大增强了其在实际应用中的价值和意义。
综上所述，本文对β-葡萄糖醛酸苷酶的关键loop对稳定性和活性的调控进行了深入的研究和探究，对优化酶分子的性能具有一定的理论和应用价值。
关键词：β-葡萄糖醛酸苷酶、关键loop、稳定性、活性、蛋白质工程β-葡萄糖醛酸苷酶是一种在生物体内发挥重要作用的酶，在生物代谢中参与了许多关键的反应过程。
因此，对于β-葡萄糖醛酸苷酶的研究和探究，对于深入了解生物代谢和药物开发都具有重要的意义。
通过对β-葡萄糖醛酸苷酶的关键loop进行研究和分析，可以发现这些loop在酶的结构和性能中起到了至关重要的作用。
因此，对于优化酶分子的性能和稳定性，对这些关键loop进行定向的修饰和改变，可以极大增强酶在实际应用中的价值和意义。
未来，我们可以继续深入探究β-葡萄糖醛酸苷酶的结构和性能，研究更多可调控因素对酶的影响，并寻找更加有效的蛋白质工程手段和方法，以进一步优化β-葡萄糖醛酸苷酶的性能和应用价值另外，我们还可以探索β-葡萄糖醛酸苷酶在不同基质或环境下的表现和特性，以了解其在生态系统中的作用和适应能力。
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葡萄芪合酶基因家族上游调控序列分析作者：王超霞张雅丽卢江来源：《南方农业学报》2016年第01期摘要：【目的】通過预测葡萄芪合酶（Stilbene synthase，STS）基因上游调控序列的顺式作用元件及分析不同STS基因上游调控序列，为进一步揭示STS基因在葡萄生长发育及胁迫应答过程中的作用提供理论依据。
【方法】通过PlantCARE数据库，在线对欧洲种葡萄PN40024全基因组里的48条STS基因上游调控序列及目前已报道来自其他葡萄品种（圆叶葡萄Noble、华东葡萄白河35-1和欧亚种葡萄无核白、红地球、赤霞珠等）的8条STS基因启动子序列进行顺式作用元件分析。
【结果】STS基因上游调控区域含有多种顺式作用元件，可以分为过程特异元件、诱导子特异元件、结合位点特异元件、环境特异元件、植物组织特异元件、调控特异元件、光响应元件及转录相关元件八大类，其中与抗病相关且出现次数较多的元件有TCA-element、ABRE、ERF、P-box、Box-W1、TC-rich repeats等。
STS基因上游调控序列中含有数量不同的作用元件，其中欧亚种佳丽酿VvPinSTS26上游调控序列含有的顺式作用元件数量最多（49个），而VvPinSTS24上游调控序列含有的顺式作用元件数量最少（2个）。
【结论】葡萄STS基因家族大部分成员的表达受水杨酸、脱落酸、赤霉素、乙烯、真菌诱导子等因素影响，从而调节白藜芦醇参与葡萄生物胁迫或非生物胁迫的防御过程。
关键词：葡萄；芪合酶；基因；顺式作用元件；上游调控序列中图分类号： S663.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）01-0001-06Analysis on upstream regulatory sequence of grape stilbene synthase gene familyWANG Chao-xia， ZHANG Ya-li， LU Jiang *（College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University，Beijing 10083， China）Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for studying effect of stilbene synthase（STS） gene on grape growth and stress-response mechanisms， the present experiment aimed to investigate the cis-acting regulation elements in promoter region of STS genes and upstream regulatory sequences of STS genes from different organisms. 【Method】Based on genome sequence of Vitis vinifera‘PN40024’， 48 STS family genes was predicted. In addition， the reported STS genes from 8 grape cultivars viz.，Muscadine rotundifolia ‘Noble’， V itis pseudoreticulata ‘Baihe 35-1’ and V. vinifera ‘Thompson Seedless’，‘Red Globe’ and ‘Cabernet Sauvignon’ were also selected. Then， the cis-acting elements in upstream regulatory sequences of those STS genes were analyzed using PlantCARE database. 【Result】The result showed that， there existed many cis-acting elements in upstream regulatory sequences of STS genes， which could be classified into 8 categories viz.， component specific， elicitor specific， binding site specific， condition specific，plant tissues specific， regulation specific， light responsiveness and transcription elements. Of which， some elements such as TCA-element， ABRE， ERF， P-box， Box-W1 and TC-rich repeats were related to grape resistance. Furthermore， there were differences in the number of cis-acting elements in upstream regulatory sequences between these STS genes， as follows： the upstream regulatory sequence of V. vinifera ‘Carinena’ VvPinSTS26 gene had the most number of cis-acting elements（49）， while VvPinSTS24 gene had the fewest number of cis-acting elements （only 2 ones）. 【Conclusion】Based on above-mentioned results， it can be inferred that the STS gene expression is affected by ABA， SA， GA， ethylene and fungal elicitor， so that these elicitors play a role in regulating resveratrol synthesis in the grape defense process.Key words： grape（V. vinifera）； tilbene synthase（STS）； gene； cis-acting element；upstream regulatory sequence0 引言【研究意义】白藜芦醇化学名为3，4'，5-三羟基-1，2-二苯乙烯（3，4'，5-trihydroxystilbene），是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，也是芪类物质单体中最重要的植物抗毒素，广泛存在于葡萄、虎杖及花生等天然植物中。
当植物受到生物或非生物胁迫时，白藜芦醇作为一种植物抗毒素被合成，进而增强植物抗性（Tassoni et al.，2005）。
芪合酶（Stilbene synthase，STS）是白藜芦醇合成的关键酶，以丙二酰辅酶A和4-香豆酰辅酶A为底物合成白藜芦醇的分子骨架，受病原菌和非生物胁迫的诱导表达（González-Barrio et al.，2006；Chong et al.，2009）。
在逆境胁迫应答过程中，植物会将通过多种途径获得的感应信号传送至细胞核，细胞核中的转录因子与抗性相关基因上游调控区域中的顺式作用元件发生相互作用，促使抗性基因得到表达而实现自我防御目的。
因此，分析STS基因启动子的顺式作用元件及其调控表达，对揭示白藜芦醇在葡萄抗逆机理中的功能作用具有重要意义。
【前人研究进展】自欧洲葡萄PN40024全基因组完成测序，预测葡萄中STS基因家族有48个成员，为研究STS基因上游表达调控区域提供了重要的生物信息（Jaillon et al.，2007）。
此外，我国野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河35-1、欧亚种汤姆森无核（Thompson Seedless）与佳丽酿（Vitis vinifera Carignane）的STS基因启动子序列也成功克隆获得，并进行相关功能研究（Xu et al.，2010a，2010b），发现我国野生种华东葡萄白河35-1的VpSTS启动子结构明显不同于欧亚种佳丽酿VvcSTS和汤姆斯无核VvtSTS启动子，序列的同源性仅为53.0%和51.7%，受到病原菌和激素的调控表达模式也各不相同。
H■ll等（2013）研究发现，R2R3- MYB转录因子MYB14和MYB15能够调节葡萄STS基因表达，是对葡萄STS基因上游调控区域相关转录因子的首次研究。
Vannozzi等（2013）研究了欧洲葡萄PN40024在遭受机械损伤、紫外照射、霜霉菌侵染等胁迫后STS基因家族的表达情况，发现紫外照射引起STS基因表达上调的数量最多，其次是霜霉菌侵染，最后是机械损伤，但这些因素在植物调节过程中相互影响。
【本研究切入点】目前，有关STS基因家族的功能研究仅限于某一STS基因的上游调控序列（启动子）及其功能分析，针对STS基因家族每个成员的研究较少。
【拟解决的关键问题】从NCBI搜索欧洲葡萄PN40024基因组中预测48条STS基因的上游调控区域及目前已报道来自其他葡萄品种的8条STS基因启动子，通过PlantCARE在线预测其顺式作用元件及分析不同STS基因上游调控序列，为进一步揭示STS基因在葡萄生长发育及胁迫应答过程中的作用提供理论依据。
1 材料与方法1. 1 试验材料歐洲葡萄PN40024的48条STS基因上游调控序列及目前已报道来自其他葡萄品种（圆叶葡萄Noble、华东葡萄白河35-1和欧亚种葡萄无核白、红地球、赤霞珠等）的8条STS基因启动子序列在Grape Genome Browser（http：//s.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）和NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm. /）中进行搜索，其中圆叶葡萄Noble的STS基因启动子序列KP849809和无核白的STS基因启动子序列KP849812由中国农业大学食品科学与营养工程学院卢江教授科研团队扩增获得。