菠萝蛋白酶的提取实验报告
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种有机物，也称为溶菌酶或蛋白水解酶。
它的特点是可以分解蛋白质，具有较强的酸性和碱性环境适应能力，因此，广泛应用于医疗、食品、化妆品等领域中。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶是一项艰巨的任务。
以下是一些步骤：第一步是采集新鲜的菠萝果肉。
必须选用成熟度好的金丝菠萝果肉。
应选择外皮金黄色、果肉红黄相间的菠萝果肉。
第二步是制备浸出液。
将新鲜的菠萝果肉去皮、去核，切成小块，加入适量的水，搅拌并煮沸，经过静置、过滤，即可得到浸出液。
第三步是提取菠萝蛋白酶。
将制备好的浸出液冷藏，待其沉淀，将上层的冰冷水慢慢倒出，留下沉淀。
然后，在沉淀中加入适量的酸性酶解剂，轻轻摇晃，放置几小时。
第四步是酶活测定。
将提取的菠萝蛋白酶放在适宜的酶活测定条件下，如适宜的温度和酸碱度等，测定其活性或浓度。
以上是从菠萝中提取菠萝蛋白酶的一些步骤。
菠萝蛋白酶的应用范围广泛，可用于肉制品、啤酒、乳制品、水产品等食品中。
同时，它还能被用于医疗和化妆品领域，例如用于抗肿瘤、消炎、增加皮肤弹性等。
因此，菠萝蛋白酶的提取十分重要，细节决定了酶的纯度和活性，也影响到菠萝蛋白酶在不同领域中的应用。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一．实验目的:1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取技术二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为33000 ，等电点为9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
菠萝中蛋白酶的提取研究
烬８０ 髓６０
４０ ２０
２
口Ｈ值 田ｌ 不周ｐＨ值环境对菠萝蛋白酶活力的影响
２．２ ｐＨ值对菠萝中的菠萝蛋白酶活力的影响 虽然菠萝的ｐＨ值为３．５左右，但菠萝蛋白酶
的最适ｐＨ值并不一定是３．５，酶活性的测定应在最 适ｐＨ值下进行。取菠萝汁加水稀释，分装于７支试 管中，分别用乳酸或ＮａＯＨ溶液调ｐＨ成ｐＨｌ．７，测 定各ｐＨ下的蛋白酶活力，即可得到ｐＨ对酶活性 的影响结果，见图２。
采用正交实验,运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶,对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究,并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定.
5.期刊论文 李兴.林哲甫 某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响 -药物生物技术2001,8(6)
当温度恒定时A,菠萝中菠萝蛋白酶的热失活过程遵循一级蜕变规律:d[E]/dt=-Kd.t,失活半寿期是常数,可以用作衡量菠萝蛋白酶热稳定性的指标.某 些羧酸盐和金属离子能明显延长菠萝蛋白酶在较高温度下的半寿期.这些物质的稳定化作用可能是由于它们影响了溶剂结构和疏水相互作用,从而维护了 酶分子的活性三维构象的结果.
将菠萝肉直接捣碎，用４００目的分样筛过滤， 滤汁测定酶活备用。分别向菠萝皮汁和菠萝肉汁中 加入适量的９５％食用酒精，静置２０ｍｉｎ后，在 ２０００ｒｐｍ下离心分离１５ｍｉｎ。收集沉淀，干燥后即为 菠萝蛋白酶。 １．４测定方法 １．４．１菠萝蛋白酶测定方法刚 １．４．２糖度测定方法使用糖度计测定 １．４．３酸度测定方法使用精密ｐＨ计测定
２结果与讨论 ２．１菠萝的成熟度对果实ｐＨ值的影响
菠萝成熟度不同，含糖萤不同，口感风味不同， 其果实的ｐＨ值有所不同稍有差别，其中菠萝蛋白 酶的含量必定有所差异，研究中对市场上的不同成 熟度的菠萝进行了测定，结果觅表ｌ。 表１菠萝成熟度（以糖度表示）对其ｐＨ值的影响
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取摘要：，运用盐析法从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶，对菠萝蛋白酶的提取工艺及其影响因素进行了研究，并对提取后得到的菠萝蛋白酶进行测定。
关键词：菠萝皮，菠萝蛋白酶，白陶土吸附，盐析法一目的要求：学习盐析法提取菠萝蛋白酶的方法二实验原理菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称, 主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同, 分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
物理性质：白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
是一种糖蛋白, 一般提取用的酶源是凤梨，但是价格较贵。
而用菠萝皮，不但可以减少资源的浪费，降低费用，又能减少环境的污染。
蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围。
集聚而沉淀（实验书第3页）盐析法提取菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，是一种分子量为33000u的蛋白质，硫酸铵是强电解质，有强烈的水化作用，可破坏蛋白质颗粒表面的水化膜，并能中和蛋白质颗粒所带的电荷，使蛋白质在溶液中凝聚而析出但只有达到蛋白质等电点时，其才易于沉淀对于菠萝蛋白酶来说，使用盐析法提取是比较理想的一种方法，也使用得最广泛。
其基本原理是：因不同的蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度不同而能分离。
此法简便、安全白色至浅棕黄色无定形粉末。
溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白。
三实验材料1试剂70%-80%成熟度的无刺卡因品种菠萝皮20g 高岭土化学纯品(用于作为吸附剂)、95%乙醇无水乙醇碳酸钠饱和溶液硫酸铵粉末14% NaCl溶液0.05%的苯甲酸钠(作为防腐剂)2实验仪器天平，砝码一套100ml量筒一个，50ml烧杯4个，滴管，玻璃棒，离心管2支高速组织捣碎机低速离心机一台四实验方法（1）滤液制备以全班为单位，选取干净的菠萝皮160g，除杂，在清水中漂洗三次，沥干，放入冰箱4℃冷冻备用-------用不锈钢剪刀将菠萝皮剪成碎片，放入高速组织捣碎机中，制备匀浆，打碎后的匀浆用纱布过滤，并150ml 95%乙醇进行第二次浸提、过滤合并两次滤液,滤液添加lml0.05%的苯甲酸钠，实验两人一组，每组取10ml左右于50ml小烧杯中（2）吸附、洗脱滤液置于冰水浴中，不断搅拌，加入汁液量 4%的白陶土搅拌20min，在10℃吸附15~20min ，于冰箱中4℃静置过夜，次日清晨虹吸除去上清液，留下湿陶土，加入冰冷的碳酸钠饱和液调节 PH6.5~7，再加入吸附物重50%的硫酸铵粉末，于冰水浴中振摇 40min进行洗脱，然后压滤，弃去杂物，收集洗脱滤液(3) 待测酶制备将上述洗脱液分装入2支离心管中，每两管天平平衡，3000转离心20min，用吸管吸取下层清液弃去，加入等体积14%NaCl沉淀（盐析），5min后2000r/min 离心10min，弃上清液，用95%乙醇沉淀洗涤一次，2000转离心10min，弃去上清液，用用无水乙醇沉淀洗涤一次，2000转离心10min，弃去上清液，用保鲜膜封口，膜上扎5~10个小孔，放入真空干燥器中干燥。
[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因
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[菠萝蛋白酶提取]果菠萝蛋白酶的提取失败原因菠萝蛋白酶提取一、实验目的：1、了解菠萝蛋白酶的提取和纯化工艺2、优化和加深熟悉菠萝蛋白酶提取二、实验原理：菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
其外观为浅灰色粉末状，分子量为 33000 ，等电点为 9.55 。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
产品已被广泛应用于食品、医药等行业。
结果表明。
提取菠萝中菠萝蛋白酶最佳提取工艺条件是添加单宁溶液的浓度为0．2％，提取时最适pH值为6．5～8．5左右，而最适提取温度为60℃。
菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化，啤酒澄清，还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
三、实验步骤操作要点：菠萝蛋白酶的提取称取1 kg制备好的鲜果皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。
上清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁，分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。
虹吸除去上清废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min。
离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物。
分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
把洗涤剂I酶复合沉淀物倒入烧杯中，加0．5％乙酸锌溶液20 min，搅拌均匀，静止5 min，加0．06％抗坏血酸溶液30 ml，搅匀，静止5 rain，加1．5％氯化钠溶液20 ml，搅匀，静止5 min，最后再加0．5％EDTA溶液20 ml，搅匀，静止5min，以4 000 r／min离心7 min，把上清废液倒掉，得到洗涤剂Ⅱ酶复合沉淀物。
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
从菠萝中提取菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶是一种常见的蛋白酶，它可以在菠萝中找到。
菠萝蛋白酶可以分解蛋白质，因此在食品、医药和日化等行业中有广泛的应用。
提取菠萝蛋白酶的方法有很多种，其中最常用的是浸提法和萃取法。
浸提法是将菠萝切碎，放入含有酸性物质的溶液中浸泡，使菠萝蛋白酶释放出来。
萃取法则是利用有机溶剂将菠萝中的菠萝蛋白酶提取出来。
提取菠萝蛋白酶后，可以通过一系列的分离纯化步骤来获得高纯度的菠萝蛋白酶。
这些步骤包括超滤、离子交换层析和凝胶过滤等。
除了用于医药和食品工业中，菠萝蛋白酶还可以用于日常生活中，例如在洗涤剂中添加菠萝蛋白酶可以去除衣物表面的蛋白质污渍，同时不会损伤衣物。
因此，提取菠萝蛋白酶对于提高生活质量和促进工业发展来说都具有重要意义。
- 1 -。
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。
2、学习酶活力测定的方法。
3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。
4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。
5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。
二、实验原理菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。
分子量为33 000 , 等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。
品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。
2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白酶。
与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。
它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。
3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。
菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。
菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法 [91]。
每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M 标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：( A - A0) 为275nm 波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw 指以水为对照，275nm 波长下50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；M 标为标准酪氨酸溶液浓度；V 为反应体系总体积（mL）；t 为反应时间10min。
菠萝蛋白酶的含量测定
菠萝蛋白酶的来源与应用 菠萝蛋白酶主要来自于菠萝的茎叶皮儿。 菠萝蛋白酶的应用： 一、菠萝蛋白酶在食品加工业的应用 1、焙烤食品：将菠萝蛋白酶加入生面团中，可使面筋降解，生面团 被软化后易于加工。并能提高饼干与面包的口感与品质。
2、干酪：用于干酪素的凝结。
3、肉类的嫩化：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质的大分子蛋白质水解为易 吸收的小分子氨基酸和蛋白质。可广泛地应用于肉制品的精加工。 4、菠萝蛋白酶在其它食品加工业中的应用，有人已经用菠萝蛋白酶 来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及 含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。其它还有生产脱水豆类、婴儿食品 和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给
操作步骤
1.选取菠萝一个榨汁，用四层纱布过滤得果汁；
2.取果汁，加5%柠檬酸钠10ml，搅拌均匀； 3.4000r/min离心7min取上清液；
4.在上清液中加0.2%的单宁30ml，边加边搅拌15min，可见澄清析出，
静置40min； 5.除去上清液，以4000r/min离心5min丢掉上清液； 6.把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中，加0.1%EDTA溶液100ml搅匀，再把 1.5%氯化钠溶液200ml倒入烧杯中搅匀，以4000r/min离心7min，倒掉 上清液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
四、菠萝蛋白酶制剂在饲料中的应用
将菠萝蛋白酶加入饲料配方或直接混合在饲料中，可以大大提高蛋白质 的利用率和转化率，并能开发更广的蛋白源，从而降低饲料成本。
提取工艺
压榨 菠萝下脚料
去杂质
加稳定剂 稳定液
加单宁 单宁沉淀物 溶液弃去
汁液 残渣 （弃去） 干燥 酶制品
澄清液
沉淀物（弃去）
洗脱 滤液
菠萝蛋白酶测定实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（5）班马俊宇201430520516摘要：本次实验通过对菠萝皮中存在的菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离；并采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量，利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后的水解产物酪氨酸，在280nm处吸光值的高低，判断酶活性的大小。
从实验结果看出，纯化程度越高，提取液中蛋白质的含量先降低，后升高。
同时，实验测得菠萝蛋白酶的比活力、回收率随纯化程度的提高而先升高后降低。
关键词：菠萝蛋白酶纯化酶活性蛋白质含量前言菠萝蛋白酶主要分布于菠萝的茎和果实中，能分解蛋白质、肽、脂和酰胺，具有较高的生物活性，在各个生产领域中得到广泛的应用[1]。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能[2]。
菠萝萝蛋白酶 p H 在 4.0~5.5处于较稳定的状态，在中性环境中酶活保持最高，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活[3]。
本实验研究粗提取、盐析和透析所得到的菠萝蛋白酶提取液中的蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等，对酶的纯化情况进行研究。
1 实验材料与仪器1．1 实验材料与试剂新鲜菠萝（3个），盐析粗提液（PBS），酪蛋白试剂，激活剂，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，乙醇1．2 实验仪器电子天平，台式天平，恒温水浴锅，冰箱，高速离心机，分光光度计，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，滤纸，试管，试管架，滴管，玻璃棒，纱布，洗耳球，标签纸，橡皮筋DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2 实验方法2．1 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min 至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的提纯
预习报告: 设计性实验——菠萝蛋白酶提取一、实验目的：（1）系统地学习和掌握蛋白质分离纯化技术的原理及实验技术。
（2）熟练掌握测定蛋白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。
二、实验原理：菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶，能分解蛋白质、酯和酞胺。
菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄色无定形粉末，分子量33000，微有异臭，微溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点9.55 。
（1）测蛋白质含量：（考马斯亮兰法）【1】考马斯亮兰是一种染料，在酸性溶液中，它能与蛋白质结合形成蛋白质一染料的兰色复合物，在595nm波长下有最大吸收值，其吸光度值与蛋白质浓度成正比。
并且在低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律，但标准曲线有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（2）测菠萝蛋白酶活性【2】酪蛋白是一种蛋白质，它被菠萝蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm 处有吸收峰，根据测定275nm 处的吸收值，可以判定菠萝蛋白酶的酶活力。
吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说菠萝蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。
（3）提纯菠萝蛋白酶（超滤浓缩法）【3】菠萝汁超滤浓缩后，在进行干燥得到酶制品。
利用分子截留原理，把大于和小于蛋白酶分子的大部分物质过滤除去，以达到浓缩酶液的目的。
此法反应条件温和，降低了酶活损失。
三、实验器材（1）实验材料：新鲜菠萝(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白（2）实验试剂：柠檬酸钠、单宁、维生素c、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化钠溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH 至7.0）、激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）（3）实验仪器：榨汁机、离心机、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）、恒温水浴锅（37℃）、试管、试管架、烧杯、容量瓶、移液管；四、操作步骤：（1）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量①标准曲线制作方法：取六支试管，标号1、2、3、4、5、6，分别加入牛血清蛋白质原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL并用蒸馏水全部稀释至1.0mL，然后分别加入5.0mL考马斯亮兰G—250试液，混和均匀，于25±1°C的恒温水浴中保温10分钟，冷却后，于595nm波长下进行测定。
菠萝蛋白酶提取
菠萝蛋白酶提取一．实验目的:1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性；2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。
二．实验原理：菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。
主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。
其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。
在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以EDTA 和L2半胱氨酸组合,效果最佳。
单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %～0. 25 %的浓度。
采用Folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。
Folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。
菠萝蛋白酶的制备试验原理
解冻 离心
3000r/min 10 min
注意事项
1.选取70％～80％成熟的新鲜菠萝 2.避免热、酸、碱、重金属盐、紫外线的影响 3.整个操作中注意温度的变化 4.常用pH试纸检测pH值的变化
思考 题
1．洗脱时如果不加入氯化钠溶液应如何继续 分离纯化菠萝蛋白酶？
生物制药技术
生物分离技术
实训五、菠萝蛋白酶的制备
21 目的要求 2 实验原理
3 材料用具 4 操作方法 5 注意事项 5
目的要求
了解单宁沉析法提取菠萝蛋白酶的原理 掌握提取菠萝蛋白酶的基本操作技术
原理
菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶 ，稍溶于水，不溶 于乙醇、丙酮、氯仿、乙醚，最适pH值为7，微有 异臭，其酶活力能被半胱氨酸激活，而受重金属 抑制
用单宁沉析法提取鲜菠萝中的菠萝蛋白酶，用乙二 胺四乙酸螯合原料中重金属离子 ，抗坏血酸则可使 酶活性中心保持还原状态 ，锌离子、硫代酸钠、 L-半胱氨酸对酶有激活作用
材料用具
鲜菠萝（1500g左右）
0.5％、0.1％EDTA-Na（二乙胺四乙酸钠） 0.5％乙酸锌溶液 0.06％、0.1％抗坏血酸溶液 1％单宁（别名鞣酸） 1.5％氯化钠溶液 0.5％硫代硫酸钠溶液； 1％L-半胱氨酸溶液。其配制方法是：①称取L半胱氨酸0.1g，加水10ml，加1mol／L盐酸溶液 6～8滴使之溶解；②用6mol／L的氢氧化钠溶液 中和至pH3～4。
3.洗脱
加 0.06％ 抗 坏 血 酸
30ml
操作方法
加0.5％硫代硫酸钠20 ml 沉淀物
菠萝 蛋白 酶沉 淀
离心 3500r/min 10 min
4.激活
搅拌 静置 5min
搅拌 静置 10min
菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取纯化方法2、了解菠萝蛋白酶的活力测定方法3、了解化学修饰的方法并探究对其活力的影响。
4、探究菠萝蛋白酶的稳定性二、实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质, 广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中, 分子量为33 000, 能分解蛋白质和酰胺等。
它的水解活性较木瓜酶高10 倍以上。
因此有广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于胶、水解蛋白的生产, 在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症, 它能迅速溶痂。
对正常组织无害, 不影响植皮, 适用于中小面积深度烧伤的治疗。
•菠萝蛋白酶的理化条性质•最佳温度：53±1℃•失活温度：≥65℃•最佳PH值： 5.0～8.0•失活PH值：小于3.0和大与9.5•推荐用量:0.05～0.1%对蛋白质计•温度范围：50～60℃作用PH值: 6.0～9.0提取菠萝蛋白酶的传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。
高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。
超滤法使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。
本实验采用单宁沉淀法提取菠萝蛋白酶。
活性测定方法是以酪蛋白水解释放的氨基酸在275nm的吸收值为基础。
酶活单位定义为在37℃，pH7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸的微克数为一个菠萝蛋白酶单位。
pH 值对酶活力有很大的影响,大多数的酶在酸性条件下活力最强,最适合菠萝蛋白酶的pH 为7. 4 ,在碱性条件下就会失活,在操作过程中应注意pH 值的变化。
实验材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CMSepharose FF 凝胶（1.1cm×30.0cm）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH计、搅拌棒3、试剂：0.2%单宁、5 %苯甲酸钠溶液、0. 1 %/0.5%EDTA 溶液、1. 5%氯化钠溶液、0. 5%乙酸锌溶液、0.06 %抗坏血酸溶液、0. 5%硫代硫酸钠、1 %L - 半胱氨酸溶液、20mM pH4.0 的醋酸缓冲液、1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）、双缩脲试剂、pH7.0 的干酪素溶液、酶液激活液（pH4.5 ，L-cys 和EDTA-2Na 配制）、三氯乙酸溶液、标准酪蛋白试剂、0.1M盐酸、0.1M氢氧化钠、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖、50%甘油、O．1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 3．0)、NEM1、实验材料新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白2、实验试剂①柠檬酸钠②维生素C ③单宁④0.1%EDTA溶液⑤1.5%氯化钠溶液⑥1%酪蛋白溶液⑦1mol/L氢氧化钠溶液⑧0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0）⑨激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA-2Na,现配现用）1、榨汁机；2、离心机；3、紫外可见分光光度计（1cm石英比色皿）；4、恒温水浴锅（37℃）；5、试管、试管架；6、烧杯、容量瓶；7、移液管；三、实验步骤1、菠萝蛋白酶的提取提取：菠萝洗净榨汁。
食品酶学实验-菠萝蛋白酶
食品酶学综合性实验实验1 菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定【目的和要求】1. 了解酶分离纯化的一般程序；2. 掌握硫酸铵沉淀法、透析法分离提取菠萝蛋白酶的基本原理和方法；3. 熟悉蛋白质含量测定、菠萝蛋白酶活力测定等实验原理和方法。
【实验原理】1.建立有效的酶纯化程序应考虑的原则（1）利用酶在分离纯化上最有利的特性；（2）尽早使用一种选择性好的方法；（3）选择交换能力高的层析技术作为第一步层析；（4）不要连续使用相同的纯化方法；（5）将各层析步骤连接起来，使前一步得到的样品适用于下一步层析；（6）在造成酶被稀释的步骤后来要用浓缩酶的方法；（7）要使每步过程的分辨能力呈递增趋势；（8）每步纯化过程后，通过量体积，酶活力和蛋白质浓度测定，监测纯化的进程。
2.菠萝蛋白酶简介菠萝蛋白酶（Bromelain，EC 3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症。
1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
菠萝蛋白酶的相对分子质量大约为33 000DW，等电点9.55，最适pH在7.1左右，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活。
菠萝蛋白酶的温度的最稳定范围是55℃~65℃。
金属盐离子中NaCl、KCl对酶活的影响不是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，，EDTA能通过螯合对酶活有影响的金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。
3.菠萝蛋白酶的粗分离（1）盐析分离盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。
菠萝蛋白酶的提取纯化工艺研究
菠萝蛋白酶的提取纯化工艺研究梁 雪，方欢乐，刘建利（西安培华学院 医学院，陕西西安 710199）摘 要：为降低环境污染，提高菠萝蛋白酶的附加值以及延长菠萝的产业链，以菠萝废弃物为原料，采用盐析浓缩-透析提纯-乙醇有机溶剂沉淀相结合的方法提取菠萝蛋白酶。
实验考察料液比、缓冲液温度、搅拌时间、缓冲液pH值、盐析浓度以及透析时间对菠萝蛋白酶酶活性和酶活回收率的影响。
结果表明，菠萝蛋白酶的最佳工艺条件为料液比1.0∶1.5（m∶v）、缓冲液温度30 ℃、搅拌时间40 min、缓冲液pH值7、盐析浓度30%和透析时间28 h，该条件下菠萝蛋白酶酶活回收率为68.45%。
关键词：菠萝蛋白酶；盐析法；透析提纯；有机溶剂沉淀Study on Extraction and Purification of BromelainLIANG Xue, FANG Huanle, LIU Jianli(Medical College, Xi’an Peihua University, Xi’an 710199, China)Abstract: In order to reduce environmental pollution, increase the added value of bromelain, and extend the industrial chain of pineapple, a method combining salt precipitation concentration dialysis purification ethanol organic solvent precipitation was used to extract bromelain from pineapple waste as raw material. The experiment investigated the effects of material liquid ratio, buffer temperature, stirring time, buffer pH value, salting out concentration, and dialysis time on bromelain enzyme activity and enzyme recovery rate. The results showed that the optimal process conditions for bromelain were material to liquid ratio of 1.0∶1.5（m∶v）, buffer temperature of 30 ℃, stirring time of 40 minutes, buffer pH of 7.0, salt out concentration of 30%, and dialysis time of 28 hours. Under these conditions, the recovery rate of bromelain enzyme activity was 68.45%.Keywords: bromelain; salting out; dialysis purification; organic solvent precipitation菠萝蛋白酶为白色至淡棕黄色无定形粉末，是我国目前大规模生产的植物蛋白酶之一[1]。
菠萝中提取蛋白酶
注意事项
菠萝蛋白酶易受热失活，应低温短时生产， 一般在0℃左右进行。 某些化学药品和金属离子易引起菠萝蛋白酶 失活，生产过程忌碱、忌强酸作用，勿与铁、 铜等重金属接触。 菠萝蛋白酶是一种胶体，生产过程中易产生 气泡造成损失，所以生产过程应注意操作。
THE END 谢谢欣赏！
准备知识
菠萝茎和菠萝皮的含水量都达到85％以上， 但菠萝茎的榨汁率比菠萝皮的榨汁率低。菠萝皮 和菠萝茎中的糖分含量占总干重的80％左右，其 中菠萝茎中淀粉占总糖份量的一半。离心可以有 效去除榨汁中的不溶物质及菠萝茎中的淀粉，能 部分去除果胶，对一些大分子悬浮物质去除困难。
背景知识
菠萝蛋白酶在避光、低温条件下贮藏的酶活 力损失最小。在55℃时具有最高的蛋白酶活 性，40℃以上条件下酶活半衰期在2h以内， 其热变性温度在55℃和60℃之间。 金属离子对菠萝蛋白酶的酶活力具有影响， Ca2+引起的酶的失活速度最快；Fe2+和Cu2+对 酶活力影响最大。
结果讨论
3、菠萝蛋白酶对热不稳定，试验中温度的控制是否 、菠萝蛋白酶对热不稳定， 合理； 合理； 4、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足， 、在活力测定的步骤中所加入的酪蛋白的量不足， 导致结果偏低； 导致结果偏低；
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的含量测定
4、消炎作用
菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿(包括血栓静脉炎、 骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤)，菠萝蛋白酶具 有激活炎症反应的潜力。菠萝蛋白酶还可治疗腹泻。
5、增进药物吸收 将菠萝蛋白酶与各种抗生素(如四环素, 阿莫西林等)联用, 能提高其疗效。 相关研究表明, 它能促进抗生素在感染部位的传输, 从而减少抗生素的用
含量的测定 0.1M的牛血清蛋白
浓度mg/ml
标准蛋白（ml） 磷酸缓冲液（ml） 考马斯亮蓝（ml） 测A595
0 0.002 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02
待测液
1
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1 4
0.9 4
0.8 4
0.6 4
0.4 4
0.2 4
0 4
0 4
实验结果记录
操作步骤
1.选取菠萝一个榨汁，用四层纱布过滤得果汁；
2.取果汁，加5%柠檬酸钠10ml，搅拌均匀； 3.4000r/min离心7min取上清液；
4.在上清液中加0.2%的单宁30ml，边加边搅拌15min，可见澄清析出，
静置40min； 5.除去上清液，以4000r/min离心5min丢掉上清液； 6.把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中，加0.1%EDTA溶液100ml搅匀，再把 1.5%氯化钠溶液200ml倒入烧杯中搅匀，以4000r/min离心7min，倒掉 上清液，得到洗涤剂I酶复合沉淀物。
1.菠萝的质量： 2.所得沉淀的质量：
3.上清液在275nm波长OD值：
4.待测液在595nm波长下吸光度：
实验结果记录
浓度mg/ml 0 0.002 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 待测液
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菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2．2盐析根据附录的“硫酸铵饱和度计算表”，按30%硫酸铵饱和度计算在上述酶提取液中需添加的固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末，慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为30%，放置于冰水混合物（4℃）30min后，酶蛋白沉淀析出，4°C3000rpm离心6min，收集沉淀，加入0.1mo1/L pH7.8PBS约15mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量和酶活性。
2．3透析将溶解液装入2.5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30min）中，于500mL烧杯中，在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15min换水一次，换水3～4次后，检查SO42-是否已被除净（检查的方法是：取2mLBaCl2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO42-未除净，若无沉淀出现，表示透析完全）。
若透析液有沉淀，将透析液用滤纸过滤，测定过滤液的体积、蛋白质含量和酶活性。
2．4酶活力测定方法取4支试管，设置1支为实验对照，3支为平行样品。
取0.1mL 酶液，加入0.9mL 激活剂，37℃预热10min ，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液1mL ，准确反应10min ，加入10%三氯乙酸3mL 反应终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。
离心（3000r/min ，5min ）或过滤，清液于280nm 波长下测定光吸收值。
酶活单位定义：在上述条件下，每10min 增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U ）。
2.5蛋白质含量测定方法2.5.1标准曲线的绘制0~1000μg/mL 标准曲线的绘制：另取6支试管编号，按下表加入试剂。
管号1234561000μg/mL 牛血清白蛋白（mL ）蒸馏水（mL ）蛋白质浓度（μg/mL ）01.000.20.82000.40.64000.60.8 1.00.40.206008001000得到从1到6号管的牛血清白蛋白溶液浓度分别为0、200、400、600、800、1000μg/mL ，准确吸取各管溶液0.lmL ，加入5ml 考马斯亮蓝溶液，摇匀，静置2min ，测定595nm 吸光值，绘制0-1000μg/mL 标准曲线。
2.5.2样品的测定准确吸取样品溶液0.1mL 放入具塞刻度试管中，与步骤（1）操作相同，测得样品的光吸收值A595nm 。
3实验结果与分析3．1蛋白质含量计算由标准曲线可查出相应的蛋白浓度（μg/mL ），可按如下公式计算出样品中蛋白含量。
样品蛋白含量(μg/g 鲜重)＝────────────────────────────────────────3．2酶活力计算酶液活力（U/mL ）=×稀释倍数A 280nm0.001×0.1查出的蛋白提取液浓度（μg/mL）×定容体积(mL)样品重量(g)3．3酶比活的计算酶比活（U/mg·蛋白）=酶活力/酶蛋白质含量3．4酶纯化过程中回收率计算回收率（%）=（纯化酶总活力/粗酶液总活力）×100=〔（纯化酶活力×纯化酶液体积）/（粗酶活力×粗酶体积）〕×100 3．5酶纯化倍数的计算纯化倍数=纯化酶比活力/粗酶比活力3．6实验结果3.6.1蛋白质含量样品蛋白含量=758.2309μg/g（鲜重）3.6.2酶活力3.6.3酶比活3.6.4酶纯化回收率盐析回收率=40.53%；透析回收率=45.43%3.6.5酶纯化倍数盐析纯化倍数=3.022；透析纯化倍数=2.714菠萝蛋白酶分离纯化表4实验结论与讨论粗酶盐析和透析三个步骤中的蛋白质浓度来看，粗酶中的蛋白质浓度要低于盐析和透析后的酶液处理过的蛋白质浓度，但是蛋白质含量是粗酶最高，证明了实验步骤确实有效地提取出了菠萝蛋白酶。
但是盐析的蛋白质含量计算值比透析的少，原因可能是盐析出来的沉淀溶解的过程中沉淀不能完全溶解导致溶液中蛋白质较透析液少。
盐析和透析后的酶活力比粗酶的高。
在温度在大于50℃后,40min 后，菠萝果浸提液中菠萝蛋白酶的活性将明显损失[1]，可能因为酶浓度的不同，导致加热步骤总体积（mL）总蛋白质含量（mg）总活力（U）比活力（U/mg·蛋白）回收率（%）纯化倍数粗提取58.322.759.231*10^54.058*10^4——盐析16.410.84 3.741*10^53.450*10^440.53%0.8501透析19.811.214.194*10^5 3.741*10^445.43%0.9217速度不一致，因而盐析和透析的酶活力会比较高。
在实验范围内，Fe3+、Fe2+、Cu2+存在对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响较大,可能是与它们具有氧化还原性性有关[2]，所以在盐析之前，受金属离子影响，粗酶的酶活力和酶比活会较盐析和透析之后的酶活力和酶比活低。
但是实验结果发现粗酶的酶比活非常高，与理论应该出现的梯次上升不符，分析应该是粗酶活力测定的时候粗酶放置的时间比较久，影响了酶活性，第二个原因可能是底物浓度不足，盐析和透析步骤中的酶将底物分解完全，而粗酶因为酶含量较低并不能完全分解，导致计算的时候盐析和透析酶活力偏低，同时TCA的添加顺序也有一定影响。
硫酸铵固体加入法却不能保证所加入的2.43g固体硫酸铵全部溶解完全，结果得到的菠萝蛋白酶沉淀中就很有可能含有未溶掉的硫酸铵盐成分，从而使得沉淀的质量有所增加，而溶液加入法则是在先前完全溶解后再移取到菠萝汁里的，得到的菠萝蛋白酶中不会有未溶解的硫酸铵盐颗粒存在；再有，硫酸铵固体加入法不如其溶液加入法温和，固体加入法容易造成菠萝皮浸提液中局部硫酸铵盐浓度过高而导致部分菠萝蛋白酶失活，从而导致酶活回收率降低[3]。
在加入硫酸铵的时候使部分菠萝蛋白酶失活，导致回收率降低。
盐析的纯化倍数要比透析的纯化倍数高，因为盐析后的酶浓度会比透析的酶浓度高，所以就单位酶活力来说，盐析的比活会比透析的高，所以算盐析的纯化倍数会高。
思考题：1.酶的失活原因主要是金属离子的结合，高温，有机溶剂等逆环境的抑制，所以分离纯化的时候要注意不能用不洁净的仪器（盛装过PBS）来盛装酶液，不能靠近万用炉，不能用自来水作为透析液。
2.U/mL酶液：表示每单位体积样液中酶活力的情况，适用于表示液体酶中的酶活大小。
U/mg蛋白质：表示每单位质量样品中酶活力的情况，适用于含一种或多种蛋白质的样品中的酶活大小。
U/g鲜重或干重：表示每g原始样品中的酶活力的情况，适用于原始样品的酶活力表示。
U/g酶粉：表示每g酶粉中的酶活力情况，适用于酶制剂的酶活力测定或者酶制剂的相应浓度配制。
3.盐析法，有机溶剂法，重金属法，生物碱法，其中盐析法可逆，重金属法有机溶剂法、和生物碱法不可逆[4]。
4.随着硫酸铵浓度的逐渐增大，盐析得到的菠萝蛋白酶的酶活回收率逐渐增大，当硫酸铵的饱和度达到40%的时侯菠萝蛋白酶的酶活回收率最大，为83. 6%，往后开始逐渐减小，这与易元龙文献中报道中的相一致，当硫酸铵的饱和度越大时，菠萝皮浸提液的盐析效果越好[5]，所以取30%左右的最好。
参考文献[1]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4[2]易元龙,李媚,谢涛,蓝丽红,廖安平,广西民族大学学报,2008,12，Vol.14，No.4[3]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月[4]田亚平，]生化分离原理与技术，化学工业出版社，2010[5][3]梁宏宇，菠萝蛋白酶提取方法的研究，2012年4月附菠萝蛋白酶实验原始数据粗液59.0mL离心液58.3ml盐析液57.3ml+10.08g硫酸铵透析前离心沉淀溶解16.4ml透析液19.8ml蛋白质吸光值粗酶0.315盐析0.505透析0.440吸光值粗酶盐析透析对照0.5430.3780.389 1号 1.983 2.781 2.543 2号 2.230 2.730 2.589 3号 2.166 2.466 2.389。